Protein kristalizasyonu, biyomoleküllerden oluşan katı bir kafes elde edilmesi, protein yapısını aydınlatır ve protein fonksiyonunun incelenmesini sağlar. Kristalizasyon, saflaştırılmış proteinin pH, sıcaklık, iyonik kuvvet ve protein konsantrasyonu dahil olmak üzere birçok faktörün bir kombinasyonu altında kurutulmasını içerir. Kristaller elde edildikten sonra, protein yapısı, x-ışını kırınımı ve bir elektron yoğunluğu modelinin hesaplanması ile açıklanabilir.
Bu video protein kristalizasyonunu tanıtır ve genel bir prosedürü gösterir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, kristalizasyon ve x-ışını kırınımı prosedürde ele alınmaktadır. Protein kristalizasyonu uygulamaları arasında in silico ilaç tasarımı, bağlanma yeri belirleme ve membran protein yapısı analizi yer alır.
Protein kristalizasyonu, biyomoleküllerden oluşan katı bir kafes elde edilmesi, protein yapısını aydınlatır ve protein fonksiyonunun incelenmesini sağlar. Kristalizasyon, saflaştırılmış proteinin pH, sıcaklık, iyonik kuvvet ve protein konsantrasyonu dahil olmak üzere birçok faktörün bir kombinasyonu altında kurutulmasını içerir. Kristaller elde edildikten sonra, protein yapısı, x-ışını kırınımı ve bir elektron yoğunluğu modelinin hesaplanması ile açıklanabilir.
Bu video protein kristalizasyonunu tanıtır ve genel bir prosedürü gösterir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, kristalizasyon ve x-ışını kırınımı prosedürde ele alınmaktadır. Protein kristalizasyonu uygulamaları arasında in silico ilaç tasarımı, bağlanma yeri belirleme ve membran protein yapısı analizi yer alır.
Protein kristalizasyonu, bir proteinin kafesli katı bir formunun elde edilmesi işlemidir. Bu kristaller, protein fonksiyonunun incelenmesine yardımcı olan yapısal biyologlar için özellikle değerlidir. Kütle spesifikasyonu veya SDS-PAGE gibi diğer teknikler, yalnızca proteinlerin tek boyutlu yapısı hakkında bilgi sağlayabilir. Protein kristalizasyonu, rekombinant protein ekspresyonu ve x-ışını kırınımı teknikleri ile tamamlanır. Bu video, protein kristalizasyonunun ilkelerini, genel bir laboratuvar prosedürünü ve biyokimyasal alandaki çeşitli uygulamalarını gösterecektir.
İşlemde gerekli olan ilk adım, tipik olarak rekombinant protein ekspresyonu kullanılarak miligram miktarlarda çok saf protein elde etmektir. İlgilenilen proteine karşılık gelen gen, bir ekspresyon vektörüne klonlanır ve eksprese edilen protein, afinite kromatografisi ile saflaştırmaya yardımcı olmak için poli-histidin gibi bir afinite etiketine kaynaştırılır. Daha fazla bilgi edinmek için bu koleksiyonun afinite kromatografisi hakkındaki videosuna bakın.
Saflaştırılmış proteinin kristaller halinde oluşumu, pH, iyonik kuvvet, çökeltici ve protein konsantrasyonları, sıcaklık ve denge hızı dahil olmak üzere birçok faktörün uygun kombinasyonuna bağlıdır. Kullanılan en yaygın yöntem, iki kategorisi olan buhar difüzyonudur: asılı damla ve oturan damla. Su moleküllerini bağlayan, protein için su mevcudiyetini azaltan ve daha yüksek protein konsantrasyonunu taklit eden iyonik bir katı olan saf protein, tampon ve çökeltici içeren bir damlacık, aynı tampon ve çökelticinin daha yüksek konsantrasyonlu bir karışımına sahip bir rezervuar ile kapalı bir mikro kuyu içindedir. Başlangıçta, protein ve çökeltici konsantrasyonları kristalleşmeye neden olamayacak kadar düşüktür. Deney sırasında, su damlacıktan buharlaşır ve rezervuarda toplanır; Damlacıktaki su miktarındaki bir azalma, sistemin aşırı doymuş hale gelmesine neden olur ve çekirdeklenme ve ardından kristalleşme meydana gelebilir. Damlacıktan net su transferi dengededir ve işlem tamamlanana kadar sistem korunur.
3D yapıyı görselleştirmek için x-ışını kırınımı kullanılır. Bir kristalden x-ışını verileri elde etmek için, tüm açılarda ışına maruz kaldığı monokromatik bir x-ışını demetine yerleştirilir. Her pozlama, her noktanın kristalden çıkan ve bir dedektör tarafından kaydedilen kırınımlı bir x-ışını olduğu bir görüntü sağlar. Veriler, kristal içindeki atomların düzenlenmesinin bir modelini üretmek için birleştirilir. Ortaya çıkan kristal yapı, tipik olarak 2 angstrom çözünürlüğü ile atomların 3 boyutlu yerleşimini gösterir.
Artık protein kristalizasyonunun ilkelerini ele aldığımıza göre, genelleştirilmiş bir protokole bakalım.
Prosedüre başlamak için, ilgilenilen geni içeren bir ekspresyon vektörü hücrelere dönüştürülür. Hücreler inkübe edilir ve orta log fazında, genin mRNA'sının transkripsiyonunu tetikleyen IPTG gibi bir indükleyici eklenerek ekspresyon başlatılır. Protein ekspresyonundan sonra, ham materyal lizis tamponunda süspanse edilir ve daha sonra santrifüjleme ile arıtılır.
Arıtılmış lizat daha sonra bir nikel kolonuna yüklenir ve polihistidin etiketli protein, diğer tüm biyomoleküller yıkanırken kolona bağlanır.
Birkaç miligram saf protein elde edildikten sonra, buhar difüzyonu ile kristalleşmeye hazırdır. 24 kuyulu asılı/oturan bir damla tepsisi, değişen konsantrasyonlarda sodyum klorür ve sodyum asetat tampon çözeltileri ile doldurulur. Oturarak bırakma yöntemi için, her bir oyuğun üzerindeki rafa eşit hacimlerde protein ve rezervuar çözeltisi pipetlenir ve ardından tepsi şeffaf bantla kaplanır. Tepsi daha sonra bir inkübasyon odasına yerleştirilir ve kuyucuklar ertesi gün, ardından birkaç günde bir büyüme açısından izlenir.
Uygun bir kristal elde edildikten sonra, x-ışını kırınım analizi için hazırdır. Kristal, kristali seçilen yönlerde konumlandırmak için bir gonyometre üzerine monte edilmiştir. Kristal, tüm açılarda monokromatik bir x-ışını demeti ile aydınlatılır ve bir kırınım modeli oluşturur. Yazılım, farklı yönlerde çekilen iki boyutlu görüntüleri, kristaldeki atomların konumlarını belirleyerek kristal içindeki elektron yoğunluğunun üç boyutlu bir modeline dönüştürür.
Şimdi bir prosedürü gözden geçirdiğimize göre, protein kristalizasyonunun bazı yararlı uygulamalarını ve başka bir kristalizasyon tekniğini gözden geçirelim.
Protein kristalizasyonu, in silico ilaç tasarımı için kullanılabilir. Memelilerde viral enfeksiyonla bağlantılı olan İnfluenza virüsünün polimeraz temel protein 2'nin üç boyutlu yapısı, kristalizasyon ve x-ışını kırınımı ile belirlendi. Proteindeki potansiyel bağlanma bölgeleri görselleştirilir ve bir yerleştirme programı kullanılarak, proteindeki bir yarığa girecek üç boyutlu bir molekül tasarlanmıştır.
Protein-DNA komplekslerinin birlikte kristalizasyonu da yararlı bir tekniktir. DNA bağlayıcı proteinler, transkripsiyon ve DNA polimerizasyonu ve DNA onarımı gibi çok çeşitli biyolojik fonksiyonları modüle eder; Ve bu komplekslerin kristal yapıları, protein fonksiyonu, mekanizması ve spesifik etkileşimin doğası hakkında fikir verebilir. DNA replikasyonunun negatif bir düzenleyicisi olan E. coli proteini SeqA, hemimetillenmiş DNA ile birlikte kristalize edildi.
G-proteinine bağlı reseptörler veya GCPR'ler gibi integral zar proteinlerinin, füzyon-protein destekli protein kristalizasyonunun gelişmesine yol açan kristal kafes kontakları oluşturmak için mevcut olan sınırlı miktarda polar yüzey alanı nedeniyle kristalleşmesi zordur. β2 adrenerjik reseptörü, bir GCPR ve bir lizozimi kodlayan genler bir ekspresyon vektörüne yerleştirildi. β2AR-lizozim füzyon proteininin kristalizasyonu, kristal kafes içinde paketleme etkileşimleri oluşturmak için gerekli olan lizozim tarafından sağlanan doğal olarak hidrofobik β2AR üzerindeki hücre dışı hidrofilik yüzey nedeniyle elde edildi.
Az önce JoVE'nin protein kristalizasyonu ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, ilkelerini, genelleştirilmiş bir protokolü ve biyomedikal alandaki bazı kullanımlarını açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
Protein kristalizasyonu, biyomoleküllerden oluşan katı bir kafes elde edilmesi, protein yapısını aydınlatır ve protein fonksiyonunun incelenmesini sağlar. Kristalizasyon, saflaştırılmış proteinin pH, sıcaklık, iyonik kuvvet ve protein konsantrasyonu dahil olmak üzere birçok faktörün bir kombinasyonu altında kurutulmasını içerir. Kristaller elde edildikten sonra, protein yapısı, x-ışını kırınımı ve bir elektron yoğunluğu modelinin hesaplanması ile açıklanabilir.
Bu video protein kristalizasyonunu tanıtır ve genel bir prosedürü gösterir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, kristalizasyon ve x-ışını kırınımı prosedürde ele alınmaktadır. Protein kristalizasyonu uygulamaları arasında in silico ilaç tasarımı, bağlanma yeri belirleme ve membran protein yapısı analizi yer alır.
Protein kristalizasyonu, bir proteinin kafesli katı bir formunun elde edilmesi işlemidir. Bu kristaller, protein fonksiyonunun incelenmesine yardımcı olan yapısal biyologlar için özellikle değerlidir. Kütle spesifikasyonu veya SDS-PAGE gibi diğer teknikler, yalnızca proteinlerin tek boyutlu yapısı hakkında bilgi sağlayabilir. Protein kristalizasyonu, rekombinant protein ekspresyonu ve x-ışını kırınımı teknikleri ile tamamlanır. Bu video, protein kristalizasyonunun ilkelerini, genel bir laboratuvar prosedürünü ve biyokimyasal alandaki çeşitli uygulamalarını gösterecektir.
İşlemde gerekli olan ilk adım, tipik olarak rekombinant protein ekspresyonu kullanılarak miligram miktarlarda çok saf protein elde etmektir. İlgilenilen proteine karşılık gelen gen, bir ekspresyon vektörüne klonlanır ve eksprese edilen protein, afinite kromatografisi ile saflaştırmaya yardımcı olmak için poli-histidin gibi bir afinite etiketine kaynaştırılır. Daha fazla bilgi edinmek için bu koleksiyonun afinite kromatografisi hakkındaki videosuna bakın.
Saflaştırılmış proteinin kristaller halinde oluşumu, pH, iyonik kuvvet, çökeltici ve protein konsantrasyonları, sıcaklık ve denge hızı dahil olmak üzere birçok faktörün uygun kombinasyonuna bağlıdır. Kullanılan en yaygın yöntem, iki kategorisi olan buhar difüzyonudur: asılı damla ve oturan damla. Su moleküllerini bağlayan, protein için su mevcudiyetini azaltan ve daha yüksek protein konsantrasyonunu taklit eden iyonik bir katı olan saf protein, tampon ve çökeltici içeren bir damlacık, aynı tampon ve çökelticinin daha yüksek konsantrasyonlu bir karışımına sahip bir rezervuar ile kapalı bir mikro kuyu içindedir. Başlangıçta, protein ve çökeltici konsantrasyonları kristalleşmeye neden olamayacak kadar düşüktür. Deney sırasında, su damlacıktan buharlaşır ve rezervuarda toplanır; Damlacıktaki su miktarındaki bir azalma, sistemin aşırı doymuş hale gelmesine neden olur ve çekirdeklenme ve ardından kristalleşme meydana gelebilir. Damlacıktan net su transferi dengededir ve işlem tamamlanana kadar sistem korunur.
3D yapıyı görselleştirmek için x-ışını kırınımı kullanılır. Bir kristalden x-ışını verileri elde etmek için, tüm açılarda ışına maruz kaldığı monokromatik bir x-ışını demetine yerleştirilir. Her pozlama, her noktanın kristalden çıkan ve bir dedektör tarafından kaydedilen kırınımlı bir x-ışını olduğu bir görüntü sağlar. Veriler, kristal içindeki atomların düzenlenmesinin bir modelini üretmek için birleştirilir. Ortaya çıkan kristal yapı, tipik olarak 2 angstrom çözünürlüğü ile atomların 3 boyutlu yerleşimini gösterir.
Artık protein kristalizasyonunun ilkelerini ele aldığımıza göre, genelleştirilmiş bir protokole bakalım.
Prosedüre başlamak için, ilgilenilen geni içeren bir ekspresyon vektörü hücrelere dönüştürülür. Hücreler inkübe edilir ve orta log fazında, genin mRNA'sının transkripsiyonunu tetikleyen IPTG gibi bir indükleyici eklenerek ekspresyon başlatılır. Protein ekspresyonundan sonra, ham materyal lizis tamponunda süspanse edilir ve daha sonra santrifüjleme ile arıtılır.
Arıtılmış lizat daha sonra bir nikel kolonuna yüklenir ve polihistidin etiketli protein, diğer tüm biyomoleküller yıkanırken kolona bağlanır.
Birkaç miligram saf protein elde edildikten sonra, buhar difüzyonu ile kristalleşmeye hazırdır. 24 kuyulu asılı/oturan bir damla tepsisi, değişen konsantrasyonlarda sodyum klorür ve sodyum asetat tampon çözeltileri ile doldurulur. Oturarak bırakma yöntemi için, her bir oyuğun üzerindeki rafa eşit hacimlerde protein ve rezervuar çözeltisi pipetlenir ve ardından tepsi şeffaf bantla kaplanır. Tepsi daha sonra bir inkübasyon odasına yerleştirilir ve kuyucuklar ertesi gün, ardından birkaç günde bir büyüme açısından izlenir.
Uygun bir kristal elde edildikten sonra, x-ışını kırınım analizi için hazırdır. Kristal, kristali seçilen yönlerde konumlandırmak için bir gonyometre üzerine monte edilmiştir. Kristal, tüm açılarda monokromatik bir x-ışını demeti ile aydınlatılır ve bir kırınım modeli oluşturur. Yazılım, farklı yönlerde çekilen iki boyutlu görüntüleri, kristaldeki atomların konumlarını belirleyerek kristal içindeki elektron yoğunluğunun üç boyutlu bir modeline dönüştürür.
Şimdi bir prosedürü gözden geçirdiğimize göre, protein kristalizasyonunun bazı yararlı uygulamalarını ve başka bir kristalizasyon tekniğini gözden geçirelim.
Protein kristalizasyonu, in silico ilaç tasarımı için kullanılabilir. Memelilerde viral enfeksiyonla bağlantılı olan İnfluenza virüsünün polimeraz temel protein 2'nin üç boyutlu yapısı, kristalizasyon ve x-ışını kırınımı ile belirlendi. Proteindeki potansiyel bağlanma bölgeleri görselleştirilir ve bir yerleştirme programı kullanılarak, proteindeki bir yarığa girecek üç boyutlu bir molekül tasarlanmıştır.
Protein-DNA komplekslerinin birlikte kristalizasyonu da yararlı bir tekniktir. DNA bağlayıcı proteinler, transkripsiyon ve DNA polimerizasyonu ve DNA onarımı gibi çok çeşitli biyolojik fonksiyonları modüle eder; Ve bu komplekslerin kristal yapıları, protein fonksiyonu, mekanizması ve spesifik etkileşimin doğası hakkında fikir verebilir. DNA replikasyonunun negatif bir düzenleyicisi olan E. coli proteini SeqA, hemimetillenmiş DNA ile birlikte kristalize edildi.
G-proteinine bağlı reseptörler veya GCPR'ler gibi integral zar proteinlerinin, füzyon-protein destekli protein kristalizasyonunun gelişmesine yol açan kristal kafes kontakları oluşturmak için mevcut olan sınırlı miktarda polar yüzey alanı nedeniyle kristalleşmesi zordur. ?2 adrenerjik reseptör, bir GCPR ve bir lizozim kodlayan genler bir ekspresyon vektörüne yerleştirildi. ?2AR-lizozim füzyon proteininin kristalizasyonu, kristal kafes içinde paketleme etkileşimleri oluşturmak için gerekli olan lizozim tarafından sağlanan doğal olarak hidrofobik ?2AR üzerinde artan hücre dışı hidrofilik yüzey nedeniyle elde edildi.
Az önce JoVE'nin protein kristalizasyonu ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, ilkelerini, genelleştirilmiş bir protokolü ve biyomedikal alandaki bazı kullanımlarını açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
Videos from this collection: