Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Bu yöntem, DNA polimerleri, aslına uygunluk ve DNA onarımı alanında, düzeltme yöntemleri ve analiz gibi temel soruların yanıtlanmasına ve DNA onarım yamasının tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok spesifik, basit, hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay olmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, DNA replikasyonunda hala kendileri nedeniyle mücadele edeceklerdir ve onarım alanı, kütle spektrometresi enstrümantasyonuna ve veri yorumlamasına aşina olmayabilir.

Bence en önemlisi, mutasyon ve atama gibi klinik uygulamalar için ticari olarak geliştirilen kütle spektrometresinin DNA düzeltme okuması ve onarım çalışması için nasıl uygun bir şekilde uyarlanabileceğini gösterebileceğimiz için görsel gösterimin çok kritik olmasıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan Rong-Syuan ve Kuei-Ching yüksek lisans öğrencileri olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi astar ve şablon hazırlama ile başlayın.

Örnek olarak, düzeltme okuması için alt tabaka P21 ile T28'in bir TG uyumsuzluğunu kullanın. P21 astarını ve T28 şablonunu mikrolitre başına 12.5 pikorole su ile seyreltin. Daha sonra, 12 mikrolitre seyreltilmiş astar ve 12 mikrolitre seyreltilmiş şablonu 1.5 mililitre sterilize edilmiş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü sıkıca kapattıktan sonra, tüpü 65 santigrat derece kapalı bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Ardından, 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Ve son olarak, uygun bir tavlama sağlamak için tüpü buzun üzerine yerleştirin.

1.5 mililitrelik sterilize edilmiş bir mikro santrifüj tüpüne sekiz mikrolitre astar ve şablon karışımı, iki mikrolitre 10x düzeltme reaksiyonu tamponu, dört mikrolitre 4ddNTP karışımı ve 18 mikrolitreye kadar su ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. DNA polimerazı buz gibi 1x düzeltme reaksiyonu tamponunda istenen konsantrasyona seyreltin.

Seyreltilmiş enzimi her zaman buz üzerinde saklayın. Mikro santrifüj tüpünü substrat karışımı ile istenen reaksiyon sıcaklığına kadar önceden ısıtın. Daha sonra, seyreltilmiş DNA polimerazın iki mikrolitresini önceden ısıtılmış substrat karışımına aktarın ve içeriğini karıştırmak için tüpü hafifçe vurun.

Reaksiyonların bileşenlerini döndürmek için tüpleri enzim ve substrat ile ortam sıcaklığında 3200 kat yerçekiminde birkaç saniye santrifüjleyin. Reaksiyonu hemen istenen inkübasyon sıcaklığında bir ısıtma bloğuna veya bir su banyosuna aktarın. Reaksiyonu sonlandırmak için, eşit hacimde tamponlanmış fenol ekleyin ve reaksiyonu birkaç saniye girdaplayarak karıştırın.

Daha sonra, reaksiyonu beş dakika boyunca ortam sıcaklığında yerçekiminin 3200 katı olan bir mikro santrifüjde santrifüjleyin. Sulu fazı temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve eşit hacimde kloroform ekleyin. Birkaç saniye girdaplama ile karıştırdıktan sonra, numuneyi üç dakika boyunca ortam sıcaklığında 3200 kat yerçekiminde bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin.

Sulu fazı temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Reaksiyonu 95 santigrat derecede beş dakika inkübe ettikten sonra, tüpü buzun üzerine yerleştirin. Ardından, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi 384 oyuklu bir plakada tuz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için reçine ilavesi yapın.

Numune plakalarını nanolitre dağıtıcıya yerleştirin. Matris çipini ve hazırlanan 384 oyuklu plakayı ilgili tepsiye yerleştirin. Çipe gelen reaksiyon ürünlerini tespit etmek için nano dağıtıcıyı çalıştırın.

Başlamak için nano dağıtıcının dokunmatik ekranındaki çalıştır düğmesine basın. Çip üzerindeki toplam lekeli hacmin yaklaşık beş ila 10 nanolitre olduğundan emin olmak için ekranda doygunluk bilgilerini içeren numune noktalarının otomatik olarak yakalanan görüntüsünü kontrol edin. Hacim yetersizse numune lekelemesini tekrarlayın.

İçe aktarmak için beklenen sinyal bilgilerini içeren Excel formatında bir dosya hazırlayın. Tasarımcı formatında tahlil grubuna sağ tıklayarak uygulama programında yeni bir tahlil oluşturun ve tanımlayın ve Excel dosyasını seçin. Ağacın üst kısmına sağ tıklayarak ve ona bir dosya adı vererek ekranın sol tarafındaki müşteri proje plakası seçenek ağacı aracılığıyla hedef tahlil plakasını oluşturun.

384 kuyulu plaka tipini seçin ve Tamam'a basın. Boş bir plaka görünecektir. Ekranın sol tarafında uygun tahlili seçin. Kuyuyu vurgulayarak ve plex ekle'yi seçmek için sağ tıklayarak çip üzerindeki her bir lekeli numune konumu için seçilen testi atayın.

Ardından, çip üzerindeki tüm testlerin çalışma listesini Excel formatında başlık olmadan hazırlayın. Yeni örnek proje ekle seçeneği aracılığıyla çalışma listesini içe aktarın. Testi ve çalışma listesini P21T28 testinin her bir konumuna atayın ve sağ tıklayarak seçin.

Uygulama programını kullanarak kütle spektrometresini çipe bağlayın. Ekranın sağ tarafındaki varsayılan ayarı seçin. Çipin köşesindeki tahlil adını ve çip kimliğini doldurun.

Ayarları kaydedin ve MS kontrol programını başlatın. Giriş/çıkış düğmesine basın ve keşif plakasını çıkarın. Benekli çipi keşif plakasına yerleştirin ve benekli çipin kütle spektrometresine girmesi için giriş/çıkış düğmesine basın.

Kütle spektrometresini başlatmak ve verileri elde etmek için uygulama programının edin" butonuna tıklayınız. Veri analizi için programı açın. Sol üst köşedeki veritabanının ağacına göz atın ve çip kimliğini seçin.Ekranın sağ tarafındaki veri dosyasını açın.

Kütle spektrumunu görüntülemek için spektrum simgesine tıklayın. Belirli bir kütle aşırı yük aralığını kırpmak için, özelleştirme iletişim kutusunu seçmek için sağ tıklayın. Yeni pencerede, x eksenine tıklayın ve istenen üst ve alt limiti ayarlayın ve spektrumun belirtilen aralığını göstermek için Tamam'a basın.

Dışa aktar'a sağ tıklayarak kayıt tutma için spektrumu dışa aktarın. JPEG dosya türünü seçin, hedefe tıklayın, diske gözat'ı seçin, dosya adını yazın ve ardından dışa aktar'a tıklayın. Veri ölçümü için imleci kullanın ve sol üst köşede tepe yüksekliğini göstermek için zirveye tıklayın.

MALDI-TOF MS'de Oligonükleotid kütlesindeki pik yoğunluğu arasında ters bir ilişki vardır. 17 ila 24 nükleotidden oluşan oligonükleotidler bir MS analizine tabi tutuldu. Bağıl sinyal yoğunlukları hesaplandı ve düzeltme okuması veya onarım testinin nicelleştirilmesi için kullanılabilir.

Hem şablon hem de astar sinyalleri kütle spektrumunda bulunabilir. Boyut farklılıkları nedeniyle, şablonlardan gelen sinyaller ve bunların spesifik olmayan kısmi bozunma ürünleri, uyumsuz astarlardan ve düzeltme ürünlerinden iyi bir şekilde ayrıldı. Burada, beş dakika TG.At üç asal terminalin bir redaksiyonu gösterilmektedir, düzeltilmiş ürün, eksizyon ürünü için %17'ye karşı %23 idi.

Bu fark 20 dakikada %14'e karşı %69'a yükselmeye devam etti. MS'in yüksek çözünürlüğünün, alt düz ve ürün sinyallerini yalnızca 32'lik bir kütle aşırı şarj farkıyla net bir şekilde ayırdığına dikkat edin. Ayrıca, bir kalem nihai TG redaksiyonu için iki tür eksizyon ürünü kolayca çözülebilirdi.

Bir nükleotid eksizyon ara maddesi ve iki nükleotid eksizyon ürünü. Dahili uyumsuzlukların düzeltilmesi, düzeltme okuma verimliliğinde net bir eğilim gösterdi. Büyük bir düzeltme ürünü konuşmasıyla kanıtlandığı gibi, alt düzlüklerin üç asal uçtan son, sondan bir önceki, üçüncü ve dördüncü nükleotidlerde uyumsuzlukları olduğunda, diğer pozisyonlardaki uyumsuzluklara kıyasla artan verimlilik gözlendi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, farmasötik araştırmalar için yeni bir ilaç keşfetmek ve icat etmek için polimeröz redaksiyon heapiter taraması gibi diğer uygulamalar gerçekleştirilebilir. Bu teknik aynı zamanda DNA replikasyonu ve onarımı alanındaki araştırmacıların cücenin tıbbı ve tüm canlı organizmalar için sadık replikasyonu hakkında daha fazla bilgi edinmelerinin yolunu açıyor.

Bu videoyu izledikten sonra, MADI-TOF kütle spektrometresi analizi kullanılarak DNA düzeltme okumasının ve onarım testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Sfeno-kloroform ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu giysiler giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Metindeki alternatif protokol daha güvenli bir alternatif olarak düşünülebilir.