Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Bu yöntemin amacı, klinik öncesi çalışmalar için biyolojik olarak ilgili kanser ortotopik ksenogreftleri oluşturmaktır. Hasta kaynaklı nöroblastom hücreleri, açık cerrahi veya uzun süreli iyileşme olmaksızın ultrason rehberliğinde murin adrenal bezine enjekte edilir. Bu yöntem, kanser biyolojisinde ve tümör evrimi çalışmaları, doğal mikro çevredeki terapötik yanıtlar ve metastazlar gibi translasyonel araştırmalarda kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Böyle bir bilgi, klinik öncesi çalışmaların güvenilirliğini büyük ölçüde artıracak ve ilaç keşfini kolaylaştıracaktır. Bu tekniğin temel avantajı, kanser tedavisi araştırmaları için ortotopik ksenograflı bir model üretmede hastadan türetilmiş, dokuya yönelik, verimli ve güvenilir olmasıdır. Prosedürdeki kritik adımları gösteren, kıdemli bir teknisyen ve laboratuvar yöneticimiz olan Sahiti Chukkapalli ile laboratuvarımızda araştırma görevlisi olan Tina Thomas olacaktır.

Bir tümör ayrışma kiti kullanarak tümör dokusundan hastadan türetilmiş tek bir kanser hücresi süspansiyonu oluşturun. Yaklaşık yarım gram tümör dokusunu, beş mililitre enzim takviyeli RPMI tamponu içeren 100 milimetrelik bir hücre kültürü kabına aktararak başlayın. Ardından, tümörü iki ila dört milimetrelik küçük parçalar halinde doğramak için makas ve doku forseps kullanın.

Tümör karışımını bir ayrışma tüpüne pipetleyin ve tüpü kapatın. Tüpü ters çevirin, bir doku ayırıcının manşonuna takın ve uygun programı kullanarak dokuyu ayırın. Ayrıştıktan sonra, tümör hücresi süspansiyonunu bir saat boyunca 37 santigrat derecede dönen bir raf üzerinde inkübe edin.

İnkübasyon sırasında hücre süspansiyonunu her 15 dakikada bir triture edin. İnkübasyonun ardından, hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve 10 mililitre RPMI ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 314 g'de beş dakika santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti beş mililitre RPM'de askıya alın. Hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve süzülmüş çözeltiyi 50 mililitrelik taze bir tüpe toplayın. Süzgeci beş mililitre RPMI ortamı ile yıkadıktan sonra, bir pelet toplamak için hücre süspansiyonunu 314 g'da beş dakika santrifüjleyin.

Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, 10 mikrolitre hacim başına dört kez 10 ila beş hücrelik bir nihai konsantrasyon elde etmek için peleti RPMI'de askıya alın. Enjeksiyon başına bu hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini yeni bir tüpe ve her enjeksiyon için 10 mikrolitre hücre çözeltisi yapmak için aynı hacimde bazal membran matrisine aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.

Fareyi karın tarafı aşağı bakacak şekilde görüntüleme platformuna aktarın. İzofluran anestezisini sürdürmek için burun konisini takın ve sabitleyin. Uygun şekilde anestezi uygulanmış altı ila sekiz haftalık bağışıklık eksikliği olan NSG faresinin sırtını ve yanını epilasyon için epilasyon losyonu ve tıraş makinesi kullanarak implantasyon prosedürüne başlayın.

Kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine optik merhem sürün. Ardından, herhangi bir yanlışlıkla hareket etmesini önlemek için fareyi yerine bantlayın. Ardından, murin karaciğeri, vena kava, dalak, sol böbrek ve bitişik sol adrenal bezi tanımlamak için ultrason görselleştirmesini kullanın.

10 mikrolitre hücre çözeltisi ile küçük delikli bir iğne ile donatılmış soğutulmuş bir Hamilton şırıngası yükleyin. Daha sonra, ultrason rehberliğinde, hücresel enjeksiyon için bir kanal sağlamak üzere soğutulmuş 22 gauge bir kateteri cilt ve sırt kasından doğrudan sol adrenal beze nazikçe yerleştirin. İğneyi çıkarın ve kateteri yerinde bırakın.

Kateterin yerleştirilmesi boyunca adrenal bezin, iğne ve yörüngesi ile birlikte görselleştirilmesi, çevredeki yapılara ve organlara minimum yaralanma ve daha düşük murin morbiditesini sağlamak için zorunludur. Ardından, şırıngayı adrenal bezin merkezine yerleştirilmiş kateterden geçirin. Şırınga kateter boyunca yönlendirilirken, kateter stabilitesini korumak ve iğnenin ilerlemesini izlemek önemlidir.

İğnenin kendisinin kateterin sonlandırılmasının yaklaşık iki milimetre ötesine uzandığını, pozisyonunun ultrasonda kolayca görülebildiğini unutmayın. Hücreleri hedeflenen adrenal dokuya enjekte edin. Bazal membran matrisinin sertleşmesine izin vermek için iğneyi bir ila iki dakika yerinde bırakın.

Bazal membran matrisi sertleştikten sonra, iğneyi yavaşça çıkarın, ardından kateter çıkarılsın. Son olarak, fareyi, ev kafesine dönmeden önce sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bir kurtarma kafesine yerleştirin. Ultrason görüntüleme, in vivo tümör ilerlemesini izler.

Bu görüntü, enjeksiyondan bir hafta sonra adrenal bezin ultrason görüntüsünü göstermektedir. Burada, enjeksiyondan bir hafta sonra nöroblastom enjekte edilen bir farenin lüminesans görüntülemesi, tümör aşılanmasını göstermeyen okumaları göstermektedir. İki hafta sonra, ultrason görüntüleme, tümör aşılamasını ve yaklaşık 40 milimetre karelik bir alana ilerlemesini gösterir.

Enjeksiyondan iki hafta sonra biyolüminesans, ultrason bulgularıyla ilişkili hücre alımını ve tümör büyümesini düşündüren 10 ila yedinci arasında bir parlaklık gösterdi. Enjeksiyondan sekiz hafta sonra yapılan ultrason görüntülemesi, 100 milimetre kareden daha büyük bir alan ölçümü ile tümör büyümesinin devam ettiğini gösterdi. Yine biyolüminesans, ultrason bulgularını 10 ila dokuz arasında artan parlaklık seviyeleri ile doğruladı.

Tümörün 3 boyutlu ultrason görüntülemesi, laboratuvarımızın klinik öncesi terapötik çalışmaların başlatılması için kullandığı temel değer olan 100 milimetreküpten daha büyük bir hacim gösterdi. Eksize edilen tümör, ultrason ölçümleri ve lüminesans sinyalleri ile ilişkili olarak bir santimetreden daha büyük olarak ölçüldü. Bu besiyeri, ultrason rehberliğinde hastadan türetilmiş nöroblastom hücreleri ile adrenal ortotopik ksenografların nasıl başarılı bir şekilde kurulacağının gösterilmesini sağlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa enjeksiyon başına 12 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.