İki Boyutlu Jel Elektroforezi
İki boyutlu jel elektroforezi (2DGE), bir karışımdan binlerce biyomolekülü çözebilen bir tekniktir. Bu teknik, birbirine bağlanmış iki farklı ayırma y…
İki boyutlu jel elektroforezi (2DGE), bir karışımdan binlerce biyomolekülü çözebilen bir tekniktir. Bu teknik, birbirine bağlanmış iki farklı ayırma yöntemini içerir: izoelektrik odaklama (IEF) ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE). Bu, bir jelin iki ekseni boyunca bileşikleri izoelektrik noktaları (elektrokimyasal bir özellik) ve moleküler ağırlıkları ile fiziksel olarak ayırır.
Bu videodaki prosedür, 2DGE'nin ana kavramlarını ve karmaşık bir protein çözeltisinin bileşimini karakterize etmek için genel bir prosedürü kapsar. Uygulamalar bölümünde, hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi için biyobelirteç tespiti, hastalarda tedavinin izlenmesi ve posttranslasyonel modifikasyonu (PTM) takiben proteinlerin incelenmesi dahil olmak üzere bu tekniğin üç örneği gösterilmektedir.
İki boyutlu veya 2D jel elektroforezi, binlerce proteini tek bir karışımdan ayırabilen iki farklı ayırma yöntemi kullanan bir tekniktir. Tekniklerden biri olan SDS-PAGE veya sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi, karmaşık karışımları tek başına tam olarak ayıramaz. 2D jel elektroforezi, SDS-PAGE'i, izoelektrik noktalara göre ayrılan ve bir hücre lizatındaki potansiyel olarak tüm proteinlerin çözünürlüğüne izin veren ikinci bir yönteme, izoelektrik odaklama veya IEF'ye bağlar. Bu video, genel bir prosedür olan 2D jel elektroforezinin ilkelerini ve bazı biyomedikal uygulamalarını gösterecektir.
2D jel elektroforezi, ilk boyut olarak IEF ile başlar. Her proteinin, net yükün sıfır olduğu izoelektrik nokta veya pI adı verilen bir pH değeri vardır. Bir protein bir elektrik alanına maruz kaldığında, zıt yüklü elektroda doğru hareket edecektir. İlgilenilen numuneler, hem asidik hem de bazik gruplar içeren moleküller olan gömülü amfolitlere sahip hareketsizleştirilmiş pH gradyanı veya IPG şeritlerine yüklenir. Daha sonra pH gradyan şeridine bir elektrik alanı uygulanır ve proteinlerin pI'lerine uyan pH değerine ulaşana kadar göç etmelerine ve burada net yüklerini kaybetmelerine neden olur.
İkinci boyutu çalıştırmadan önce, gömülü proteinler SDS ile muamele edilir, denatüre edilir ve düzgün bir negatif yük sağlanır. Tamamlandıktan sonra, IPG şeritleri bir poliakrilamid jel üzerine yerleştirilir. Uygulanan bir elektrik alanı, proteinleri anoda doğru çeker ve daha büyük proteinler jel boyunca daha yavaş hareket eder.
Protein karışımı pI ve moleküler ağırlığa göre ayrıldıktan sonra, proteom haritası lekeler kullanılarak görselleştirilir ve ilgilenilen proteinler tanımlanır.
Şimdi 2D jel elektroforezinin ilkelerini tartıştığımıza göre, tipik bir laboratuvar prosedürünün üzerinden geçelim.
Deney yapılmadan önce, proteinlerin ortama çözündürülmesi gerekir. Numunenin çözündürülmesi, proteinlerin hidrojen bağ etkileşimlerini bozmak için kaotropik ajanlar, proteinlerin yükünün değişmesini önlemek için iyonik olmayan deterjanlar, disülfid bağlarını kırmak için indirgeyici ajanlar ve tamponların bir kombinasyonu ile proteinlerin ayrıştırılmasıyla elde edilir. Enterferans yapan bol proteinleri ve diğer molekülleri uzaklaştırmak için, malzeme santrifüjleme ve elde edilen peletin toplanması ile sırayla ekstrakte edilir; ardından deneye müdahale edecek herhangi bir DNA'yı tüketmek için kullanılan bir enzim olan endonükleaz ile tedavi edilir.
Proteinler çözündürüldükten sonra, IPG şeritleri bir şerit temizleme solüsyonu ile durulanarak hazırlanır ve kuruması için baş aşağı bırakılır. Daha sonra her şeride bir şerit tutucu numarası atanır. Hazır olduğunda, hücresel ekstrakt, negatiften pozitif uca doğru yavaş, kayma hareketiyle şeritlere yüklenir. Rehidrasyon amacıyla, elektrotun üstüne ve jel şeritlerin altına nemli kurutma kağıdı yerleştirilir; IPG şeritleri daha sonra IEF cihazının üzerine astarlanır. Yüksek bir elektrik akımı uygulanır ve proteinler göç etmeye başlar.
İlk boyutun tamamlanmasını takiben, SDS-PAGE için jel bir döküm aparatında hazırlanır. IPG şeritleri, SDS içeren dengeleme tamponuna yüzleri aşağı bakacak şekilde yerleştirilerek işlenir. Elektroforez ünitesi, elektroforez tamponu ilavesi ile hazırlanır. İşlem görmüş IPG şeritleri cımbız kullanılarak toplanır, jel plakaların üzerine yerleştirilir ve agaroz sızdırmazlık solüsyonu ile kapatılır. Bir voltaj kaynağı daha sonra en hızlı hareket eden proteinler jelin dibinden 1 cm uzakta olana kadar tutulan bir elektrik alanı uygular.
Elektroforezin tamamlanmasından sonra, proteinler görselleştirilmelidir. Geleneksel olarak bu, Coomassie mavisi veya gümüş nitrat ile boyanarak gerçekleştirilir. İlgilenilen proteinler jelden aktarılabilir ve Western blot analizi ile analiz edilebilir.
İkinci bir tanımlama yaklaşımı, proteinlerin jelden çıkarılmasını, sindirilmesini ve kütle spektrometresi ile analiz edilmesini içerir.
Artık bir prosedürü gözden geçirdiğimize göre, 2D jel elektroforezinin bazı kullanımlarına bakalım.
Bu tekniğin en yaygın kullanımlarından biri, hastalığın başlaması ve ilerlemesinde rol oynayan moleküllerin tanımlanmasıdır. Kütle spektrometresi ile birleştirilmiş 2D jel elektroforezi, hastalıklı bölgelerdeki spesifik proteinlerin sağlıklı olanlara kıyasla yukarı veya aşağı regülasyonunu tespit edebilir.
Ek olarak, 2D jel elektroforezi, hastaların potansiyel bir terapötik ilaca yanıtının ilerlemesini takip etmede yararlıdır. Tedavinin uygulanmasını takiben çeşitli zaman noktalarında hastalardan örnekler alınabilir. Bu şekilde, Western blot veya kütle spektrometresi analizi ile birleştirilmiş 2D jel elektroforezi, iltihaplanma gibi negatif tepkilerle ilişkili proteinleri tespit edebilir; veya hafifletilmiş bir durumda proteinlerin yokluğu.
2D jel elektroforezinin başka bir kullanımı, mRNA'dan translasyonlarını takiben proteinlere yapılan eklemeler olan posttranslasyonel modifikasyonu veya PTM'yi takiben protein yapısı ve fonksiyonunun incelenmesidir. PTM'ler, protein sinyali, gen ekspresyonu dahil olmak üzere çeşitli işlevleri düzenleyebilir veya oksidatif hasara neden olabilir. 2D jel elektroforezi, metilasyon veya asetilasyon gibi modifikasyonlara karşı hassastır, bu da molekül ağırlığının yanı sıra pI'de de bir kaymaya neden olabilir.
Az önce JoVE'nin 2D jel elektroforezi ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, tekniğin ilkelerini, tipik bir deneysel prosedürü ve biyotıp alanındaki çeşitli uygulamalarını açıkladı.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two separation methods used in 2D gel electrophoresis?
Two-dimensional gel electrophoresis couples isoelectric focusing (IEF) with SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). IEF separates proteins in the first dimension based on their isoelectric points, where each protein has a specific pH value with zero net charge. SDS-PAGE then separates proteins in the second dimension by molecular weight, allowing resolution of thousands of proteins from a single mixture.
Q2: How does isoelectric focusing separate proteins in the first dimension?
In isoelectric focusing, proteins are loaded onto immobilized pH gradient (IPG) strips containing ampholytes, molecules with both acidic and basic groups. An electric field is applied, causing proteins to migrate until they reach the pH matching their isoelectric point (pI), where their net charge becomes zero and they stop moving. This precise separation by charge allows proteins with different pI values to be resolved.
Q3: Why is sample solubilization necessary before 2D gel electrophoresis?
Sample solubilization de-aggregates proteins using chaotropic agents to disrupt hydrogen bonds, nonionic detergents to preserve protein charge, and reducing agents to break disulfide bonds. This preparation also includes treatment with endonuclease to remove interfering DNA. Proper solubilization ensures proteins are fully dispersed and ready for separation without interference from other cellular components.
Q4: What happens to proteins during the SDS-PAGE second dimension?
After IEF, IPG strips are treated with SDS-containing equilibration buffer, which denatures proteins and provides them with a uniform negative charge. The strips are then placed on polyacrylamide gels, and an electric field draws proteins toward the anode. Larger proteins move more slowly through the gel matrix, allowing separation by molecular weight and creating a two-dimensional separation pattern.
Q5: How are proteins visualized and identified after 2D gel electrophoresis?
After electrophoresis, proteins are visualized using stains such as Coomassie blue or silver nitrate, creating a proteome map. Proteins of interest can then be identified through Western blot analysis or by excision from the gel, digestion, and analysis by tandem mass spectrometry principle instrumentation uses to determine protein identity and modifications.
Q6: What biomedical applications does 2D gel electrophoresis have?
2D gel electrophoresis is used to identify molecules involved in disease initiation and progression by detecting protein up- or down-regulation in diseased versus healthy areas. It also monitors patient response to therapeutic drugs by detecting inflammation-associated proteins or their absence in treated states. Additionally, it studies protein structure and function following posttranslational modifications like methylation or acetylation, which shift isoelectric point and molecular weight.
Q7: Why can't SDS-PAGE alone fully separate complex protein mixtures?
SDS-PAGE separates proteins only by molecular weight, which means proteins of similar size but different charges cannot be distinguished. Many complex mixtures contain numerous proteins with overlapping molecular weights, making complete separation impossible with a single dimension. Coupling SDS-PAGE with isoelectric focusing in 2D gel electrophoresis adds a second separation axis based on charge, enabling resolution of potentially all proteins in a cell lysate.