Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma
10 Nisan 2018
Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.
Bu protokolün genel amacı, bir ribonükleoprotein yaklaşımı kullanarak CRISPR/Cas9 ve primer hematopoietik progenitör hücreler aracılığıyla hızlı ve verimli gen bozulması elde etmektir. Bu yöntem, X geni kaybının moleküler ve fenotipik sonuçları nelerdir gibi normal ve malign hematopoez alanlarındaki temel soruları cevaplayabilir.Bu tekniğin temel avantajı, son derece kolay, hızlı ve uygun maliyetli olmasıdır. Deney konseptinden uygulamaya kadar gereken tahmini süre bir haftadan daha kısadır.
Bu yöntem hematopoietik progenitör hücreler için optimize edilmiş olsa da, birincil T hücreleri, fare ve insan hematopoetik hücre hatları ve birincil lösemi örnekleri gibi diğer hücre tiplerine uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, plazmitler ve virüsler de dahil olmak üzere diğer CRISPR / Cas9 dağıtım yaklaşımlarının hücrelerimiz için toksik olduğunu veya yavaş geri dönüş sürelerine sahip olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi. İlgilenilen tek kılavuzlu RNA'ları tasarlamak için önce CRISPRscan web sitesine gidin.
İlgilenilen hücreye bağlı olarak, Fare veya İnsan düğmesine basın ve ardından UCSC arama kutusuna ilgilenilen geni girin ve git'i tıklayın. Ardından, hedeflemek istediğiniz eksonu yakınlaştırın. Genler başlığındaki CRISPRscan tahminleri altında herhangi bir tek kılavuzlu RNA hedef dizisinin listelenip listelenmediğini kontrol edin.
Ardından, yeşil bir dikdörtgen olarak etiketlenmiş bir hedef tek kılavuzlu RNA'ya tıklayın ve Oligo dizisi altında görüntülenen tam diziyi kopyalayın. Ardından diziyi bir metin belgesine yapıştırın. Ardından, ATAGC nükleotidlerini dizinin üç asal ucuna ekleyin.
Tam uzunluktaki dizi için sipariş verin. Şimdi, tek kılavuzlu RNA için DNA şablonunu sentezlemek için, tek kılavuzlu RNA'yı ileri ve evrensel ters primerleri çözün ve ardından seyreltin. Ardından, örtüşen PCR'yi gerçekleştirmek için tüm reaktifleri bir PCR tüpüne ekleyin.
PCR reaksiyonunu oluşturduktan sonra, tüpü bir termocycler'a yerleştirin ve programı çalıştırın. Program bittiğinde, DNA saflaştırma kolonlarını kullanarak PCR ürününü saflaştırın. DNA'yı 11.5 mikrolitre elüsyon tamponunda seyreltin.
Ardından, spektrofotometrede elüsyon tamponunu boş olarak kullanın. Spektrofotometrede örnek DNA'nın konsantrasyonunu ölçün. İlk olarak, ayrıştırılmış DNA, deoksinükleotid fosfatlar, reaksiyon tamponu ve T7 RNA polimeraz enzim karışımını PCR şerit tüplerinde karıştırın.
Daha sonra numuneyi 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Ardından, RNase'i kullanılan eldivenlerden çıkarmak için RNase temizlik maddesini uygulayın. Ardından, her bir RNA örneğinin hacmini nükleaz içermeyen su ile 50 mikrolitreye ayarlayın.
Üreticinin talimatlarını izleyerek RNA'yı saflaştırın. Son olarak, RNA'yı 50 mikrolitre nükleaz içermeyen suda elüte edin. İlk olarak, spektrofotometreyi boşaltmak için nükleaz içermeyen suyu kullanın ve ardından ayrıştırılan RNA'nın konsantrasyonunu ölçün.
Hücre sayısını saymak için tripan mavisi dışlamasını kullanın. Her replike için, replika başına 200.000 canlı hücre toplayın, ardından hücreleri yıkamak için fosfat tamponlu salin ekleyin. Daha sonra tüpü yedi dakika boyunca 300 kez g'de döndürün.
Santrifüjleme sonrası, süpernatanı dikkatlice çıkarın. Santrifüjleme sırasında, 1.5 mikrogram Cas9'u bir mikrogram toplam tek kılavuzlu RNA ile PCR tüpünde 20 ila 30 dakika inkübe edin. Bu, her replikat için Cas9-sgRNA RNP komplekslerini hazırlamak içindir.
Gerekli yeniden süspansiyon tamponu T'nin hacmini hesapladıktan sonra, yeniden süspansiyon tamponu T'de elde edilen hücre peletini çözün, daha sonra Cas9-sgRNA RNP kompleksleri ile PCR tüpüne 10 mikrolitre çözünmüş hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, elektroporasyon ünitesini açın. Küveti küvet tutucusuna kaydırın.
Ardından üç mililitre tampon ekleyin E. Elektroporasyon cihazındaki koşulları ayarlayın. Elektroporasyonu gerçekleştirmek için önce elektroporasyon pipetini tutun, ardından pençeyi uzatın ve diski pipet ucunun içine tutun, ardından ucu sabitlemek için pipeti sıkıca aşağı doğru bastırın. Ardından, numuneyi 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Numuneden 10 mikrolitre çekin ve hava kabarcığı olmadığından emin olun. Ardından, ucu doğrudan elektroporasyon küvetindeki elektrolitik tampona yerleştirin. Ardından ekranda Başlat'a basın.
Mesajın tamamının ekranda görünmesine izin verin. Ardından pipeti küvetten çıkarın. Daha sonra, içeriği küvetten yeni HSPC kültür ortamı ile doldurulmuş kuyuya dağıtın.
Cas9-sgRNA RNP elektroporasyonunun etkinliğini incelemek için, farelerden izole edilen HSPC'ler, GFP veya tdTomato'yu hedefleyen tek kılavuzlu RNaz ile elektroporasyona tabi tutulur. Bu HSPC'ler her yerde GFP veya tdTomato'yu ifade etti. Flow sitometrik analiz, protein düzeyinde HSPC'lerde GFP veya tdTomato ekspresyonunun yaklaşık% 75 ve% 74 kaybını gösterir.
Daha sonra, elektroporasyonlu hücrelerin GFP lokusundan PCR amplifiye edilmiş DNA ile T7 endonükleaz bir bazlı test gerçekleştirilir. Bu, GFP'nin gen bozulma verimliliğini ölçmek içindir. ImageJ yazılımı, bölünme yüzdesini hesaplamak için bölünmemiş bantlara bölünen yoğunlukların oranını hesaplamak için kullanılır.
İnsan CD45'i hedefleyen üç farklı tek kılavuzlu RNA'nın verimliliği, HL-60 AML hücre hattında test edilmiştir. Akış sitometrisi, tek kılavuzlu RNA1'i, kontrole kıyasla %98 nakavt verimliliği ile en verimli olanı olarak gösterir. Daha sonra, tek kılavuzlu RNA1 kullanılarak birincil insan kordon kanı CD34 pozitif HSPC'lerde CD45 nakavtı da gerçekleştirilir.
Akış sitometri analizi, sadece Cas9'a kıyasla CD34 ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmaksızın CD45 kaybı olan hücrelerin neredeyse% 80'ini gösterir. İnsan CD45 nakavt HSPC'lerinin aşılanmasını incelemek için, kemik iliği ve dalak hücreleri, analiz için CD34 pozitif retroorbital transfekte NSG farelerinden toplanır ve düzenlenmiş hücreleri HLA-ABC pozitif ve CD45 negatif olarak gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzeltilirse üç gün içinde tamamlanabilir.
Bu prosedürü denerken, tüm yüzeyleri ve reaktifleri RNase içermez, birden fazla teknikle verimli gen bozulmasını doğrulamayı ve uygun deneysel kontrolleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı ve verimli gen bozulması elde etmek için Cas9-sgRNA ribonükleoproteinlerinin hematopoietik progenitör hücrelere nasıl tasarlanacağını, sentezleneceğini ve transfekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, ribonükleoprotein yaklaşımı kullanılarak fare ve insan primer hematopoetik hücrelerinde CRISPR/Cas9 aracılı hızlı gen yıkımı için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem, minimum zaman ve maliyetle yüksek düzenleme verimlilikleri sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen düzenleme
- Hematopoetik hücre biyolojisi
- CRISPR/Cas9 teknolojisi
Arka Plan
- CRISPR/Cas9, gen bozulması için güçlü bir araçtır.
- Primer hematopoetik hücreler, hematopoezin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel CRISPR iletim yöntemleri toksik olabilir veya yavaş seyredebilir.
- Bu protokol, verimliliği artırmayı ve maliyetleri düşürmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Gen bozulması için hızlı ve verimli bir yöntem geliştirmek.
- Hematopoetik progenitör hücrelerde gen kaybının etkilerini incelemek.
- Çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- CRISPRscan kullanılarak tek kılavuz RNA'ların tasarlanması.
- RNA sentezi ve Cas9-sgRNA ribonükleoprotein komplekslerinin hazırlanması.
- Primer hematopoetik hücrelerin RNP kompleksleri ile elektroporasyonu.
- Akış sitometrisi ve T7 endonükleaz analizleri kullanılarak gen bozulma verimliliğinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- HSPC'lerde hedef gen ekspresyonunda yaklaşık %75 kayıp elde edildi.
- HL-60 AML hücre hattında %98 nakavt verimliliği kanıtlandı.
- Primer insan kordon kanı hücrelerinde etkili gen bozulması gözlendi.
- Düzenlenmiş hücrelerin NSG farelerde tutunması doğrulandı.
Sonuçlar
- Protokol verimlidir ve bir haftadan kısa sürede tamamlanabilir.
- Çeşitli hematopoetik hücre tipleri için uygulanabilir.
- Başarı için RNazdan arındırılmış koşulların sürdürülmesi kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Primer hematopoetik hücrelerdeki etkili gen bozulması, hematolojik ilaç keşfinde hızlı hedef doğrulamasına ve mekanistik risk azaltmaya olanak tanır. Ribonükleoprotein CRISPR/Cas9 yaklaşımı, eksojen DNA olmadan yüksek nakavt verimliliği sağlayarak biyolojik belirsizliği azaltır ve erken hedef seçiminde öngörülebilir güveni destekler. Bu iş akışı, hastalığa özgü hematopoetik sistemlerde fonksiyonel genomik için ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir yöntem sunarak onkoloji ve immünoloji programlarının keşif süreçlerini hızlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Primer fare ve insan hematopoetik progenitör hücrelerinde hızlı gen nakavt yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: AML hücre hatlarında %98'e, primer insan kordon kanı HSPC'lerinde ise %80'e varan nakavt verimliliği sağlayarak biyolojik risk azaltımını destekler.
- Stratejik Değer: Hastalıkla ilişkili sistemlerde gen kaybı fenotiplerinin hızlı değerlendirilmesine imkan tanıyarak hedef güvenini ve portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt aşama bileşik taramaları ve fenotipik analizler için valide edilmiş knockout hematopoetik hücreler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kantitatif akış sitometrisi ve T7 endonükleaz okumaları ile RNP elektroporasyonu aracılığıyla standardize edilmiş, tekrarlanabilir gen bozulması sağlar.
- Stratejik Değer: Tutarlı hedef validasyonu için primer hücreler, hücre hatları ve primer lösemi örnekleri genelinde ölçeklenebilir platform kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Düzenlenmiş insan HSPC'lerinin NSG farelerine tutunmasını göstererek, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel sürekliliği destekler.
- Operasyonel Değer: Hedef doğrulama çalışmaları için preklinik zaman çizelgeleriyle uyumlu, optimize edilmiş üç günlük bir iş akışı sağlar.
- Stratejik Değer: Hematopoetik hedeflerdeki mekanistik belirsizliği azaltarak onkoloji ve immünoloji süreçlerinde risk ayarlı ilerleme kararlarına olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef belirlemeden öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine entegre edilerek, bileşik taraması öncesinde hematopoetik hedeflerin hızlı bir şekilde fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Primer hematopoetik hücrelerdeki etkin gen yıkımı yoluyla hipotez testlerini ve yolak netleştirmeyi destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için yüksek tekrarlanabilirlik ve kantitatif çıktılara sahip, analize hazır nakavt modelleri sunar.
- Analiz: Akış sitometrisi ve T7 endonükleaz analizleri aracılığıyla ölçülebilir düzenleme verimlilikleri oluşturarak karşılaştırmalı durum analizine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Düzenlenmiş HSPC'lerin in vivo ortamda kanıtlanmış engraftmanıyla keşif aşamasını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Hematopoetik modeller genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir CRISPR/Cas9 RNP platformu oluşturarak gereksiz protokol geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörücü güven, mekanistik belirsizliğin azaltılması ve DNA entegrasyonu olmaksızın yüksek sadakatli gen bozunumu.
- Operasyonel Değer: Primer ve transforme hematopoetik hücrelerde gen düzenlemenin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Hematolojik ilaç programlarında iyileştirilmiş devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve geç evre biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Hızlı ve yüksek verimli hedef nakavt verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Moleküler klonlama, RNA işleme ve elektroporasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Doğrulama için termosikler, spektrofotometre, elektroporasyon ünitesi ve akış sitometresine erişime bağlıdır.
- RNP stabilitesini ve düzenleme verimliliğini sağlamak için RNazdan arındırılmış ortamlar ve standartlaştırılmış reaktif kullanımı gereklidir.
- Kılavuz RNA tasarımının farklı hematopoetik modellere ve hedef genlere göre uyarlanması ve optimize edilmesi gerekir.
- Pratik kısıtlama: Verimlilik hücre tipine ve hedef lokusa göre değişiklik gösterebilir; bu durum, ilgilenilen her gen için ampirik doğrulama yapılmasını zorunlu kılar.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
sgRNA Fwd Primer Design, DNA Template Synthesis, and ln Vitro Transcription of sgRNA
3:38
Cas9-sgRNA Complexing and Electroporation
5:45
Results: Use of Cas9-sgRNA Electroporation Protocol to Study Efficient Knockout of Target Gene
7:48
Conclusion
