Name: Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, CRISPR-dCas9 CLOuD9 sistemi ile kromatin döngü yapısını seçici ve tersinir şekilde yeniden düzenleyerek gen ifadesi dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, kromatin organizasyonunun transkripsiyonel düzenlemeye etkisini araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo ve tüm Wang laboratuvar teknik destek ve makalenin eleştirel okuma için teşekkür ederiz. S.L.M. NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) ve Ulusal Kanser Enstitüsü (1F99CA222541-01) aracılığıyla bu çalışmalarında desteklenmiştir. K.C.W. bir kariyer Ödülü Burroughs Wellcome fondan tıp bilim adamları için desteklenir ve Donald E. ve Delia B. Baxter Vakfı Fakültesi bilim adamı.

1. gRNA tasarım
<ol><li>Kılavuzu RNA'ların10tasarlamak için bir standart gRNA tasarım aracını seçin. Daha önce Gelişmiş CLOuD9 yapıları9 tamamlayıcı çiftler kullanın (yani, en az 1 S. aureus (CSA) ve 1 S. pyogenes (CSP) inşa) her deneme için.<ol>
<li>Seçilen online tasarım aracı içinde Protospacer bitişik motifi (PAM) sıra "NGG" 20 Kılavuzu uzunluğu ile kullanın bp CSP ve PAM için sıra "NNGRRT" 21 Kılavuzu uzunluğuyla CSA için.</li>
		<li>Üzerinde özgüllük dayalı kılavuzları seçin puan ve tasarım çalışan bir rehber alma şansını arttırmak için her iki ipliklerini kılavuzları.</li>
		<li>2 oligonucleotides başına Kılavuzu oligo üreticisinden sipariş: ileri oligo için "caccg" 5' uç için Kılavuzu sırasının ve ters oligo için eklemek, "aaac" 5' ucu ve "c"-3' ucu siparişi vermeden önce ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başlangıçta, 3-5 gRNAs bir 250-1000 bp bölge üzerinde yayılmış ilgi her bölge için tasarım. Aşağıdaki gibi verimliliği hedefleyen gRNA değerlendirmek:<ol>
<li>Tanımlanan klon gRNAs etkin bir Cas9 plazmid içine (bkz. Adım 3) ve (bkz: adım 4) 293T hücrelere geçici transfect11.</li>
		<li>2-3 d içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin (kalem strep), hücrelerin büyümesine sonra hasat ve genomik DNA12ayıklayın.</li>
		<li>Hedef bölgeler polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarafından yükseltmek. Ürünler üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve uygun bantları arındırmak.</li>
		<li>T7 endonükleaz tahlil Guschin içinde açıklandığı gibi gerçekleştirmek ve ark. iletişim kuralı13,14. Not: Bu DNA hedef sitede kesmek için belirlenen verimli kılavuzları vardır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre kültürü
<ol><li>Bir sağlıklı ve aktif devlet bölen hücreleri korumak.<ol>
<li>K562s için kültür Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 medya % 10 FBS ve % 1 kalem strep ile.<ol>
<li>K562s bakım için bir 25 cm2 canted boyun şişesi içinde büyümek ve her gün mL başına 400.000 hücre için hücre yoğunluğu ayarlayın.</li>
			<li>K562s ile transduced sonra CLOuD9 oluşturur, 2 µg/mL puromisindir ve 100 µg/mL hygromycin bakım ortamına Ekle.</li>
		</ol>
</li>
		<li>293Ts için kültür içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile % 10 FBS ve % 1 kalem strep.<ol>
<li>293Ts 10 cm2 tabak içinde büyümek ve konfluent ne zaman bölünmüş.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. plazmid hazırlık ve gRNA ekleme15
Not: Plazmid haritalar ekte mevcuttur ve örnek deneylerde kullanılan astar ek tablo 1' de kullanılabilir.
<ol><li>BsmBI, alkalen fosfataz, 10 arabellek x 6 µL ve taze hazırlanmış 100 mm DTT 0.6 µL 3 µL 3 µL ile Mix 5 µg lentiviral CRISPR plazmid. GKD2O ile 60 µL toplam hacim getirmek ve sindirmek ve plazmid dephosphorylate 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Jel sindirilir plazmid arındırmak ve GKD2' O. elute</li>
	<li>10 x T4 ligasyonu arabellek, GKD2O 6.5 µL ve 0.5 µL 1 µL ile her 100 µM, eşleştirilmiş kılavuzların Mix 1 µL T4 PNK 10 µL toplam hacim ulaşmak için. 30 dk, 5 dk, sonra 95 ° C için 37 ° C'de kuluçkaya sonra 25 ° C 5 ° C/dk aşağı rampa. Not: Bu kılavuzları çifti TAV.</li>
	<li>Tavlanmış kılavuzları (Kimden adım 3.3) 1: 200 GKD2O. sulandırmak</li>
	<li>Mix 1 µL seyreltilmiş ve birleştirilmiş kılavuzları adım 3.4, 2 x arabellek, GKD2O 1 µl ve ligaz, 0.5 µL 5.5 µL toplam reaksiyon yapmak için 2.5 µL 0.5 µL ile adım 3.2 sindirilir plazmid. Bu BsmBI sindirilmiş plazmid kılavuzlara ligate 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Stbl3 bakteri adım 3.5 yeni ve birleştirilmiş plazmid dönüştürmek ve herhangi bir plazmid hazırlama yöntemi kullanarak yükseltmek.</li>
</ol>4. lentivirus üretim
<ol><li>İyi bir altı-kuyu başına sayısı 750.000 293T hücre bir hemasitometre kullanarak plaka ve onları DMEM içinde % 10 FBS ve % 1 kalem ile strep temel olarak belirler. Bir şey için her yapı kullanan.</li>
	<li>tohum sonra 24 h % 10 ile taze antibiyotik ücretsiz DMEM için medya değiştirmek FBS.</li>
	<li>Bir tüp içinde OptiMEM orta tepki11başına 150 µL ile lipid tabanlı transfection reaktif 11 µL sulandırmak.</li>
	<li>Ayrı bir tüp içinde CLOuD9 lentiviral vektör plazmid adım 3.6, pMDLg/pRRE, pRSV-Rev 1 µg ve pMD2.G 0.65 µg OptiMEM orta tepki11başına 150 µL ile 0.35 µg 2 µg sulandırmak.</li>
	<li>Her reaksiyon için 1:1 oranında sulandırılmış lipid tabanlı transfection reaktif seyreltilmiş lentiviral plazmid karışımları eklemek ve 5 dk11için kuluçkaya.</li>
	<li>Birimin tümü her karışık kompleks adım 4.2 adımından 4.5 293T antibiyotik içermeyen hücreleri ilgili kuyu içine ekleyin.</li>
	<li>48 saat sonra bir taze tüp ve spin aşağı 300 x g 5 min için de pipetting tarafından viral üretim medya toplamak. Santrifüjü sonra süpernatant kalan hücre artıkları kaldırmak için taze bir tüp taşıyın.</li>
	<li>Viral üretim ortamı hemen hedef hücreleri iletim için kullanmak veya ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak.</li>
</ol>5. lentivirus iletim hücre
<ol><li>Faiz (tamamlayıcı CLOuD9 Plasmid'ler ile oluşan) viral her yapı 250 µL CLOuD9 uygulama için 80.000 hücreleri içeren bir 15 mL konik tüp ekleyin.</li>
	<li>Medya hacmi her getirmek ile antibiyotik özgür kitle iletişim araçları, 1 ml konik ve 1-8 µg/mL (kullanılan hücre türüne göre tolere polybrene maksimum konsantrasyon-ecek lüzum deneysel olarak belirlenecek) arasında son bir konsantrasyon polybrene ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 800 x g için oda sıcaklığında 30 dk de spin sonra viral süpernatant kaldırmadan pipetting tarafından resuspend. Tüm hücre süspansiyon hücre kültür plaka taşımak.</li>
	<li>24 saat sonrası iletim, spin hücreleri aşağı 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de.</li>
	<li>Viral süpernatant Aspire edin ve hücreler normal hücre kültür medya resuspend.</li>
	<li>Bir sonraki günü için iki kat transduced hücreleri seçmek için hücre kültür orta puromisindir (1 µg/mL 293T hücreler için) ve hygromycin (25 µg/mL 293T hücreler için) ekleyin. Deneysel olarak puromisindir ve hygromycin deneyler başlamadan önce belli bir hücre türü için uygun konsantrasyonlarda belirlemek.</li>
	<li>En az 3 d daha önce herhangi bir aşağı akım deneyler için seçim medyada hücreler tutmak ve tüm deneyler süresince seçimi medyada bakımı.</li>
</ol>6. hücre Dimerization ve dışarı yıkama
<ol><li>1 mM Absisik asit (ABA) ekleyebilir veya seçili ve hücreleri transduced dimetil sülfoksit (DMSO) hücre kültürü CLOuD9 dimerize denetimlere için eşdeğer bir ses. ABA giriş tarihi 6 ay içinde kullanın, soğuk tutmak ve ışık kullanımı boyunca onu korumak. 2 mM ABA gerektiğinde yararlı olabilir.<ol>
<li>Medya günlük deneyler süresince taze ABA (veya DMSO denetimler için) sağlamak için değiştirin. Not: Dimerization uzunluğu sınırlama henüz gözlenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dimerization aracılığıyla iki plaka yüzeyi kapsayacak ABA içeren ve hücreleri yeterli fosfat tamponlu tuz yıkama medya (PBS) kaldırılması ters. Bundan sonra kültür hücreleri ABA-ücretsiz medya un dimerized bir durumu korumak için.</li>
</ol>7. Immunoprecipitation ve Co-immunoprecipitations
Not: tüm arabellekleri kullanılmadan önce taze ve hemen alın.
<ol><li>Bitimini takiben dimerization deneyler, toplamak ve hücre aşağı spin sonra süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Crosslink ve donma hücreleri aşağı<ol>
<li>Taze bir hisse senedi % 1 formaldehit PBS içinde oda sıcaklığında taze malzemeler kullanılarak olun. Her 2 milyon hücre için hafifçe % 1 formaldehit tam olarak 10 dakika, oda sıcaklığında 1 mL ile dönen iken resuspend. Not: 10 mL minimum hacmi 10 milyondan az hücreleri çapraz için kullanın.</li>
		<li>Crosslinking 0,125 M, kuluçka oda sıcaklığında 5 min için döndürme sırasında ardından son bir konsantrasyon için glisin ilavesi ile gidermek.</li>
		<li>Hücreleri aşağı spin ve 1-2 x buz gibi PBS ile yıkayın. Hücre topakları sonra sıvı azot içinde donmuş ve-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılan ek olabilir. Not: Isı formaldehit Glossar tersine çevirir. Ek donma olmadan koştu, hücreleri doğrudan-80 ° C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikor/boncuk eşlenik hazırlamak Not: Seçilen antikor (yani, farklı lizis arabellekleri hücre lizis için test ve IP gerçekleştirme) için en iyi duruma getirme koşulları faydalı olabilir. İki ortak arabellekleri, Farnham lizis tampon ve RIPA modifiye tampon, IP verimlilik ve sonication verimliliği üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Tüm arabellek kompozisyon Malzemeler tablobulunabilir. Ayrıca, o kromatin unutmayın sonication tamamlanması birkaç saat sürebilir.<ol>
<li>Boncuk vortexing kısa bir süre için seçilen antikor uygun olarak tarafından resuspend.</li>
		<li>Boncuk deney için uygun bir miktar bir 1,5 mL tüp aktarın. Bir başlangıç noktası olarak, boncuk 20 µL antikor her 1 µg için kullanın. Antikor henüz eklemeyin. Not: antikor bu anlamına gelir daha fazla veya daha az verimli tanımıyorsan 10 µg antikor boncuk 200 µL ile toplam bir başlangıç noktası olarak lysate 1 mg için kullanın. Düşük bereket proteinler için bu oran ayarlanması gerekebilir.</li>
		<li>Farnham lizis arabellek kullanıyorsanız, 3 x IP seyreltme arabellekte yıkayın. RIPA lizis arabellek kullanıyorsanız, 3 x RIPA lizis arabellekte yıkayın.</li>
		<li>Bu boncuklar adım 7.3.3 aynı arabelleğinden son hacmi (IP seyreltme veya RIPA arabellek) resuspend > 1 x ve < ilk x 5. yani 100 µL ilk boncuk birim için 100 ve 500 µL son resuspension birim arasında kullanın.</li>
		<li>Antikor şimdi uygun bir konsantrasyon, soluk boncuk ekleyin. Bir iyi HA veya bayrak antikor için IP CLOuD9 yapıları, antikorlar 1:50 at kullanın (µg protein: µg protein lysate) ve arasında 8 + s ve gecede 4 ° C'de döner süre kuluçkaya. Alternatif olarak, oda sıcaklığında 2-4 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk süpernatant kaldırmak ve atın.</li>
		<li>Yıkama yıkama arabelleği ile 3 x boncuk.</li>
		<li>Antikor (IP seyreltme veya RIPA arabellek) ile gece kuluçka için kullanılan arabellek en az bir hacim içinde resuspend. Protein lysate ile kombine kadar soğuk tutmak.</li>
	</ol></li>
	<li>Kromatin solüsyon içeren temizleyicide<ol>
<li>İlk hücre hücre topakları buz 10 min için arabelleğe şişme ek koşullar, fiske yerleşme önlemek için her birkaç dakikada hücreleri. Not: Genel olarak, arabellek şişme 500 µL 25 milyon hücrelere eklendi ve oradan ölçekli, ancak değil kullanımı daha az 500 µL için tampon yapmak < 25 milyon hücre.</li>
		<li>Dounce el ile hem saat yönünde ve saat yönünün tersine, her x 13.</li>
		<li>Sonra aşağı spin çekirdeği 1.500 x g., 5 min için 4 ° C'de süpernatant tamamen Aspire edin ve kalan süpernatant kaldırmak için yineleyin ve sonra hücre Pelet mg tartmak.</li>
		<li>Proteaz inhibitörü çekirdeği lizis arabelleğe ekleyin (Farnham arabellek veya RIPA tampon, yukarıda, birini seçin).</li>
		<li>Çekirdeklerin lizis arabellek 10 x miktarda pelleted çekirdekler için resuspend ekleyin (örneğin, 1 mL çekirdek lizis arabellek 0,100 g Pelet ekleyin). Kısaca girdap ve buz üzerinde 10 min için koşullar. Not: sonication tüp boyutunu göz önünde bulundurun. İdeal birimdir kez < 1 mL örnekleri granül çok büyük eğer bölünmüş olması gerekebilir.<ol>
<li>Co-IP için çekirdek kısaca malzeme solubilize ve immunoprecipitation 2-3 birimleri seyreltme arabelleği ile izin veren bir düzeye SDS gidermek için solüsyon içeren temizleyicide sonra 7.4.6 adıma geçin. Çok hassas antikorlar için SDS konsantrasyonu daha da azaltmak için daha fazla seyreltme arabellek ekleyin. Not: lysate temizler sonication durdurur; Bunu bir opak/yarı saydam beyaz tamamen saydam olarak değiştirir. Örnekleri kadar soğuk tutmak ve değil üzerinden solüsyon içeren temizleyicide.</li>
			<li>Çip, iyice 150-1000 bp DNA parçalarının elde etmek için DNA'sı solüsyon içeren temizleyicide sonra 7.4.6 adıma geçin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika için maksimum hızda çözünmez malzeme dışarı spin</li>
		<li>Çözünür malzeme için taze bir tüp aktarın.</li>
		<li>Co-IP için protein konsantrasyonu ölçmek ve açılan 7.5 adımda devam edin.</li>
		<li>Yonga için 10 µL aliquot in çıkarmak lysate temizlenir ve 40 µL IP elüsyon tampon ve 6 µL 5 M eklemek buna NaCl 56ul olmak üzere toplam. 95 ° C'de 15 dakika kaynatın, 3 M NaOAc pH 5, 5-10 µL ekleyin ve bir PCR arıtma sütun temizle. DNA toplama 260 absorbans ölçerek ölçmek nm ve örnekler üzerindeki standartlaştırmak. Daha sonra açılan adım 7.5 için devam. Not: Ekstra lysate olabilir ek-80 ° C'de donmuş ve daha sonra kullanılan, ancak en iyi sonucu almak taze lysate elde edilir. Donma, donma/lysate daha çözülme değil bir kez daha.</li>
	</ol></li>
	<li>Açılan<ol>
<li>Protein lysate uygun bir miktar taze bir tüp aktarın. Farnham lizis arabellek kullanıyorsanız, IP seyreltme arabellek (üstte) 2.1 cilt olarak sulandırmak.</li>
		<li>100 µL süpernatant giriş denetimi için bir kenara ve 4 ° C'de ertesi güne kadar saklayın.</li>
		<li>Boncuk/antikor eşlenik adımından 7.3.8 örnekleri için şimdi ekleyin.</li>
		<li>Örnekleri 4 ° C'de gecede döndürün ve yeterli hacim 1,5 mL tüpler içinde sıvı hareketi için olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Yıkama ve Elute<ol>
<li>Gecede döndürme sonra süpernatant nonbinding kesir olarak kaydedin. Daha sonra yıkama 3-5 x IP seyreltme arabelleği boncuk.</li>
		<li>IP elüsyon arabellek inhibitörleri olmadan oda sıcaklığında hazırlayın.</li>
		<li>Bir girdap 15 dk. Transfer elüsyon için yeni bir tüp için 67 ° C'de sarsıldı 50 µL elüsyon arabelleği ile kompleksleri elute ve tekrar başka bir 50 µL. birleştirin ikisini bir toplam 100 µL elüsyon için. Not: Bu elüsyon yordamdan gelen çok fazla arka plan ise, ısı azaltılmış olabileceği gibi sallayarak/kuluçka sırasında ortadan kaldırılmıştır. Bu genellikle hedef protein verimini azaltır ancak arka plan önemli ölçüde azaltabilirsiniz.</li>
	</ol></li>
	<li>Isıtma için 67 ° C'de tarafından Glossar ters > 4 h. Not: Bu ortak IP için kesinlikle gerekli değil ama yararlı olabilir.<ol>
<li>Co-IP için faiz hedefler arasında tam dimerization emin olmak için eluates bir SDS-sayfa jel ve yoklama HA etiketi veya bayrak etiketi, karşı antikor ile tüm 1:1000 belirtildiği şekilde çalıştırın. Adım 8'e geçin.</li>
		<li>ChIP-qPCR için doğru yerelleştirme ve her CRISPR dCas9 bileşeni hedefleme emin olmak için bir sütunda elüsyon ürün temiz ve 10 µL. gerçekleştir gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir tepkimesi içinde (qPCR) saf DNA elute. Ek tablo 1' de sunulan verilerde kullanılan astar kullanılabilir. Adım 8'e geçin.</li>
	</ol></li>
</ol>8. RNA çıkarma ve kantitatif PCR
<ol><li>Gen ifadesinin CLOuD9 kaynaklı değişiklikleri öğrenmek için ilk olarak, izole ve denetim hücre topakları ve dimerized hücre topakları toplam RNA arındırmak.</li>
	<li>Tamamlayıcı DNA (cDNA) Ters transkripsiyon17 tarafından arıtılmış RNA yapmak ve qPCR çözümlemesi. Astar ek tablo 1' de kullanılabilir.</li>
</ol>9. kromozom Conformation yakalama tahlil
<ol><li>Değişiklikleri CLOuD9 tarafından indüklenen genomik loci kişiler sıklıkla gözlemlemek, kromozom conformation yakalama (3 C) gerçekleştirmek için8deneyleri.</li>
	<li>3 C ligasyonu ürünler iki yineleme kümesi içinde her biri üç biyolojik çoğaltır nicel gerçek zamanlı PCR tarafından için ölçmek. Örnekleri 3 C sinyalleri tübülin locus normalleştirmek. Astar ek tablo 1' de kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li>
<li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+loops+in+major+folds%3A+Enhancer-promoter+looping%2C+chromatin+restructuring%2C+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640(2015).</li>
<li>Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes%3A+interpreting+chromatin+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li>
<li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22610406">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li>
<li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li>
<li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li>
<li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, 13 July (2017).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+2000+Reagent%22">Lipofectamine 2000 Reagent</a>. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Determining+Genome+Targeting+Efficiency+using+T7+Endonuclase+I+%28M0302%29%22">Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302)</a>. , New England BioLabs. (2016).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNeasy+Mini+Handbook%22">RNeasy Mini Handbook</a>. , QIAGEN. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+VILO+cDNA+Synthesis+Product+Information+Sheet%22">SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).</li>
<li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy%2C+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li>
<li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li>
<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

The Most CLOuD9 kromatin döngü kritik adım vardır: 1) tasarlama veya doğru gRNAs kullanarak, ABA veya DMSO, dahil olmak üzere günlük CLOuD9 transduced hücrelerde, 2) değişen medya 3) ABA tazeliğini korumak ve 4) doğru ve dikkatli değerlendirme gerçekleştirme Kromatin biçimi.
CLOuD9 sınırlarını öncelikle hedef bölgeyi tercih kılavuzları tasarım yeteneği bulunur. Kılavuzu RNA'ların dCas9 bileşenleri dimerized için hedef DNA bölgelerine yerelleştirme önemli görevi gerçekleştirmek ve kılavuzları etkinliğini belirli hedef sitede temel alır. Uygun gRNA bileşenleri sistem geri dönülebilir olarak oluşturmak mümkün olmayacaktır CLOuD9 döngüler indüklenen. Böylece, ilgi her bölge için birden çok kılavuzları tasarlama ve kılavuzları 250-1000 bp bir bölge üzerinde yayılıyor, en az bir başarılı Kılavuzu sağlanacak. Kılavuzu konumu da doğru sonuçlar için ayrılmaz bir parçasıdır. Arka plan efektleri gibi yukarı veya aşağı transkripsiyon önlemek için kılavuzları transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri veya diğer kritik bölgelerde bulunan önlemek önemlidir. Ayrıca, CLOuD9 yapýsý tam yerini biraz hedef Gen transkripsiyonu etkileyebilir. Bu kılavuzların her hedef bölgenin en güçlü çifti için Deneysel amaçlar tanımlamak için birden çok ikili test önemini vurgular. Ayrıca, her çifti hedef bölgeleri, CSA yapı gRNAs ile S. aureusiçin hedef olmalıdır ve CSP yapı gRNAs ile S. pyogenes için özgüllük hedefleme için hedef olmalıdır.
Doğru sonuçlar ve doğru dimerization emin olmak için bu da CLOuD9 yapıları, iletim takip hücresel ortamlar tazeliğini korumak önemlidir. Günlük medya değiştirmek ve taze dimerizer (veya kontrol) eklenmesi tamamlayıcı yapıları yakınlık içinde kalır ve değiştirilmiş kromatin biçimi korumak sağlar. Ayrıca, ABA taze ve uygun şekilde (6 ay, soğuk, ışıktan korunan muhafaza açılır) üreticinin protokolüne göre depolanan garanti otantik sonuçları elde etmek için esastır.
Özellikle, daha yaygın olarak kullanılan FRB ve FKBP sistemi yerine CLOuD9 ABA dimerizer ABI ve PYL dimerization proteinler ile kullanıldı. Bir rapalog gerekliliği FRB/FKBP sistemi için CLOuD9, uygulanabilirliği için kanser hücrelerinin zehirlenmesi nedeniyle sınırlı. Alternatif ABI/PYL sistemi etkili bir şekilde daha geniş kullanılabilecek olmak CLOuD9 etkinleştirme bu sınırlama hile.
Topluca, biz CLOuD9, zorla ama geri dönülebilir olarak kişiler arasında uzun menzilli hedef genomik loci oluşturmak benzersiz ve güçlü bir teknoloji geliştirdik. Kromatin döngüler inducing aracılığıyla, biz de CLOuD9 gen ekspresyonu uygun hücresel bağlamda değiştirmek için kullanılması gereken göstermek. Sınırsız çalışma bölgeleri döngüye veya mekanizmaları döngü ile ön bilgi gerek kalmadan herhangi bir iki genomik loci arasındaki etkileşimler için teknolojiye uyum sağlar. Buna ek olarak, CLOuD9'ın benzersiz gösterdiği reversibility daha fazla döngü mekanizmaları incelenmesi hastalık ve geliştirme sağlar. Kromatin döngü hedef üzerinde etkilerini açıkça göstermiştir, orada iken henüz hedef üzerinde döngüler hedef kapalı döngü ve sonraki etkisi etkileri içgörü sunan veri olmak.
Bizim veri bu araç sadece birkaç uygulamaları göstermektedir ancak kromatin düzenleme gen ifadesi göstergesidir büyük temel fikir anlamına gelir. Bizim teknoloji çalışma ve gen düzenlemesi, böylece genlerin transkripsiyon katlama kromatin rolü genel anlayışı artırma kromatin yapısında nüansları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Transkripsiyon dynamics inceliklerini daha iyi anlaşılmasını araştırma ve tedavi kanser, kalıtsal hastalıklar ve konjenital bozukluklar, hangi farklı kromatin derleme şüphesiz gen ifade20değiştirir şekilde yol açabilir, 21,22,23. Sonraki çalışma CLOuD9 teknoloji kullanarak daha fazla düzenleme ve kromatin etki alanları ve nasıl onlar istikrarlı gen ekspresyonu geliştirme ve hastalık sürdürebilmek için katlama sürücü dinamiklerini ayrıntılarını yanacaktır.

Gen ifade1,2ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir gibi çekirdek ve belirli genom organizasyonu katlama kromatin arasındaki ilişki son yıllarda önemli ilgi topladı vardır. Gen etkinliğini ve modülasyon kromatin yapısının kesin ilişkisi belirsiz durumda olduğu sürece, bu dinamik üç boyutlu kromatin organizasyon sonucunda kromozom kişiler arasındaki etkileşimler hizmet onaylanmadığına karar bir gen düzenleyici fonksiyonu3. Gerçekten de, böyle bir etkisi de nerede odağı kontrol bölgesi (LCR) etkinliği globin genleri ile gelişimsel olarak belirli bir şekilde kromatin döngü arasında iki bölgeden4oluşturarak düzenleyen insan globin gen odağı, kanıtlanmıştır. Ancak, hem bu ve diğer bölgelerde, bu kromatin döngü bir neden ya da Gen ifadesinin içinde değişiklikler sonucu olup olmadığı belli değildir.
Şimdiye kadar bu olay eğitim sorunlar çözümsüz. Örneğin, kromatin döngüler inducing diğer girişimleri doğrusal DNA dizisi veya arka plan bilgisi döngü5,6kolaylaştırmak belirli öğeler üzerinde çok miktarda gerektiren karmaşık prosedürler değiştirme dahil, 7,8. Ayrıca, önceki çalışma o kromatin sürücü gen ekspresyonu belirli ve sınırlı içerik7,döngüler önerdi iken8, hangi kromatin döngü transkripsiyon küresel etkiler düzeyi belirsizdir. Uzun menzilli gen ekspresyonu üzerinde döngü etkisini ilgi sürekli son yıl içinde büyüdü rağmen kurulması ve gen etkinliği değiştirmek için Kromatin kişiler istinat hakkında cevapsız sorular devam etmektedir.
Biz si mühendislik teknolojisi nükleaz eksik kümelenmiş ilişkili düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) - CRISPR - protein 9 (dCas9), genel olarak uygulanabilir herhangi bir genomik loci9/ hedefleme için izin vermek için kullanır. Bu teknoloji doğrusal DNA dizisi değişiklikler ile ilgili karmaşık sorunları ortadan kaldırır ve belirli döngü bileşenlerinin önemli ön bilgi olmadan erişilemez. En önemlisi, evrensel ve geniş olduğu gibi hastalıklar, kanser gibi çeşitli geliştirme de tanınan kromatin döngüler için geçerli bir araçtır. CLOuD9 gücünü geri dönülebilir olarak etkili bir şekilde gen ekspresyonu modüle döngüler yapısını değiştirerek gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 ve nbsp; medya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875-119</td><td>K562 hücre kültürü</td></tr><tr><td>için DMEM ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995-065</td><td>1X, 293T hücre kültürü</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>için Addgene plazmid</td> <td># 52961</td><td>CLOuD9 plazmit gelişimi için</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plazmid</td> <td># 12253</td><td>Lentivirus üretimi için</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plazmid</td> <td># 12259</td><td>Lentivirüs üretimi için</td></tr><tr><td>pMDLg / pRRE</td><td>Addgene plazmid</td> <td># 12251</td><td>Lentivirus üretimi için</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>lentivirüs üretimi için</td></tr><tr><td>anti-HA antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>3724</td><td>İmmünopresipitasyon</td></tr><tr><td>için anti-Bayrak antikoru</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td> immünopresipitasyon</td></tr><tr><td>DNeasy Kan ve Doku Kiti</td><td>DNA ekstraksiyonu için</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyonu için</td><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td></tr><tr>RNA <td>ekstraksiyonu için</td><td>RNeasy Kiti</td><td>Qiagen</td><td>74106</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>cDNA için&nbsp;</td></tr><tr><td>qPCR analizi için</td> <td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td></tr><tr><td>QPCR analizi için</td><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me3 antikoru</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anti-RNA için anti-RNA Pol-II antikoru</td><td></td><td>ChIP-qPCR</td><td></td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörü</td><td>için Aktif Motif</td><td></td> 61083 <td>Protein için 11873580001 ekstraksiyon</td></tr><tr><td>% 4-12 Tris Glisin jel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Herhangi bir boyut, batı lekesi</td></tr><tr><td>için anti-Tavşan HRP antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>anti-fare HRP antikoru</td><td>için Hücre Sinyalizasyonu</td><td>7076S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>K562 ve H3K293 için ChIP-Seq verileri</td><td>Kodlama</td><td>ENCSR000AKU</td><td>ChIP-seq analizi için</td></tr><tr><td>K562 ve H3K293 ChIP-Seq verileri</td><td>Kodlama</td><td>ENCSR000APE</td><td>ChIP-seq analizi için</td></tr><tr><td>K562 ve H3K293 ChIP-Seq verileri</td><td>Kodlama</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>ChIP-seq analizi için</td></tr><tr><td>K562 ve H3K293 ChIP-Seq verileri</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>ChIP-seq analizi için</td></tr><tr><td>İmmünopresipitasyon için Dynabeads Protein A İmmünopresipitasyon için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G için İmmünopresipitasyon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>İmmünopresipitasyon</td></tr><tr><td>RNA Temiz ve RNA saflaştırması için Konsantratör-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Pierce %16 Formaldehit Metanol içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>PX458 Plazmid</td> Çapraz bağlama için <td>Addgene</td><td>48138</td><td>gRNA klonlaması için önerilen aktif Cas9 plazmidi, ancak herhangi bir aktif Cas9 plazmidi</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>PCR</td><td>saflaştırması</td><td></td></tr> <tr>için Qiagen 28104<td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları için</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td>için 10X FastDigest Tampon Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td>için QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td>için 10X T4 Ligasyon Tamponu</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td>için T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td>için 2X Hızlı Ligaz Tamponu</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td>için Hızlı Ligaz</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Klonlama kılavuzu RNA'ları</td></tr><tr><td><güçlü>Tamponlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham lizis tamponu</td><td></td><td></td><td>%1 Tris-Cl pH 8.0, %1 SDS, %1 proteaz inhibitörü su çözeltisi (EDTA olmayan) ve su içinde 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Modifiye RIPA tamponu</td><td></td><td></td><td>%1 NP40/Igepal, %0.5 sodyum deoksikolat, %0.1 SDS, 1 mM EDTA ve %1 proteaz inhibitörü su çözeltisi (EDTA olmayan) PBS pH 7.8 veya 7.4</td></tr><tr><td>IP seyreltme tamponunda</td><td></td><td></td><td>%0.01 SDS, %1.1 Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, %1 NP-40 ve %1 sodyum deoksikolat</td></tr><tr><td>Şişme tamponu</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potasyum asetat, 15 mM magnezyum asetat, %1 NP-40</td></tr><tr><td>Seyreltme tamponu</td><td></td><td></td><td>%0.01 SDS, %1.1 Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 ve 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>IP elüsyon tamponu</td><td></td><td></td><td>%1 SDS, %10 NaHCO<alt>3 </alt>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma crispr-aracılı

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Son çalışmalar açıkça etkileşimleri oyun ama döngü sorumlu olup veya gen ifadesinde değişiklikler sonucu Gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli rol hala döngü bu uzun menzilli, üç boyutlu kromatin göstermiştir bilinmeyen. Yakın zamana kadar gen etkinliğini ve hücresel fonksiyon Yönetmeliği etkilemesi kromatin döngü görece belirsiz oldu ve sınırlamalar bu yapıların işlemek için varolan yöntemleri bu etkileşimler derinlemesine incelenmesi engelledi. Bu belirsizlik gidermek için biz bir yöntem seçici ve tersinir kromatin döngü yeniden yapılanma için mühendislik CRISPR-dCas9 (CLOuD9) kullanarak. Dinamizm CLOuD9 sisteminin CLOuD9 yapıları yerel kromatin conformation modüle genomik loci hedeflemek için başarılı yerelleştirme tarafından kanıtlanmıştır. Önemlisi, indüklenen ilgili ters ve endojen kromatin uyum geri yükleme olanağı da doğrulanmıştır. Bu yöntemle Gen ifadesinin modülasyon hücresel gen ekspresyonu düzenleyecek kapasitesi kurar ve istikrarlı de novo belirgin gen etkiler kromatin döngüler oluştururken bu teknolojinin uygulamalar için büyük bir potansiyel altını çiziyor kanser ve geliştirme bağlamlarda ifadesi.

Kromatin döngü gen düzenlemesi içinde önemli bir rol oynar; Ancak, kromatin döngüler seçici ve tersinir değişikliği için izin hiçbir teknolojik gelişmeler olmuştur. Burada biz kromatin döngü yeniden yapılanma için güçlü bir sistemi tarif CRISPR-dCas9 (CLOuD9), seçmeli olarak ve geri dönülebilir olarak gen ekspresyonu, modüle gösterdi kullanarak hedef loci.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Bu yöntem, gen ekspresyonu ile ilgili anahtar soruları cevaplamamıza yardımcı olabilir ve kromatin yapısının gen ekspresyonunu tam olarak nasıl etkilediğini ve kromatin organizasyonunun transkripsiyonel dinamikleri nasıl düzenlediğini bize gösterir. Bu teknolojiyi geliştirdik çünkü uzun menzilli kromatin döngüsünün yaratılmasını sağlamak için kromozom mimarisini kontrol edilebilir şekilde değiştirmek istedik. Aynı zamanda endojen kromozom yapısını geri yüklemek için kromatin bağlamını tersine çevirme yeteneğine sahipken.Bu yöntem kullanım kolaylığı ve geniş uygulanabilirlik için tasarlanmıştır. Sistemin daha geniş bir şekilde kullanılabilmesi için toksik olmayan bir dimerizer ve ortogonal dcas9 türlerinden yararlandık. Bu yöntemi geliştirdik çünkü gen ekspresyonunun kromozom mimarisine mi yoksa kromozom yapısının gen ekspresyonunda değişikliklere yol açıp açmayacağı sorusuna cevap verebilmek istiyorduk.CRISPR-guide RNA dizilerinin tasarımı ve hücre kültürlerinin bakımı metin protokolünde açıklanmıştır. Plazmid haritaları ve kullanılan astarlar burada listelenmiştir. Plazmid hazırlamaya, merceksi CRISPR plazmidin beş mikrogramını üç mikrolitre BsmB1 üç mikrolitre alkali fosfataz altı mikrolitre 10x sindirim tamponu ve 0.6 mikrolitre yeni hazırlanmış 100 milimular DTT ile karıştırarak başlayın.Toplam hacmi 60 mikrolitre çift distile suya getirin ve plazmidi sindirmek ve fosforilat etmek için karışımı 37 derecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Sonra, jel döngü plazmid ve çift distile su sindirilmiş plazmid arındırmak. Daha sonra, kılavuz RNA çiftleri için annealing reaksiyonları hazırlayın.10x T4 ligasyon tamponunun bir mikrolitresi ile 100 mikromografide her kılavuz RNA'nın bir mikrolitresini ve 10 mikrolitrelik toplam reaksiyon hacmi için 0,5 mikrolitre T4 PNK'yi birleştirin. Kılavuz RNA çiftlerini hedef dizilerine yönlendirmek için karışımları 30 dakikada 37 derecede kuluçkaya yatırın ve ardından 95 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın ve dakikada 5 derece düşürerek sıcaklığı kademeli olarak 25 dereceye düşürün. Daha sonra, çift distile su da bir ila iki yüz annelik kılavuzu RNA seyreltmek.Şimdi, iki ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Seyreltilmiş perivaneal kılavuz RNAse 2.5 mikrolitre 2x ligasyon tampon bir mikrolitre çift distile su ve ligaz 0,5 mikrolitre ile sindirilmiş plazmid bir mikrolitre karıştırın. BsmB1 sindirilmiş plazmid kılavuzlarını sıvılaştırmak için reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Sonra kararlı üç bakteri içine yeni ligated plazmid dönüştürmek ve herhangi bir plazmid hazırlama yöntemi kullanarak bakterileri yükseltmek. Altı kuyulu bir tabakta, her iyi, tohum 750, 000 2n3 Tcells DMEM ile 10% FBS ve% 1 kalem strep. Her yapı için bir kuyu kullanın ve 24 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, % 10 FBS ile taze antibiyotik serbest DMEM için orta değiştirin. Kaplamalı hücrelerin her kuyu için orta değiştirdikten hemen sonra Lentivirus üretim karışımı bir tüp hazırlamak. Her reaksiyon için, her reaksiyon için Opti-MEM ortamının 150 mikrolitresi ile 11 mikrolitre lipid-baz transfeksiyon reaktifini seyreltin.Sonra ayrı tüpler DNA hazırlamak. CLOud9 lentiviral vektör plazmid iki mikrogram diğer lentiviral ambalaj bileşenleri iki mikrogram ile birleştirin. Opti-MEM ortamının 150 mikrolitresinde bu karışımı seyreltin.Daha sonra seyreltilmiş lipid bazlı transfeksiyon reaktifinde seyreltilmiş lentiviral plazmid karışımının eşit hacimli birliğini birleştirin ve karışımları oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra hücrelerin her kuyuya hazırlanan karışımlardan bir tüp ekleyin ve kuluçkaya devam edin. 48 saat sonra, plaka kuyularından viral üretim ortamını koniklere aktarın ve 5 dakika boyunca 300 g'da aşağı doğru döndürün.Sonra peletli enkaz atmak için taze tüpler için supernatant aktarın. Şimdi, hemen hedef hücreleri transduce veya gelecekteki kullanım için 80 santigrat derecede dondurmak için viral üretim ortamı kullanın. Bu durumda, 80, 000 hücre içeren 50 mililitrelik konik tüp tamamlayıcı CLOud9 plazmidler oluşur ilgi her viral yapı, 250 mikrolitre ekleyerek başlayın.Sonra çözeltide mililitre başına bir ila sekiz mikrogram arasında olması için yeterli Polibrene ekleyin. Daha sonra antibiyotiksiz ortam kullanarak her tüpteki toplam hacmi bir mililitreye ayarlayın. Şimdi virüs parçacıkları ve hücreler arasındaki teması artırmak için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 800 g hücreleri spin.Daha sonra borulama ile supernatant hücreleri yeniden askıya. Daha sonra, hücrelerin süspansiyonu kültür plakalarına yükleyin ve 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücreleri toplamak.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g santrifüj ve normal ortamda yeniden askıya alın. Ertesi gün, iki kat transe hücreleri seçmek için orta puromisin ve higromisin ekleyin. Her hücre tipi için uygun antibiyotik konsantrasyonu önceden belirlenmelidir.Daha sonra, aşağı akış uygulamaları ile devam etmeden önce en az üç gün için seçim medya hücreleri kuluçka ve hücreleri ve seçim ortamı korumaya devam. CLOud9 seçilen ve transduced hücreleri dimerize için kültür çanak bir milimolar ABA ekleyin. Denetimler için DMSO'yu ekleyin ve deneme süresince ABA veya DMSO ile hücreleri koruyun.Karartma tersine çevirmek için hücreleri plakayüzeyini iki kez kaplayacak kadar PBS ile yıkayın. Bundan sonra, ABA-free medya kültür hücreleri bir dimerized devlet onları korumak için. CLOud9 sisteminin uygun kullanımı tamamlayıcı CSA ve CSP CLOud9 geri dönüşümlü temas neden hücre kültürü medya ABA eklenmesi veya kaldırılması yoluyla inşa eder.CSA ve CSP yapıları standart CRISPR kılavuzu RNAAse kullanılarak uygun genomik bölgelere lokalize edilebilmektedir. Her CLOud9 bileşeninin hedeflenmesinde doğru lokalizasyonu sağlamak için nicel PCR ile takip edilen kromatin immünopreplasyonu kullanılmıştır. Ayrıca aba ile ve ABA olmadan koimmünpresipasyon ligand varlığında CSA ve CSP dimerization yanı sıra ligand yokluğunda geri döndürülebilirlik doğrulanmış.ABA dimerizasyondan sonra beta-globin ile LCR arasındaki daha fazla temas kromozom onayı yakalama ile ölçüldü. Ancak, bu sadece CSA veya sadece CSP yapı içeren kontrollerde gözlenmedi. LCR beta-globin etkileşiminin oluşturulması endojen LCR globin temasından tamamen elenmedi.Yalnızca orijinal ilgili bağlantıya eklendi. Beta-globin LCR kontaklarında artış, hedeflenen LCR veya beta-globin destekçi söyör bölgesi içinde tam bölgeye bakılmaksızın 72 saatlik dimerizasyon ile gözlendi. Son olarak, aba çıkarıldıktan sonra kromozom onayı yakalama ile sistemin geri döndürüleme doğrulandı.Bu endojen onay tam yenilenmesi ile sonuçlandı. Bu yordamı çalışırken, medya değiştirmek ve taze dimerized CLOud9 transduced hücreleri her gün eklemek hatırlamak önemlidir. Lentivirus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve BSL 2'de kullanılan tüm önlemler bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.

crispr-mediated-reorganization-of-chromatin-loop-structure

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Protokol, plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu kullanılarak insan hücre hatlarında Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı epigenom düzenleme yöntemlerini açıklar.

Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır .

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Öğrenin, CRISPR-dCas9 CLOuD9 sistemi ile kromatin döngü yapısını seçici ve tersinir şekilde yeniden düzenleyerek gen ifadesi dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, kromatin organizasyonunun transkripsiyonel düzenlemeye etkisini araştırır.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Daha fazla video keşfet