4.12: Ko-İmmünopresipitasyon ve Pull-Down Testleri

Ko-immünopresipitasyon (CoIP) ve pull-down testleri, stabil protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için yakından ilişkili yöntemlerdir. Bu yöntemler, bir antikora bağlı bir hedef proteini bağlanmamış proteinlerden ayırmak için bir yöntem olan immünopresipitasyon ile ilgilidir. CoIP'de, antikora bağlı bir proteinin kendisi, antikorla bağlanmayan başka bir proteine bağlanır, bunu protein-protein kompleksini koruyan bir ayırma işlemi izler. Pull-down tahlillerindeki fark, afinite etiketli yem proteinlerinin antikorların yerini alması ve protein-protein komplekslerini izole etmek için afinite kromatografisinin kullanılmasıdır.

Bu videoda CoIP, pull-down tahliller ve bunların laboratuvardaki uygulamaları açıklanmaktadır. Bağlı proteinleri saflaştırmak ve analiz etmek için kullanılan reaktifler, aparatlar ve aletler dahil olmak üzere her teknik için adım adım bir protokol kapsanmaktadır. Ek olarak, bu videonun uygulamalar bölümü, miksovirüs proteinlerinin influenza nükleoproteinini nasıl inhibe ettiğini incelemek için bir prosedürü, bir aşağı çekme testi yoluyla kalmodulin'deki kalsiyum iyonlarının rolüne ilişkin bir araştırmayı ve geçici protein etkileşimlerini karakterize etmek için modifiye edilmiş bir aşağı çekme testini açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çok çeşitli biyolojik fonksiyonlarda önemli bir rol oynar. Protein-protein etkileşimlerinin çoğunluğu ve biyolojik etkileri henüz tanımlanmamıştır. Ko-immünopresipitasyon veya CoIP ve aşağı çekme deneyleri, stabil protein-protein etkileşimlerinin tanımlanması için birbiriyle yakından ilişkili iki yöntemdir. Bu video, iki tahlilin prensiplerini, genel laboratuvar prosedürlerini ve bu tekniklerin uygulamalarını kapsayacaktır.

CoIP ve pull-down tahlilleri, bir protein türünü karmaşık bir çözeltiden seçici olarak izole etmek için bir yöntem olan immünopresipitasyonun varyantlarıdır. Bir immünopresipitasyon deneyinde, bir hedef proteine özgü bir antikorun, numunedeki bu hedefle bir bağışıklık kompleksi oluşturmasına izin verilir. Kompleks daha sonra katı bir destek üzerinde, tipik olarak bir sefaroz boncuğuna bağlı protein A üzerinde yakalanır. Yakalanmayan herhangi bir protein, santrifüjleme adımlarıyla uzaklaştırılır. Protein daha sonra antikordan ve katı destekten indirgeyici SDS-PAGE numune yükleme tamponunda kaynatılarak salınır.

Ko-immünopresipitasyon aynı şekilde gerçekleştirilir, ancak sağlam protein kompleksleri katı destek üzerine yakalanır. Antikor, hedef proteine bağlanır ve bu da antikor tarafından hedeflenmeyen başka bir proteine bağlanır. İmmünopresipitasyonda olduğu gibi, protein kompleksi, SDS-PAGE numune yükleme tamponunun indirgenmesinde kaynatılarak antikordan ve katı destekten salınır.

Aşağı çekme testleri, bir antikorun aksine, yalnızca bir "yem" proteininin kullanımında farklılık gösteren ko-immünopresipitasyona benzer. Moleküler biyoloji teknikleri sayesinde, bu yem proteini, bir dizi histidin kalıntısı gibi bir afinite etiketi ile tasarlanır. Bu afinite etiketleri, "Kromatografi Tabanlı Biyomolekül Ayrımları" bölümünde açıklanmıştır. Protein daha sonra etiket için spesifik olan hareketsizleştirilmiş bir afinite ligandı üzerinde yakalanır. Yakalanan protein daha sonra "yem" ile kompleksler oluşturan proteinleri içeren bir numune ile inkübe edilir. Protein kompleksi, "yem" proteini üzerindeki etikete özgü rekabetçi bir analit içeren bir çözelti ile yıkanarak afinite desteğinden salınır. Aşağı çekme testleri, ko-immünopresipitasyon tarafından tahmin edilen protein etkileşimlerini doğrulamak ve bilinmeyen protein etkileşimlerini keşfetmek için yararlıdır.

Artık ko-immünopresipitasyon ve pull-down testlerinin prensipleri tartışıldığına göre, laboratuvar prosedürlerine bakalım.

İlk olarak, ko-immünopresipitasyonu tartışalım. Bir dizi mikrofüj tüpüne aşağıdakiler eklenir: PBS tamponu ve antikora bağlanan bir reçine-protein kompleksi olan% 50'lik bir protein A-sefaroz çözeltisi. Mikrofüj tüpleri, uygun dağılımı sağlamak için döndürülür ve daha sonra reçine ek PBS tamponu ile yıkanır. İstenilen proteini içeren hücre lizatı ve 2 μ g antikor mikrofüj tüplerine eklenir ve karışım 4 ° C'de 1 saat döndürülür. Boncuklar santrifüjleme ile peletlenir, süpernatan atılır ve boncuklar, bağlanmamış proteini uzaklaştırmak için tamponla üç kez yeniden yıkanır. Antikor-protein kompleksini içeren boncuklar, kompleksin antikordan çıkarılması ve SDS-PAGE ve immünoblotlama ile analiz için SDS-PAGE numune yükleme tamponunun indirgenmesidir.

Şimdi aşağı çekme tahlilleri için prosedürü tartışacağız: "Yem" proteini, uygun afinite etiketine sahip bir plazmitte ifade edilir. Log faz büyümesine ulaştıktan sonra, hücreler parçalanır ve daha sonra santrifüjlenir. Biyotin etiketli "yem" proteinini yakalayan askıda streptavidin-sefaroz boncuklar, bir mikrofüj tüpüne pipetlenir. Boncuklar daha sonra santrifüjlenir ve süpernatan aspirasyon ile dikkatlice çıkarılır. Boncuklar daha sonra tampon ile yıkanır, santrifüjlenir ve süpernatan çıkarılır.

"Yem" proteini için bir afiniteye sahip olan varsayılan "av" proteinini içeren hücreler, santrifüjleme ile toplanır. Süpernatan daha sonra reçineyi içeren mikrofüj tüpüne eklenir ve 4 ° C'de inkübe edilir. Bir çalkalayıcıda 3 saat boyunca C. Reçine daha sonra santrifüjlenir, süpernatan çıkarılır ve reçine, bağlı olmayan proteini çıkarmak için yıkanır. Reçineye elüsyon tamponu eklenir ve karışım bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Reçine daha sonra santrifüjlenir ve istenen kompleksi içeren süpernatant, immünoblotlama ile analiz edilir.

Artık prosedürleri gözden geçirdiğimize göre, ko-immünopresipitasyon ve aşağı çekme testlerinin bazı yararlı uygulamalarına bakalım.

Ko-immünopresipitasyon, enzimlerin etki mekanizmasının daha iyi anlaşılmasında faydalı olabilir. Miksovirüs- veya Mx- direnç proteinleri, mekanizmanın tam olarak anlaşılmadığı influenza A da dahil olmak üzere çok çeşitli virüsleri inhibe eder. Fare Mx1 proteini ve influenza nükleoproteini arasındaki etkileşimi incelemek için ko-immünopresipitasyon kullanıldı.

Aşağı çekme tahlillerinin, hücresel ortamdan bir sinyal ileten proteinler olan ikinci habercilerin etkilerini incelemede yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bunlar, çevresel ipuçlarına yanıt olarak birden fazla proteinin etkileşime girdiği bir sinyal yolunun bir bileşenidir. Kalsiyum iyonları, kalmoduline bağlanarak ikincil haberciler olarak işlev görür ve bu da çok çeşitli proteinlere bağlanır ve birçok biyolojik tepkiye aracılık eder. Kalsiyum olmadan, protein kalmoduline bağlanamaz. Kalsiyum iyonlarının varlığında veya yokluğunda proteinlerin kalmoduline bağlanma yeteneğini test etmek için bir aşağı çekme testi yapıldı.

Ko-immünopresipitasyon ve aşağı çekme testleri genellikle kararlı veya güçlü protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılır, ancak geçici olanları analiz etmek için kullanılmaz. Pull-down tahlillerinde yeni bir gelişme olan HaloTag, geçici protein etkileşimlerinin incelenmesini basitleştirdi; HaloTag, bir haloalkan katı desteği ile kimyasal olarak reaksiyona girebilen, ilgilenilen proteine kaynaşmış, genetik olarak kodlanmış bir protein füzyon etiketidir. Fonksiyonel analiz istenirse, protein kompleksi, eksi etiket, daha sonra tütün aşındırma virüsü proteazı ile inkübe edilerek izole edilebilir.

Az önce JoVE'nin ko-immünopresipitasyon ve aşağı çekme testleri hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda iki yöntemin ilkeleri, genel laboratuvar prosedürleri ve bazı uygulamaları açıklanmıştır.

İzlediğiniz için teşekkürler!