4.15: Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR)

Yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyomoleküllerin moleküler afinitesini, kinetiğini, özgüllüğünü ve konsantrasyonunu değerlendirmek için etiketsiz biyosensörlerin arkasındaki temel optik fenomendir. SPR'de biyomoleküler etkileşimler, bir prizma üzerinde ince bir metal tabakasından yapılmış bir biyosensör üzerinde meydana gelir. Biyomoleküllerin gerçek zamanlı etkileşimleri, metalin alt tarafından yansıyan ışığın değişimleri ölçülerek izlenebilir.

Bu video, SPR'nin temel kavramlarını ve biyomoleküler etkileşimleri analiz etmek ve görselleştirmek için nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Bunu, SPR kullanarak bağlanma oranlarını araştırmak için bir numune hazırlama ve deneysel protokol takip eder. Uygulamalar bölümünde, SPR görüntüleme, yerelleştirilmiş SPR ve kuantum nokta ile geliştirilmiş SPR incelenir.

Yüzey plazmon rezonansı veya SPR, biyomoleküllerin bağlanma ve adsorpsiyon etkileşimlerini değerlendirmek için belirli etiketsiz biyosensörlerin arkasındaki temel fenomendir. ELISA gibi etiketleme gerektiren bağlama tahlilleri zaman alıcı bir işlem olabilir ve analitin işlevselliğini değiştirebilir. SPR'de, biyomoleküler etkileşimler, bir prizmanın bir yüzünde ince bir metal tabakasından yapılmış özel bir sensör üzerinde meydana gelir. SPR cihazları, metalin altından yansıyan ışıktaki değişiklikleri izleyerek, bu etkileşimleri etiket kullanmadan gerçek zamanlı olarak görselleştirir. Bu video, SPR görüntüleme için genel bir prosedür olan SPR ilkelerini ve biyokimyadaki bazı uygulamaları tanıtacaktır.

Bir SPR sensörü genellikle bir prizmanın yüzünün üzerinde ince bir asil metal tabakasından yapılır. Sensörden okuma almak için ışık, prizma-metal arayüzden bir fotodetektöre yansıtılır. Yansıyan ışık, "yüzey plazmon rezonans açısı" olarak bilinen metal yüzeyin elektronik özellikleriyle ilgili belirli bir açı dışında yüksek bir yoğunluğa sahip olacaktır.

Moleküller yüzeye bağlandıkça, metalin elektronik özellikleri değişir ve bu da açıyı ayarlar. Yeni proteinler bağlanıp kompleksler oluşturdukça, açı daha da değişecektir. SPR açısındaki bağıl değişiklikleri ölçerek, bunun gibi etkileşimler gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Lokalize veya "L" SPR olarak adlandırılan başka bir teknik, sensör yüzeyi olarak metal nanopartikülleri kullanır. SPR açısını etkileyen özellikler, her bir nanoparçacık için yüksek oranda lokalizedir, bu da hassasiyeti ve sinyal çözünürlüğünü artırır.

Standart SPR ile bağlanma etkileşimlerini araştırırken, sensör genellikle cihazdaki bir akış hücresinin tabanı haline gelen bir platforma monte edilir. İlgilenilen biyomoleküller, tampon çözelti ile akış hücresi boyunca taşınır. Sensör yüzeyi genellikle ilk olarak metal için yüksek afiniteye sahip bir alt tabaka ile kaplanır. Bu, ilgilenilen analite bağlanan önemli miktarda ligandın sensör üzerinde hareketsiz hale getirilmesini sağlar ve ligandın prosedür sırasında ayrışma olasılığını azaltır.

Ligand sensör üzerinde hareketsiz hale getirildikten sonra, analit tampon içinde sensör üzerinden akıtılır. Analit ligand'a bağlanırken zaman içinde SPR açısındaki değişimi izleyerek, bağlanma hızı ve diğer kinetik bilgiler hesaplanabilir.

Yansıma verileri, yansıyan ışığı bir CCD dedektörüne yönlendirerek SPR görüntüleme veya SPRi için de kullanılabilir. Bu, tüm sensör yüzeyinin yüksek kontrastlı, yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü üretir. SPR ve ilgili teknikler kullanılarak moleküler afinite, kinetik, özgüllük ve konsantrasyon ile ilgili sorular cevaplanabilir.

Artık bir SPR deneyinde neyin ölçüldüğünü anladığınıza göre, bağlama oranlarını araştırmak için bir prosedüre bakalım.

Prosedüre başlamadan önce, çalışma ve numune tamponları hazırlanmalıdır. Çalışan tampon, ligandı sensör üzerine boşaltmak için kullanılır ve numune tamponu, analiti biriktirmek için kullanılır. Sensör çipi dikkatlice temizlenir ve bir kılıfa yüklenir. Daha sonra cihaz, akış hücresinin alt kısmı haline geldiği cihaza yerleştirilir. Cihaz yazılımı, deney ve müteakip analiz için kurulur. Gerekirse, ligandı yakalamak için sensör yüzeyi bir alt tabaka ile astarlanır. Ligand, çalışan tamponda sensör yüzeyi üzerinden akıtılır ve burada sensör yüzeyindeki alt tabaka tarafından yakalanır.

Daha sonra, numune tamponundaki analit, hareketsizleştirilmiş ligand'a seçici olarak bağlandığı akış hücresinden geçirilir. Yansımadaki değişiklik çizilir ve araştırılan reaksiyon için hız sabitlerini ve diğer reaksiyon kinetik verilerini belirlemek için kontrollerle karşılaştırılır.

Artık bir SPR deneyinin nasıl yapıldığını anladığınıza göre, SPR'nin biyokimyadaki diğer birkaç uygulamasına bakalım.

Burada, bir sensör üzerinde on bir reseptör dizisi ile proteinleri değerlendirmek için SPR görüntüleme kullanıldı. Her bir protein için yansıtma verilerinden zamana karşı yansıtma ve reseptör konsantrasyonunun 3 boyutlu grafikleri hazırlandı. Bu "profiller" her protein için karakteristiktir ve bu nedenle daha sonra protein tanımlaması için kullanılabilir.

Bu deneyde, hücre salgıları özel yapım bir LSPR sensörü kullanılarak incelendi. Sensör ayrıca SPRi ve floresan mikroskobu ile de uyumluydu. Hücreyi sensör üzerine bıraktıktan sonra, hücre salgılarının nanoparçacık dizisi ile etkileşimi yüksek uzamsal çözünürlükle ölçülebilir.

Burada, analit ile karıştırılmış bir SPR sinyal geliştirme ajanı olarak kuantum noktalarının, nano ölçekli yarı iletkenlerin kullanımı araştırılmıştır. Bu geliştirilmiş "nano-SPRi" yöntemi, standart SPRi ve ELISA yöntemi ile yapılan tahlillerle karşılaştırıldı. Nano-SPRi yöntemi, ELISA yönteminden daha az zaman alıcı olmasına rağmen, algılama hassasiyetini ve sınırını önemli ölçüde geliştirdi.

Az önce JoVE'nin yüzey plazmon rezonansı hakkındaki videosunu izlediniz. Bu fenomen, etiket kullanmadan biyomoleküler etkileşimleri izlemek ve görüntülemek için kullanılır. Bu video, bir SPR deneyi gerçekleştirmek için tipik bir protokol olan SPR ilkelerini ve biyokimyada SPR'nin birkaç uygulamasını tanıttı.

İzlediğiniz için teşekkürler!