Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA)

Jel kayma testi olarak da bilinen elektroforetik mobilite kaydırma testi olan EMSA, çok yönlü ve hassas bir biyokimyasal prosedürdür. EMSA, jel elektroforezindeki bantlarda bir kayma tespit ederek proteinler ve nükleik asitler arasındaki bağlanmayı aydınlatır.

Bu videoda EMSA’nın ilkeleri açıklanmakta, genel bir prosedür sağlanmakta ve bazı uygulamalar ele alınmaktadır.

DNA replikasyonu, transkripsiyon ve onarımın yanı sıra RNA işlemenin tümü kritik biyokimyasal süreçlerdir. Hepsi proteinler ve nükleik asitler arasında bağlanmayı içerir. Birçok ciddi hastalık ve bozukluk bu bağlanmadaki değişikliklerle ilişkilidir. EMSA, belirli bir proteinin belirli bir nükleik aside bağlanıp bağlanmadığını kalitatif olarak belirlemek için kullanılan bir tekniktir. İlk olarak, nükleik asit, bir prob oluşturmak için genellikle radyoaktif fosfor-32 ile etiketlenir. Daha sonra test proteini ve nükleik asit probu karıştırılır. Bir protein bir nükleik asit probuna bağlandığında, ortaya çıkan kompleks, tek başına nükleik asitten daha büyük bir kütleye ve farklı bir konformasyona sahiptir.

Bağlandıktan sonra, kompleksler jel elektroforezi ile analiz edilir. Bu teknikte, bir elektrik alanı makromolekülleri bir jel matrisinden geçmeye zorlar. Bileşenler kütle, yük ve konformasyona göre ayrılır. Elektroforez, protein-DNA komplekslerini bağlanmamış problardan ayırabilir. Farklı kütlelere ve konformasyonlara sahip oldukları için jelden farklı oranlarda göç edecek ve ayrılacaklardır. Radyoaktif fosforun varlığı sayesinde ayrılma kolayca tespit edilir ve proteinin verilen nükleik aside başarılı bir şekilde bağlandığını kanıtlar. Proteinin tanımlanmasını doğrulamak için, bir “süper kayma testi”, proteine bilinen bir afinitesi olan bir antikor kullanır. Bu, karmaşıklığı daha da kaydırmak ve çözünürlüğü artırmak gibi ek bir avantaja sahiptir.

Artık prensipleri gördüğümüze göre, laboratuvarda görelim.

Prosedüre başlamak için proteinin izole edilmesi gerekir. Bunu yapmak için, hücrelerdeki proteini ifade etmek ve daha sonra saflaştırmak için moleküler biyoloji teknikleri kullanılır.

Nükleik asit, bir prob oluşturmak için amplifiye edilir ve etiketlenir. Etiketleme, radyoaktif fosfor-32 içeren dCTP ile 10 dakika inkübasyon yoluyla yapılır. Radyasyona karşı güvenli bir çalışma tezgahı ve koruyucu ekipman gereklidir.

Jel daha sonra hazırlanır. Proteinin konformasyonu değiştirmesini ve elektroforez sırasında probdan potansiyel olarak ayrılmasını önlemek için jelin denatüre olmaması gerekir. Poliakrilamid jeller, 5 ila 20 nm gözenek boyutlarına sahiptir ve uzunluğu 100 baz çiftine kadar olan kısa problar için kullanışlıdır. Agaroz jelleri 70-700 nm gözenek boyutlarına sahiptir ve daha büyük problar için kullanışlıdır.

Protein ve nükleik asit probu şimdi hazırlandıktan sonra bağlanmaya devam ediyoruz. Bir TRIS tampon çözeltisi hazırlanır ve protein ve prob eklenir. pH, fizyolojik koşullara benzer olmalı ve proteinin hedef olmayan nükleik asitlerle zayıf bağlar oluşturmasını önlemek için yeterli tuz konsantrasyonu olmalıdır. Reaksiyon 4 °C’de 20-30 dakika ilerler.

Bir sonraki adım elektroforezdir. Düşük iyonik kuvvete sahip bir tampon ve bağlanma reaksiyonunda kullanılana benzer bir pH kullanılır. Kompleksleri stabilize eden, hareketliliği artıran ve ısı üretimini azaltan bir “kafesleme etkisi” verir. Elektroforezden sonra, jelin bileşenleri filtre kağıdına aktarılır. Karanlık bir odada, filtre kağıdı daha sonra filme maruz bırakılır. Protein proba bağlanırsa, transferde iki farklı etiketli bölge görünecektir. Biri kompleksi temsil eder ve ayrı bir tanesi bağlanmamış probu temsil eder. Ayrılma, proteinin nükleik aside başarılı bir şekilde bağlandığını gösterir.

Artık temel prosedürü gördüğümüze göre, bazı uygulamalara bakalım.

Kromatin, ökaryotik hücrelerde bulunan DNA ve proteinlerin sıkıca paketlenmiş kompleksidir. Kromatin yeniden şekillenen enzimler, DNA’yı transkripsiyona açmak için yapıyı değiştirir. Bu, kompleksin hareketliliğini değiştirdiğinden, EMSA enzimin bağlanma aktivitesini keşfetmek için kullanılabilir.

Etiketlemeye alternatif bir yaklaşım, DNA ve metiltransferaz enzimi arasındaki etkileşimden yararlanır. Bir kofaktör, metiltransferaz yoluyla DNA’ya kalıcı olarak bağlanacak şekilde modifiye edilebilir. Fosfor-32 ile etiketlemek yerine, kofaktör biyotin ile konjuge edilir, bu da radyoaktif olmadığı için avantajlıdır. Kofaktör, bağlanmasında bölgeye özgü olduğundan, genotipleme, metilasyon tespiti ve gen iletimi ile ilgilidir. Biyotinillenmiş nükleik asitler ultraviyole floresan yoluyla tespit edilir.

Çevresel uyaranlar histidin kinazları aktive ettiğinde, bir “yanıt düzenleyici” fosforile edilir. Bu da DNA’ya bağlanarak EMSA tarafından incelenebilen transkripsiyonu etkiler. Örneğin, Desulfovibrio vulgaris içindeki bir yanıt düzenleyicisinin ilgilenilen gene bağlandığı gösterilmiştir. Bağlamanın gerçekleştiğini doğrulamak için EMSA kullanıldı.

Az önce JoVE’nin elektroforetik mobilite kaydırma testi hakkındaki videosunu izlediniz. Artık çalışma prensiplerini, prosedüründeki adımları ve ana çalışma parametrelerini anlamalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler!