Kan ve Serum lekeler kanser biyolojik değerlendirmek örnek depolama için yararlı bir araç olarak kurutulmuş

Bu yöntem, gelişmekte olan ülkelerden gelen hastalarda biyobelirteçleri inceleme şansı gibi translasyonel araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, kan ve serum örneklerini donmadan en az iki hafta saklama ve qPCR ve ELISA gibi sonraki analizler için yüksek kaliteli materyal sağlama imkanıdır. Bu tekniğin etkileri, kanser ve bulaşıcı hastalıklar gibi hastalıkların teşhisine kadar uzanır.

Bu yöntem aynı zamanda doğum öncesi hastalıkların incelenmesi veya HIV gibi bulaşıcı patolojilerin analizi gibi tanı veya araştırma alanlarına da uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, donmuş örneklerin mevcut olmadığı bir Kafkas ve Afrika vaka serileri arasındaki biyobelirteçleri karşılaştırmaya başladığımızda aklımıza geldi. Kan lekeleme adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

Bu prosedürde, üç mililitre kan örneği, 5.4 miligram EDTA içeren üç mililitrelik bir tüpte toplanır. Koruyucu kartın sağ alt köşesine hasta kod numarasını yazın. Kanı beş mililitrelik bir pipetle dikkatlice tekrar askıya alın.

Ardından, pipetleyin ve bir nokta kanı koruyucu karta aktarın. Her kan alikotu için yeni bir uç kullanarak, toplam üç ila beş kan lekesi elde etmek için lekelemeyi tekrarlayın. Kurumuş kan lekelerini veya DBS'yi, koruyucu kartın kapağı açık, emici olmayan bir yüzey üzerinde yatay konumda açık ve doğrudan güneş ışığından kaçınarak oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya bırakın.

Ertesi gün, kartı kullanana kadar oda sıcaklığında kurutucu madde içeren plastik bir torbada saklayın. Koruyucu karttan üç kurumuş kan lekesinden DNA çıkarılacaktır. DBS'nin her birini karttan keserek ve karttan ayırarak başlayın.

Ayrılmış DBS'yi yaklaşık bir milimetre çapında küçük parçalar halinde kesin. Bir DBS'den küçük parçaları 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Numuneleri sindirmek için, tüpe ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon kitinden 180 mikrolitre lizis tamponu ekleyin, ardından girdaplama yoluyla 20 mikrolitre proteinaz K.Mix ekleyin.

Tüpü bir termo-inkübatöre yerleştirin ve 60 dakika boyunca 56 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, kapaktan damlaları çıkarmak için tüpü kısaca santrifüjleyin. 200 mikrolitre lizis tamponu iki ekleyerek ve 10 saniye boyunca girdaplayarak yıkamaya başlayın.

Tüpü bir termo-karıştırıcıya yerleştirin ve 70 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Elusion sütununu iki mililitrelik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin ve eskisini atın. 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca yerçekiminin 6000 katında santrifüjleyin.

Sütunu iki mililitrelik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin ve eskisini atın. 500 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin ve bir dakika boyunca yerçekiminin 6000 katında santrifüjleyin. Sütunu iki mililitrelik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin ve eskisini atın.

Membranı kurutmak için üç dakika boyunca yerçekiminin 20.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. DNA'yı elüte etmek için, sütunu yeni bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin ve toplama tüpünü atın. Zarın ortasına 50 mikrolitre damıtılmış su koyun ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Tüpü bir dakika boyunca 20.000 kez yerçekiminde santrifüjleyin. Elute'u toplayın ve tekrar zarın ortasına yerleştirin. Tüpü bir dakika boyunca yerçekiminin 20.000 katında tekrar santrifüjleyin.

Membranı atın. DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçtükten sonra, DNA'yı kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu prosedür için, yedi mililitre periferik kan örneği önce EDTA'sız yedi mililitrelik bir tüpte toplanır.

Kan örneğini oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmaya bırakın. Koruyucu kartın sağ alt köşesine hasta kod numarasını yazın. Kan örneğini oda sıcaklığında yerçekiminin 1100 katı sıcaklıkta 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı tüpten çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Kanı beş mililitrelik bir pipetle dikkatlice tekrar askıya alın. Pipetleyin ve bir nokta serumu koruyucu karta aktarın.

Toplam üç ila beş kan lekesine sahip olmak için lekelemeyi tekrarlayın. Kurumuş sero lekelerini, koruyucu kartın kapağı açıkken oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya bırakın. Ertesi gün, kartı kullanana kadar oda sıcaklığında kurutucu madde içeren plastik bir torbada saklayın.

Depolama 14 günden uzunsa, eksi 20 santigrat derecede saklayın. Gerekirse her numune için DSS'yi çözerek ELISA testine hazırlanın. Proteini DSS'den çıkarmak için, bir DSS'yi yaklaşık bir milimetre çapında küçük parçalara kesin ve parçaları 1.5 mililitrelik bir tüpe koyun.

Ardından, dört mikrolitre PBS ekleyin. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede düşük hızda çalkalayın. Ertesi gün, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak salgılanan protein veya büyüme faktörü analizi için serum örneği olarak protein elutun uygun bir seyreltmesini kullanın.

Bu protokolde kan ve serum örnekleri oda sıcaklığında filtre kağıdı üzerinde kurumuş lekeler halinde saklanmıştır. Kan örneklemesinden önce ve sonra temsili bir protein koruyucu kart gösterilir. Filtre kağıdı üzerindeki depolamanın ve kan alma prosedürünün numune kalitesini etkilemediğini doğrulamak için, D vitamini bağlayıcı protein veya DBP seviyeleri için ELISA testleri, iki mililitrelik bir tüpte toplanan sekiz serum numunesi üzerinde gerçekleştirildi ve hemen eksi 80 santigrat derecede saklandı veya kurutulmuş serum lekeleri olarak toplandı.

Eşleşen numuneler arasındaki varyasyon katsayısı veya CV %2 ile %24 arasında değişmekteydi ve ortalama CV %9.6 idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10, 15 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, moleküler biyoloji veya protein analizinin sonraki yöntemleri gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, translasyonel araştırma ve biyobelirteç analizi alanındaki araştırmaların, biyolojik numuneleri standart koşullarda saklayacak laboratuvar ekipmanına sahip olmayan dünyanın her yerinden enstitülerle işbirliği yapmasını sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, kan örneklerinin kurumuş kan ve serum lekelerinde nasıl doğru bir şekilde saklanacağını iyi anlamış olmalısınız. Kan ve kimyasal reaktifle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.