Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

Merhaba, benim adım Alice Chen. Eritme laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım ve bugün size insan embriyolarından embriyonik kök hücreleri nasıl elde ettiğimizi göstereceğim. Gelişimin tüm farklı aşamalarında embriyoları alıyoruz ve uygun genişletilmiş blast aşamasına ulaşana kadar in vitro olarak kültürlüyoruz.

Bunlar, embriyonun ilk, tek hücre aşamasından erken blast desteğine ve daha sonra insan embriyonik kök hücrelerini türettiğimiz genişletilmiş blasta kadar nasıl geliştiğinin örnekleridir. Türev için seçilen yüksek kaliteli embriyolar daha sonra üç damla ACE yolundan aktarılır ve burada onu bırakacak ve lucita'nın Z'sinin çözünmesini izleyeceksiniz. Nöroşirürji süreci, tavşan anti-insan antikorunun hücrelerin dış tabakasına bağlanacağı spesifik olmayan bir süreçtir.

Bu durumda, üçlü dermdir. Kobay serum tamamlayıcısının uygulanmasının ardından, antikor bağlı bu hücrelerin tümü parçalanacaktır. Başlamak için üç tabak hazırlamak istiyoruz.

İlk plaka, zita'yı çıkarmak için kullandığımız ACE tyros içindir. İkinci ve üçüncü plakalar immünos cerrahisi içindir. İlk olarak, asit tiroz damlalarını ve insan embriyonik kök hücre türevini yerleştireceğimiz plakayı oluşturarak başlayacağım.

Medya düşüyor. Plakanın sol tarafında üç damla asit tiroz hazırlayın ve plakanın sağ tarafında üç damla insan ES kültür ortamı hazırlayacaksınız. İkinci plaka, bir tavşan anti-insan RBC olan birincil antikordan oluşur.

Yine, plakanın sol tarafı, embriyo başına üç damla olmak üzere birincil antikora ayrılacak ve plakanın sağ tarafı insan ES kültürüne ayrılacaktır. Medya, kompleman plakası için embriyo başına tekrar üç damla bırakır. Yine, plakanın sol tarafına üç damla tamamlayıcı madde ve ardından plakanın sağ tarafına üç damla insan ES kültür ortamı yerleştireceğiz.

Yine, her sıra bir embriyo için ayrılmıştır. Her üç plaka da buharlaşmayı önlemek için mineral yağ ile kaplanır ve dengeleme için inkübatöre yerleştirilir. Bu, tıpkı bir doku kültüründe olduğu gibi, laminer akışın olduğu bir toplama ürününün içindeki bir diseksiyon kapsamıdır ve insan ana manipülasyonumuzun çoğunu burada yaparız.

Embriyolarınıza başlamadan önce hazırlamak isteyeceğiniz ilk şey ağız pipetleridir. Yani bu standart ağız pipet hortumu, tek farkı, ağzınız ile pipetin gideceği yer arasına 0,2 mikronluk bir filtre yerleştirdik. Ve bu sadece steriliteyi sağlamak içindir.

Ağız pipetlerinin nasıl çekileceğini göstereyim. Çeşitli boyutları çekmeyi severim. Bunların hepsini VWR'den alabilirsiniz ve ben 10 mikrolitre, 50 mikrolitre ve 100 mikrolitre çaplarını çekmeyi seviyorum.

Şimdi montaj borusunu kesmek için bir elmas pim kullanıyorum. Bu ilk adım için, oldukça büyük bir çap istiyorsunuz çünkü tüm embriyoyu ele alıyorsunuz. Türetme için seçilen yüksek kaliteli embriyolar daha sonra üç damla ile transfer edilir.

Ofci yolları sadece ilk damladan ikinci damlaya, üçüncü damlaya geçiş yaparak onu bırakacak ve zap palita'nın çözülmesini izleyeceksiniz. Bu işlem genellikle 30 saniyeden az sürer ve aslında zop palita'nın çözüldüğünü görebilirsiniz. Zap palita tamamen çözüldüğünde.

Embriyolar daha sonra birinci, ikinci ve üçüncü yıkama damlalarından geçen insan Es kültür ortamının üç yıkama damlasından transfer edilir. Daha sonra embriyo birincil antikorun içine aktarılır, tekrar düşer, ilk damladan ikinci damlaya ve üçüncü damlaya geçer, burada üçlünün doku kültürü inkübatörü lizizinde yarım saatlik inkübasyon için bırakacaksınız, embriyonun dışındaki hücrelerin köpürmesini gördüğünüzde derm belirginleşir. Bu, üçlü dermal hücrelerin yalan söylemeye başlamasının başlangıcıdır.

Parçalanma, embriyonun tüm dış kenarı boyunca belirgin olduğunda, embriyo üç damla humanus kültür ortamından yıkanmaya hazırdır. İmmünos cerrahisinden sonra, Embriyolar daha küçük bir ağız pipeti kullanılarak mekanik olarak tritüre edilir. Bu ağız pipeti, ilk pipetten daha küçük bir çapa sahip olmalıdır, böylece lys trifecta'yı tıraş etmek için tasyon işlemini daha verimli hale getirebilirsiniz.

Dermal hücreler. Mekanik asyonun sonunda, merkezde bir hücre kümesi ile baş başa kalırsınız. Sağlam olan iç hücre kütlesi var.

Bunu çevreleyen, birçok lys trifekta dermal hücrenin yanı sıra bazı sağlam trifekta dermal hücreler vardır. Bu iç hücre kütlesi izolatı daha sonra fare embriyonik besleyici katman hücreleri ile hazırlanmış bir kuyuya yerleştirilir. Besleyici katman hücrelerinin plakası bir gece önce hazırlandı ve bu sabah ortamı fare embriyonik fibroblast ortamından insan es türetme ortamına geçirdim.

İç hücre kütlesi izolatı daha sonra komplemandan sonra yıkama damlalarından besleyici tabaka hücrelerini içeren bu kuyucuğa aktarılır. Bu çanak daha sonra inkübatöre geri gönderilir ve iç hücre kütlesi izolatının bağlanmasına izin vermek için birkaç gün dokunulmadan bırakılır. Bu, büyümenin nasıl geliştiğine dair bir örnektir.

Büyüme yeterince büyüdüğünde. Daha sonra bu büyümeyi ikiye bölerek ilk pasaja başlayabiliriz. Şimdi, orijinal türevden bu yana 14 gün geçti ve burada türevlerimizden birinden bir büyüme örneği var.

Bu, bugün büyümenin yarısını toplayacağım böyle bir büyümenin bir örneğidir. Bu büyüme ikiye bölünecek ve daha sonra kare parçalar halinde kesilecek ve bu parçaların her biri besleyici hücreler içeren yeni bir kuyuya aktarılacaktır. Büyümenin yarısını el değmeden bırakmak iyi bir fikirdir, böylece hücrelerinizi büyütmek ve gerçekleştirdiğiniz herhangi bir geçişi yedeklemek için geri dönebileceğiniz sürekli bir hücre kaynağınız olur.

İlk iki ila üç pasaj için. Bu şekilde mekanik olarak geçiş yapmak ve sonunda hücreleri daha verimli paketleme için enzimatik ayrışmaya uyarlamak iyi bir fikirdir. Laboratuvarımız, geliştirme ve farklılaşmayı anlamak ve kullanmak için insan embriyonik kök hücre hatlarını tutarlı bir şekilde türetir.

Bu hatlar aynı zamanda dünya çapında kök hücre araştırmacılarına da dağıtılmaktadır. Türetmenin başarısını etkileyen dört ana faktör olduğunu düşünüyorum. Birincisi, genetik geçmişe, embriyoların ne kadar iyi dondurulduğuna ve çözüldüğüne ve ayrıca patlama yardımında türetme aşamasına kadar in vitro kültürün kalitesine de bağlı olan embriyonun kalitesi ile ilgilidir.

İkinci faktör muhtemelen izolasyon sonrası iç hücre kütlesinin kalite bütünlüğüdür ve bu, iç hücre kütlesini izole etmek için kullanılan tekniğe bağlı olabilir ve ayrıca deneyim ve beceriye de bağlı olabilir. Üçüncü faktör, izole edilmiş iç hücre kütlesinin besleyici katmanlara ne kadar iyi bağlandığıdır ve dördüncü faktör, bu ICM izolatının büyümesidir. Teknik olarak zor bir süreç olduğunu düşünmüyorum.

Sadece biraz pratik gerektirir. Aslında, her adım oldukça basittir, bu yüzden protokolü takip edebildiğiniz sürece Biraz pratikle, herkesin bunu yapabileceğini düşünüyorum. Laboratuvarda bulduğumuz şey, anladığımızdan tam olarak emin olmadığımız nedenlerden dolayı her satırın biraz farklı olduğudur.

Örneğin, 10 satırın farklılaşma potansiyelini test edecek olsaydınız, belki de bu çizgilerden iki veya üçünün ilgilendiğiniz hücre türüne dönüşme olasılığı daha yüksek olabilir. Bu farklılıkların, hücrelerin bulunduğu aşamayla ilgili olduğundan şüpheleniyorum, embriyonik kök hücre hatları, embriyonun aşaması olan embriyonun aşaması ve bu hücrelerin manuel olarak ele alınması ile ilgiliydi. Özelliklerinin bazen hücre dizilerinin heterojenliğini değiştirdiğini ve potansiyellerinin her kök hücre araştırmacısının aklında tutması gereken bir şey olduğunu düşünüyorum.

Yine, buna neyin sebep olduğunu bilmiyorum, ama kesinlikle araştırmam için bir örnek olarak, hedefimiz nihayetinde pankreasın insülin üreten beta hücrelerini yapmaktır. Bu tür bir hücre hattı oluşturmanın ilk adımı, embriyonik kök hücrelerden endoderm üretmektir ve 10 ila 20 hat arasında yapılan bir karşılaştırmada, bulduğumuz şey, bu hatların bir veya ikisinin verimli bir şekilde endoderm üretebildiği, yarısının ise belki de daha az verimli bir şekilde endoderm üretebildiği ve bazılarının endodermi çok iyi üretemediğiydi. Dolayısıyla, bu ilk tarama süreci boyunca, ilgilenilen hücre tipini oluşturma eğilimi daha yüksek olan hücreleri seçeriz ve bu hücre tiplerini kullanarak kalan Farklılaşmayı takip ederiz.

İnsan embriyonik kök hücrelerinin ilk türevi 1998 yılında Thompson Etal tarafından rapor edildi ve 2004 yılında laboratuvarımız 17 yeni insan embriyonik kök hücre hattının türetildiğini bildirdi. Bu yayınlanmış protokolleri değiştirerek ve bu değişiklikler gerçekten sadece türetme sürecini daha akıcı hale getirmek içindi. Ortam bileşimindeki değişikliklerden, hücrelerin geçiş şeklinden ve dondurularak çözülme şekillerinden oluşurlar.

O zamandan beri, her türevde, protokolü ve türetme oranını iyileştirmenin yeni yollarını arıyoruz. Örneğin, laboratuvarımız, tavşan antikoru veya Gine domuzu sero tamamlayıcısı gibi kseno reaktifleri kullanmadan, iç hücre kütlesini daha mekanik olarak inceleyerek iç hücre matematiğini izole etmenin alternatif yollarını araştırıyor. Umarım, bu yöntemler iç hücre kütlesini izole etmenin daha iyi bir yolu olmasa da en azından karşılaştırılabilir bir yol açacaktır.