Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Bu protokolün genel amacı, tümör dokularındaki ve kanser hücre hatlarındaki kombinatoryal kromatin durum modellerini tarafsız bir şekilde tanımlamaktır. Bu yöntem, kanser epigenetiği alanında, çorak bir histon modifikasyon durumlarının tümör oluşumuna nasıl katkıda bulunabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, çoklu histon modifikasyonunun yanı sıra çoklu numunelerin hem aynı anda hem de verimli bir şekilde işlenebilmesidir.

İlk olarak, steril bir tıraş bıçağı kullanarak 50 miligram melanom dokusunu manuel olarak ve iki mililitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS'yi ayırın. Dokuyu steril bir doku kültürü kabında yaklaşık beş dakika boyunca üç veya dört milimetrelik parçalar halinde doğrayın. Doku çözeltisini bir ayrıştırıcı tüpe aktarın ve sekizinci mililitre HBSS ekleyin.

Homojenize olana kadar bir ayrıştırıcı kullanarak dokuyu daha da ayrıştırın. Daha sonra, üç mililitre HBSS başına 200 mikrolitre% 16 formaldehit ekleyerek dokuyu çapraz bağlayın. Bir karıştırıcı kullanarak karışımı 10 rpm'de 37 santigrat derecede tam olarak 10 dakika çalkalayın.

Numuneyi inkübatörden çıkardıktan sonra, üç mililitre numune başına 200 mikrolitre tümöral glisin ekleyin ve karışımı 37 santigrat derecede beş dakika boyunca 10 rpm'de çalkalayın. Numuneyi, bir tezgah üstü santrifüj kullanarak dört santigrat derecede beş dakika boyunca 934 kez g'de döndürün. Bittiğinde, süpernatanı çıkarın ve beş mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin.

Ardından, numuneyi tekrar 934 kez g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın. 50 miligram doku başına proteaz inhibitörleri içeren 300 mikrolitre ChIP hasat tamponu ekleyin ve numuneleri buz üzerinde 30 dakika boyunca parçalayın. Hücreler yatarken, su banyosu bozucusunu ve ilgili soğutma sistemini açın ve sıcaklığın dört santigrat dereceye ulaşmasına izin verin.

Sonikatör tüpünü su banyosu bozucusuna yerleştirin ve 200 ila 600 baz çiftinin kromatin fragmanlarını elde etmek için melanom dokusunu 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı olarak 60 döngü boyunca sonikleştirin. Sekiz miligram melanom dokusu için, her histon antikorunun üç mikrogramını, 20 mikrolitre protein g manyetik boncuk ve 100 mikrolitre bağlanma engelleme tamponu ile iki saat boyunca, bir tüp tabanca kullanarak, rotasyonla dört santigrat derecede inkübe edin. Sonikasyondan sonra, SDS konsantrasyonunu% 0.1'e düşürmek için ChIP seyreltme tamponu kullanarak numuneyi beş kez seyreltin Antikor ve protein g manyetik boncuklarının inkübasyonu tamamlandıktan sonra, ChIP seyreltme tamponunu çıkarın ve boncukları 240 mikrolitre taze tamponda yeniden askıya alın.

Daha sonra, boncukların 20 mikrolitre alikotlarını, her biri ayrı bir doku örneği için kullanılacak olan 12 ayrı tüpe yerleştirin. Sonikasyonlu materyali, spesifik antikorlu protein g boncuklarına eşit şekilde alikot edin ve tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede bir tüp tabanca kullanarak döndürün. Ters çapraz bağlamadan sonraki sabah, antikor protein çözeltisini 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve manyetik bir stand üzerine yerleştirin.

Boncukların en az 30 saniye yapışmasına izin verdikten sonra süpernatanı çıkarın. Boncukları çok kanallı bir pipet kullanarak 150 mikrolitre buz gibi RIPA yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Mıknatısı yıkama başına 30 saniye boyunca sürekli olarak hareket ettirin, ardından süpernatanı çıkarın.

Yıkama adımlarından sonra, çip başına 44 mikrolitre doğrudan elüsyon tamponu, bir mikrolitre Rnaz ve beş mikrolitre protenaz k içeren bir elüsyon tamponu ana karışımı ekleyin ve ters çapraz bağlama için numuneyi girin. Numuneleri 37 santigrat derecede dört saat, 50 santigrat derecede dört saat ve 65 santigrat derecede sekiz ila 16 saat boyunca bir PCR termal döngüleyici kullanarak inkübe edin. Ertesi sabah, numuneleri tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı, amino çökeltilmiş DNA'yı içeren yeni bir 96 kuyulu PCR plakasına aktarın.

Çözeltiye 2,3 x paramanyetik boncuk ekleyin ve çok kanallı bir pipet kullanarak 25 kez dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Bunu takiben, oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. Ardından numuneleri tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında dört dakika daha inkübe edin.

Süpernatanı attıktan sonra, numunelere 150 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve boncukları rahatsız etmeden oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin. Boncukların kurumasına izin verdikten sonra, numuneleri mıknatıstan çıkarın ve 30 mikrolitre 10 milimolar traceal ekleyin. 25 kez pipetleyerek karıştırın.

Numuneleri oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra, tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve dört dakika daha oda sıcaklığında inkübe edin. Kütüphane hazırlığı için her numunenin 20 mikrolitresini yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın. PCR amplifikasyonundan sonra, numuneleri çıkarın ve çekirdeksiz su kullanarak toplam hacmi 100 mikrolitreye getirin.

Önce her numuneye 55 mikrolitre boncuk ekleyerek ve bir pipetle 25 kez karıştırarak çift taraflı paramanyetik boyut seçimi yapın. Daha sonra oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. Numuneleri tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve boncuklar üzerinde dizileme için uygun olmayan büyük parçalar elde etmek için oda sıcaklığında dört dakika daha inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, süpernatanı yeni bir 96 kuyulu PCR plakasına aktarın. 25 mikrolitre daha paramanyetik boncuk ekleyin ve 25 kez pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında mıknatıstan dört dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra, numuneleri tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin.

Sonra süpernatanı atın. Numuneleri mıknatıs üzerinde bırakırken 150 mikrolitre %70'lik etanol ekleyin ve boncukları bozmadan oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin. Etanolü çıkarın ve yıkamayı tekrarlayın.

Boncukların kurumasına izin verdikten sonra, numuneleri mıknatıstan çıkarın ve 25 mikrolitre 10 milimolar izal pH 8.0 ekleyin. 25 kez pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında, mıknatıstan dört dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra, numuneleri tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin.

Şimdi, boyutların dizileme için uygun olduğundan emin olmak için çoğullamadan önce yüksek hassasiyetli bir DNA elektroferogram cihazı kullanarak kitaplıkları ölçün. Bu protokol, yüksek verimli bir yöntem kullanılarak düzinelerce numune üzerinde ve paralel olarak gerçekleştirilebilen donmuş tümör dokularının ve hücre hatlarının immünopresipitasyonuna izin verir. Kromatin fragmanları, optimal immünopresipitasyon için 200 ila 1000 baz çifti arasında değişmelidir.

Saflaştırılmış ChIP DNA'sı, kütüphane hazırlığına geçmeden önce ölçülmelidir. Çoğullama ve yeni nesil dizileme için uygun tamamlanmış kitaplıklar, 200 ila 600 baz çifti arasında değişmeli ve herhangi bir primer dimerinden yoksun olmalıdır. Sıralama sonrası sonra, macs tepe çağrısı ve chromHmm analizi gibi boru hattının sonraki adımlarına geçmeden önce karşılanması gereken birçok kalite kontrol metriği vardır.

ChIP örnekleri, giriş DNA'sı üzerinden zenginleştirilmeli ve her histon modifikasyonu, epigenetik manzaranın belirli bir bileşenini temsil eden farklı bir profil göstermelidir. Krom HMM algoritması, incelenen histon modifikasyonlarına dayalı olarak en belirgin tekrar eden kombinatoryal ve uzaysal kromatin modellerini tanımlamak için Çok Değişkenli Gizli Markov Modeli kullanır. Bu altı modifikasyonu kullanarak, krom HMM, policomb baskılama, heterokromatik baskılama, aktif transkripsiyon ve aktif arttırıcılar gibi hem baskılayıcı hem de aktif alanları temsil eden işlevsel olarak farklı kromatin durumlarını tanımlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa üç ila dört gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kütüphane hazırlığına ve veri analizine devam etmeden önce antikorlar için en uygun sonikasyon koşullarını ve spesifikasyonunu belirlemek önemlidir. Bu prosedürü öğrenmek için, kromatin durum parçalarının gen ekspresyonu ve daha yüksek kromatin yapısı ile koalisyonunu belirlemek için RRS dizilimi ve kromozom doğrulama yakalama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Deneyden sonra bu teknik, kanser epigenetiği alanındaki araştırmacıların hasta tümör örneklerinde kromatin durum modellerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, tümör dokularının nasıl işleneceğini ve ayrıştırılacağını, kromatin immünopresipitasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini, yeni nesil dizileme için kitaplıkların nasıl hazırlanacağını, dizileme sonrası verilerin nasıl işleneceğini ve aşağı akış analizinin ilk adımları hakkında bilgi edinileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız. Formaldehit ile çalışırken son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun bir çeker ocak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.