İki Boyutlu Jel Elektroforezi

İki boyutlu veya 2D jel elektroforezi, binlerce proteini tek bir karışımdan ayırabilen iki farklı ayırma yöntemi kullanan bir tekniktir. Tekniklerden biri olan SDS-PAGE veya sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi, karmaşık karışımları tek başına tam olarak ayıramaz. 2D jel elektroforezi, SDS-PAGE'i, izoelektrik noktalara göre ayrılan ve bir hücre lizatındaki potansiyel olarak tüm proteinlerin çözünürlüğüne izin veren ikinci bir yönteme, izoelektrik odaklama veya IEF'ye bağlar. Bu video, genel bir prosedür olan 2D jel elektroforezinin ilkelerini ve bazı biyomedikal uygulamalarını gösterecektir.

2D jel elektroforezi, ilk boyut olarak IEF ile başlar. Her proteinin, net yükün sıfır olduğu izoelektrik nokta veya pI adı verilen bir pH değeri vardır. Bir protein bir elektrik alanına maruz kaldığında, zıt yüklü elektroda doğru hareket edecektir. İlgilenilen numuneler, hem asidik hem de bazik gruplar içeren moleküller olan gömülü amfolitlere sahip hareketsizleştirilmiş pH gradyanı veya IPG şeritlerine yüklenir. Daha sonra pH gradyan şeridine bir elektrik alanı uygulanır ve proteinlerin pI'lerine uyan pH değerine ulaşana kadar göç etmelerine ve burada net yüklerini kaybetmelerine neden olur.

İkinci boyutu çalıştırmadan önce, gömülü proteinler SDS ile muamele edilir, denatüre edilir ve düzgün bir negatif yük sağlanır. Tamamlandıktan sonra, IPG şeritleri bir poliakrilamid jel üzerine yerleştirilir. Uygulanan bir elektrik alanı, proteinleri anoda doğru çeker ve daha büyük proteinler jel boyunca daha yavaş hareket eder.

Protein karışımı pI ve moleküler ağırlığa göre ayrıldıktan sonra, proteom haritası lekeler kullanılarak görselleştirilir ve ilgilenilen proteinler tanımlanır.

Şimdi 2D jel elektroforezinin ilkelerini tartıştığımıza göre, tipik bir laboratuvar prosedürünün üzerinden geçelim.

Deney yapılmadan önce, proteinlerin ortama çözündürülmesi gerekir. Numunenin çözündürülmesi, proteinlerin hidrojen bağ etkileşimlerini bozmak için kaotropik ajanlar, proteinlerin yükünün değişmesini önlemek için iyonik olmayan deterjanlar, disülfid bağlarını kırmak için indirgeyici ajanlar ve tamponların bir kombinasyonu ile proteinlerin ayrıştırılmasıyla elde edilir. Enterferans yapan bol proteinleri ve diğer molekülleri uzaklaştırmak için, malzeme santrifüjleme ve elde edilen peletin toplanması ile sırayla ekstrakte edilir; ardından deneye müdahale edecek herhangi bir DNA'yı tüketmek için kullanılan bir enzim olan endonükleaz ile tedavi edilir.

Proteinler çözündürüldükten sonra, IPG şeritleri bir şerit temizleme solüsyonu ile durulanarak hazırlanır ve kuruması için baş aşağı bırakılır. Daha sonra her şeride bir şerit tutucu numarası atanır. Hazır olduğunda, hücresel ekstrakt, negatiften pozitif uca doğru yavaş, kayma hareketiyle şeritlere yüklenir. Rehidrasyon amacıyla, elektrotun üstüne ve jel şeritlerin altına nemli kurutma kağıdı yerleştirilir; IPG şeritleri daha sonra IEF cihazının üzerine astarlanır. Yüksek bir elektrik akımı uygulanır ve proteinler göç etmeye başlar.

İlk boyutun tamamlanmasını takiben, SDS-PAGE için jel bir döküm aparatında hazırlanır. IPG şeritleri, SDS içeren dengeleme tamponuna yüzleri aşağı bakacak şekilde yerleştirilerek işlenir. Elektroforez ünitesi, elektroforez tamponu ilavesi ile hazırlanır. İşlem görmüş IPG şeritleri cımbız kullanılarak toplanır, jel plakaların üzerine yerleştirilir ve agaroz sızdırmazlık solüsyonu ile kapatılır. Bir voltaj kaynağı daha sonra en hızlı hareket eden proteinler jelin dibinden 1 cm uzakta olana kadar tutulan bir elektrik alanı uygular.

Elektroforezin tamamlanmasından sonra, proteinler görselleştirilmelidir. Geleneksel olarak bu, Coomassie mavisi veya gümüş nitrat ile boyanarak gerçekleştirilir. İlgilenilen proteinler jelden aktarılabilir ve Western blot analizi ile analiz edilebilir.

İkinci bir tanımlama yaklaşımı, proteinlerin jelden çıkarılmasını, sindirilmesini ve kütle spektrometresi ile analiz edilmesini içerir.

Artık bir prosedürü gözden geçirdiğimize göre, 2D jel elektroforezinin bazı kullanımlarına bakalım.

Bu tekniğin en yaygın kullanımlarından biri, hastalığın başlaması ve ilerlemesinde rol oynayan moleküllerin tanımlanmasıdır. Kütle spektrometresi ile birleştirilmiş 2D jel elektroforezi, hastalıklı bölgelerdeki spesifik proteinlerin sağlıklı olanlara kıyasla yukarı veya aşağı regülasyonunu tespit edebilir.

Ek olarak, 2D jel elektroforezi, hastaların potansiyel bir terapötik ilaca yanıtının ilerlemesini takip etmede yararlıdır. Tedavinin uygulanmasını takiben çeşitli zaman noktalarında hastalardan örnekler alınabilir. Bu şekilde, Western blot veya kütle spektrometresi analizi ile birleştirilmiş 2D jel elektroforezi, iltihaplanma gibi negatif tepkilerle ilişkili proteinleri tespit edebilir; veya hafifletilmiş bir durumda proteinlerin yokluğu.

2D jel elektroforezinin başka bir kullanımı, mRNA'dan translasyonlarını takiben proteinlere yapılan eklemeler olan posttranslasyonel modifikasyonu veya PTM'yi takiben protein yapısı ve fonksiyonunun incelenmesidir. PTM'ler, protein sinyali, gen ekspresyonu dahil olmak üzere çeşitli işlevleri düzenleyebilir veya oksidatif hasara neden olabilir. 2D jel elektroforezi, metilasyon veya asetilasyon gibi modifikasyonlara karşı hassastır, bu da molekül ağırlığının yanı sıra pI'de de bir kaymaya neden olabilir.

Az önce JoVE'nin 2D jel elektroforezi ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, tekniğin ilkelerini, tipik bir deneysel prosedürü ve biyotıp alanındaki çeşitli uygulamalarını açıkladı.

İzlediğiniz için teşekkürler!