Name: Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Öğrenin, MALDI-TOF kütle spektrometrisi ve tek nükleotid uzama stratejisi kullanarak DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım analizini. Bu yöntem, 9 nükleotidden kısa onarım yamalarını hızlı ve spesifik bir şekilde değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

İşlevsel Genomik (Taipei, Tayvan) ve teknik destek için NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Tayvan) için NCFPB entegre çekirdek tesis teşekkür ederiz. Bu eser Tayvan Sağlık Vakfı (L-I.L.) ve Bakanlığı Bilim ve teknoloji, Taipei, Tayvan, ROC [en 105-2320-B-002-047] Wei-Yao Hu için gelen araştırma hibe tarafından desteklenen [en 105-2628-B-002-051-MY3] Kang-Yi Su ve [için most-105-2320-b-002-051-my3] Liang bileşenini Lin için.

1. astar/şablon hazırlama
<ol><li>Astar/şablonlar % 40 ve % 60 olduğu gibi bir sıralama veya PCR astar tasarım arasında dengeli bir G + C içerik ile tasarlayın. 18-21 astar kullanmak için uygun bir tavlama ve daha iyi MS sinyalleri nt.</li>
	<li>Tasarım şablonu olarak erime sıcaklığı en az 7 ile çift yönlü bölge için en az 50 ° C ayarlayarak sinyalleri astar ve şablon arasında ayırmak için nt 5'-çıkıntısı. Not: Örneğin, substrat P21/T28 Tablo1 için 21-nt astar 28-nt şablonu ile eşleştirilmiş olan. Seçenek: son 4 fosfodiester bağları sonunda 3' şablonu değiştirmek için nükleaz dayanıklı phosphorothioate tahvil gibi alternatif nükleik asitleri kullanımı mümkün bir non-spesifik 3' uç bozulması şablonları ( tarafından etkilenmemesi Örneğin, Tablo 1' deki T28S4), her ne kadar bu bazı maliyet şablonu hazırlama için ekler.</li>
	<li>Standart desalted oligonucleotides daha fazla arıtma olmadan kullanarak bu çalışma için tatmin edici. H2O 100 pmol/µL bir konsantrasyon bir hisse senedi olarak, oligonükleotid astar/şablonlarını kullanın ve -20 ° C'de saklayın Kalite ve saflık astar ve şablonları MALDI-TOF benzersiz en yüksek sinyalleri ve iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için MS (adım 4-7) oligonucleotides çalıştırarak denetlemek.</li>
	<li>Göreli MALDI-TOF MS sinyal yoğunluklarda (7. adım), kalibrasyon ve konsantrasyon normalleştirme (Şekil 2) için tepki olarak ilgili serilerini eşit molar astar belirlemek.</li>
</ol>2. reaksiyonlar yazım denetleme
Not: Aynı prova-okuma reaksiyon durumu ve iletişim kuralı uygular a DNA onarım için-ben G-ben C-ı ve T-ben.
<ol><li>Substrat P21/T28 bir T-G uyumsuzluk proofreading Tablo 1 örnek olarak kullanarak, astar P21 ve şablona 12,5 pmol/µL H2O ile T28 seyreltik; o zaman 12 µL seyreltilmiş astar ve 12 µL seyreltilmiş şablonunun 1.5 mL steril microcentrifuge tüp transferi. Not: Şablon/astar mix 2 Tepkiler için yeterli miktarıdır; orantılı olarak buna göre reaktifleri hacmi artırmak için birden çok tepkiler.</li>
	<li>Tüp sıkıca kapatın. 30 dk 30 dk içinde 37 ° C su banyosu, ardından bir kapalı 65 ° C su banyosu içinde için kuluçkaya ve nihayet on Ice düzgün bir tavlama emin olmak için.</li>
	<li>1.5 mL steril microcentrifuge Tube 8 µL astar ekleyin ve şablon mix (50 pmol), proofreading tepki tampon, 4 ddNTPs mix (her 4 dNTPs 2 mM) ve H2O kadar 18 µL. 4 µL x 10 2 µL fiske karıştırmak için tüp. Not: 1 x okuma reaksiyon arabellek 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol ve 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 25 ° c) içerir. Ticari kaynak tepkisi arabellek proofreading x 10 için Malzemeler tablo görmek. Her ddNTP tepki olarak son konsantrasyonu 0,1 mM olduğunu.</li>
	<li>DNA polimeraz tepki Arabellek istenen konsantrasyonu proofreading x buz gibi 1 seyreltik [Örneğin, 1.5 mL microcentrifuge tüp için eklemek 4 µL reaksiyon tamponu ve 5-U Klenow polimeraz ticari bir kaynaktan gelen 1 µL proofreading x 1'in (tablo, Materials)]. Seyreltilmiş enzim buz üzerinde her zaman depolar. Not: Seyreltilmiş DNA polimeraz miktarı 2 Tepkiler için yeterlidir; orantılı olarak buna göre enzimler hacmi artırmak için birden çok tepkiler. Klenow polimeraz, 2.0 birimleri içeren 2.0 µL hacmi T-G terminal eşleşmeyen P21/T28 5 min içinde 50 pmol yarısından fazlası yazım denetimini.</li>
	<li>Microcentrifuge tüp substrat karışımı ile 2.3 adımından istenilen reaksiyon ısısı (Örneğin, genellikle 37 ° C Klenow polimeraz ve T4 DNA polimeraz için 25 ° C) prewarm. O zaman seyreltilmiş DNA polimeraz 2.0 µL adımından 2.4 prewarmed substrat karışıma aktarın ve içeriğini karıştırmak için tüp hafifçe vur.</li>
	<li>Enzim ve substratı tüpler santrifüj kapasitesi 3200 x g tepkiler bileşenleri spin için ortam sıcaklığı, bir kaç saniye için. Hemen bir Isıtma blok veya olduğu gibi adım 2.5 istediğiniz kuluçka sıcaklığında su banyosu için tepki aktarın.</li>
	<li>
Reaksiyon sona erdirmek
	<ol>
<li>Tamponlu fenol eşit bir birim eklemek, bir kaç saniyeliğine vortexing tarafından mix ve 3200 x g 5 min için ortam sıcaklığında, microcentrifuge içinde santrifüj kapasitesi.<ol>
<li>Sulu faz bir temiz microcentrifuge tüp aktarmak ve kloroform eşit bir birim eklemek için birkaç saniye ve santrifüj 3200 x g 3 dakika süreyle ortam sıcaklığında, microfuge içinde bir temiz microfuge tüp ve içinde sulu faz Transfer için vortexing tarafından mix cubate bu 95 ° c 5 dakika; sonra buz üzerinde yerleştirin. Dikkat: Fenol ve kloroform tehlikeli kimyasal maddelerdir. Kauçuk ve atık bertaraf kurumsal kuralları takip etmelidir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alternatif olarak, iletişim kuralı Şoklama bir asit kullanın. Bunun için 6 dakika buzda reaksiyonu durdurmak, sonra 1 M diethanolamine (DEA) tepki karışımı pH nötralize ve 95 ° c 5 min için; kuluçkaya 0,64 µL eklemek için 1 M HCL 2 µL Ekle sonra buz üzerinde yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. reçine Ayrıca tuz kirlenme ortadan kaldırmak için
<ol><li>Ticari desalting üzerinden reçine kepçe kullanarak ( Tablo reçetesigörmek) kit, 384-Gamze, 6-mg reçine çukur tabak gamze karşılamak için yeterli reçine al.</li>
	<li>Reçine tüm gamze dağıtabilmenizi (6 mg/gamze) plaka üstünde kazıma tarafından. Herhangi bir aşırı reçine yeniden elde etmek ve eski yerine koymak o şişede.</li>
	<li>Son reaksiyon ürünleri adımından 2.7 microfuge tüpler 384-şey plaka için transfer. Her şey son tepki ürünlerinde sulandırmak ve plaka mühür ve herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için santrifüj kapasitesi için H2O 16 µL dağıtmak.</li>
	<li>Mührü kaldır, 384-şey plaka baş aşağı reçine kaplı çukur tabak kapsayacak şekilde reaksiyon ürünleri ile dön.</li>
	<li>Peki çukur tabak sandviç üzerinde açmak ve dikkatle 384-şey plaka damla reçine izin (384-şey plaka reçine kaplı çukur tabak metal peg karşı aynı hizada olduğundan emin olun).</li>
	<li>Üst çukur tabağa kaldırmak, reaksiyon ürünleri karışımları içeren 384-şey plaka mühür ve reçine, kısaca 3200 x g herhangi bir kabarcıklar kaldırmak ve bir rotator içeriğini desalting için oda sıcaklığında en az 15 dakika yerleştirin, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Reçine temizleme sonra santrifüj kapasitesi 384-şey plaka 3200 x g reçine kuyu dibine kompakt 5 min için de.</li>
</ol>4. transfer reaksiyon ürünleri için bir matris çip
<ol><li>Örnek plakaları nanoliter kabına ayarla (nanodispenser, Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>Yerine matrix çipi ( Tablo reçetesigörmek) ve karşılık gelen tepsi 3.7 bölümünde 384-şey plaka.</li>
	<li>Çip için reaksiyon ürünleri spot nanodispenser işletmek; Çalıştır düğmesini başlatmak için nanodispenser dokunmatik ekranda itin.</li>
	<li>Onay otomatik yakalanan çip genel Benekli cilt sağlamak için ekrandaki doygunluk bilgileri içeren örnek noktalar görüntüsüdür çevresinde 5-10 nL. Birim yetersiz ise örnek lekelenme yineleyin.</li>
</ol>5. kurulumu kütle spektrometresi hakkında tahlil bilgi
<ol><li>.Xls biçiminde almak için beklenen sinyal bilgilerini içeren bir dosya hazırla. Örneğin, 2, 3 ve 4 numaralı adımları P21/T28 proofreading tepki için "P21_T28.xls" (Tablo 2) ayarı kullanır.</li>
	<li>Oluşturmak ve yeni bir tahlil uygulama programı tanımlamak ( Tablo reçetesigörmek) tarafından Tasarımcı formatında içe aktarma tahlil grubu sağ tıklatıp .xls dosyasını (Örneğin, "P21_T28.xls"--dan adım 5.1) seçin.</li>
	<li>Hedef tahlil plaka üzerinden Müşteri: proje: plaka seçeneği ağacı ekranın sol tarafındaki ağaç üst sağ tıklatıp dosya ad vermek kurmak (Örneğin, "CTT20171201" temsil eden tarih ve tahlil kodu).</li>
	<li>384-şey plaka türünü seçin ve Tamam'ıtıklatın; boş bir tabak-ecek gözükmek.</li>
	<li>Uygun tahlil (Örneğin, P21_T28) ekranın sol tarafında seçin.</li>
	<li>İyi vurgulama ve Parça eklemekseçmek için sağ örnek pozisyon çip tespit her örnek için seçili tahlil (Örneğin, P21_T28) atayın.</li>
	<li>Çip .xlsx biçiminde tüm testlerde hiçbir başlık (Örneğin, 1201.xlsx Tablo3) ile çalışan listesini hazırlamak. Çalışma listesi üzerinden Yeni örnek proje Ekle seçeneği alın.</li>
	<li>Çalışma liste (Örneğin, 1201.xlsx gelen) testinde P21_T28 tahlil her konuma atayabilir ve sağ tıklatarak seçin.</li>
</ol>6. MALDI-TOF MS işlemi
<ol><li>Kütle Spektrometre uygulama programı kullanarak çip bağlantı ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>Ekranın sağ tarafında kullanılan varsayılan ayarı seçin.</li>
	<li>Adım 5.3 (Örneğin, CTT20171201), chip ID çip, köşesinde tahlil adından doldurun ve ayarları kaydedin.</li>
	<li>MS denetim programını başlatmak ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>In/Out düğmesine basın ve izci plaka al. Benekli küçük parça--dan adım 4.4 izci plaka üzerine yerleştirin ve kütle spektrometre girmek benekli yongası için In/Out düğmesine basın.</li>
	<li>Uygulamanın program Al düğmesini tıklatın (kütle spektrometresi başlatmak ve veri almak için Tablo reçetesibakınız).</li>
</ol>7. veri analizi
<ol><li>Veri çözümlemeleri için programı açın (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>Sol üst köşede veritabanına ağacına göz atmak ve 6,3 adımından çip kimliği seçin. Ekranın sağ tarafındaki veri dosyasını açın.</li>
	<li>Kitle tayfını görüntülemek için spektrum simgesini tıklatın. M/z belirli bir aralığını kırpmak için Özelleştirme iletişim seçin ve yeni pencerede x ekseni üzerinde tıklatın ve istenen alt ve üst sınırını ayarlamak ve spektrum belirtilen aralığını göstermek için Tamam tuşuna basın için sağ tıklatın.</li>
	<li>Spektrum kayıt vermesağ tıklatarak tutma için verin. Not: 1.600 genişliği/1200 birim ölçeği kullanarak bir makul bir bilgisayar ekranında veri denetim boyutudur.<ol>
<li>JPEG dosya türünü seçin, hedefüzerinde tıklatın, Gözat disk (Örneğin, flaş disk E:) seçeneğini seçin, dosya adını (Örneğin, 1201-1.jpg) yazın ve sonra ver' i tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Veri Nefelometri, imleci kullanın ve tepe tepe yükseklik üst sol köşede göstermek için tıklatın.<ol>
<li>Alternatif olarak, dışa aktarılan bir JPEG dosyası yazdırmak ve el ile bir cetvel ile en yüksek yükseklik ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Loeb, L. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fidelity of DNA synthesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).</li>
<li>Carroll, S. S., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr00105a011">Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm.</a> Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).</li>
<li>Echols, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1883202">Fidelity Mechanisms in DNA Replication.</a> Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+and+chemical+mechanism+of+high-fidelity+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).</li>
<li>Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+Multiple+roles+maintain+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).</li>
<li>Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+active+site+switching+catalyzed+by+the+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).</li>
<li>Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+neighboring+bases+on+DNA+polymerase+insertion+and+proofreading+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).</li>
<li>Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+mispair+extension+kinetics.+Comparison+of+DNA+polymerase+%CE%B1+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).</li>
<li>Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10373598">An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases.</a> Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).</li>
<li>Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-aminopurine+fluorescence+to+measure+incorporation+of+incorrect+nucleotides+by+wild+type+and+mutant+bacteriophage+T4+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).</li>
<li>Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+analog+2-aminopurine+as+a+spectroscopic+probe+of+nucleotide+incorporation+by+the+Klenow+fragment+of+Escherichia+coli+polymerase+I+and+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).</li>
<li>Leung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+G-quadruplex-based+luminescent+switch-on+probe+for+the+detection+of+polymerase+3%27-5%27+proofreading+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity.</a> Methods. 64 (3), 224-228 (2013).</li>
<li>Song, C., Zhang, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+DNA+polymerase+fidelity+by+singly+labeled+smart+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genotyping+of+PCR+products+with+MassTag-labeled+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+MALDI-TOF+based+methodology+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Research. 31 (24), e155(2003).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V-mediated+deoxyinosine+excision+repair+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro.</a> DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excision+of+3%27+penultimate+errors+by+DNA+polymerase+I+and+its+role+in+endonuclease+V-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair.</a> DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).</li>
<li>Kucera, R. B., Nichols, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent DNA Polymerases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Weiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+deoxyinosine+from+the+Escherichia+coli+chromosome+as+studied+by+oligonucleotide+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation.</a> DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).</li>
<li>Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V%3A+an+unusual+enzyme+for+repair+of+DNA+deamination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+proofreading+and+DNA+repair+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay.</a> DNA Repair. 61, 63-75 (2018).</li>
<li>Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+DNA%3A+recognition+of+aberrant+DNA+termini+by+the+Klenow+fragment+of+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).</li>
<li>Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada bir adım adım prova-okuma etkinliği tahlil tarafından seçilen ticari araç analiz açıklanan ( Tablo reçetesigörmek) MALDI-TOF MS kullanarak. Büyük avantajı astar ve şablon etiketi gerçekleştirmek için ücretsiz ve kolay olduğunu deneyler tasarımı daha fazla esneklik için izin içerir. Bir akış-kireç tam işlem testleri proofreading 30 4 h 3 h proofreading reaksiyonlar el ile gerçekleştirmek için de dahil olmak üzere, alacağını ve onların Temizleme sırasında yukarıda belirtilen iletişim kuralı ku...

DNA polimeraz DNA ikileşmesi sırasında okuma fonksiyonları yüksek sadakat Döl1,2,3,4' eaktarılması gereken genetik bilgi sağlamak için gerekli olan, 5,6,7. Eksonükleazlar proofreading polimeraz katkıları değerlendirmek için güçlü olmak genetik istikrarı koruma mekanizmalarını açıklamak.
Radyoizotop etiketleme ve jel tabanlı deneyleri autoradiograms veya fosfor görüntüleme8,9,10 densitometric analizleri ile birlikte geleneksel olarak DNA'ın prova-okuma etkinliği tespit etmek için kullanılmıştır polimerazlar. Fonksiyonel, bu deneyleri zahmetli, pahalı ve yüksek üretilen iş biçimleri için müsait değil iken. Buna ek olarak, radioisotopes atık dahil olmak üzere güvenlik sorunları muzdarip. Alternatif olarak, prova-okuma etkinlikleri Fluorometrik tekniklerle analiz edilmiştir. Örneğin, 2-aminopurine (2-AP) vitro polimeraz deneyleri bir floresan sinyal11,12üretmek için yazım denetleme sırasında uzantılı ürünler dahil edilebilir. Ne yazık ki, 2-AP-ebilmek çift timin ve sitozin ile bu yana bu yaklaşımların bir düşük özgüllük acı. Daha yeni bir yaklaşım içerir bir hassas G-dörtlüsü tabanlı Işıksaçan anahtarı üzerinde prob bir polimeraz 3' - 5' eksonükleaz aktivitesi tahlil13 yanı sıra bazı üstesinden tahlil proofreading bir polimeraz için tek etiketli floresan sonda Yukarıda belirtilen sakıncaları14. Fluorometrik bu yöntemler için coşku belirli DNA yüzeylerde etiketleme için ihtiyaç nedeniyle azalır.
Buna ek olarak, bir MALDI-TOF MS DNA analizi için nerede astar uzantısı reaksiyonlar etiketlenmemiş 4 ddNTPs ile verilen locus15,16,17 polimorfizmleri tanımlamak için kullanılabilir belirlemekte tahlil istihdam ve mutasyon tespitleri için klinik uygulamalarında yaygın olarak benimsenmiştir ve kanser tanı18. Bu temel ilkelerini kullanarak, biz bir etiket içermeyen tahlil DNA polimeraz yüksek çözünürlük, yüksek özgüllük ve MALDI-TOF Bayan kullanma E. yüksek üretilen iş potansiyelini istismar etkinlik düzelti vitro belirlenmesi için oluşturduk coli DNA polimeraz ben Klenow parçası bir model enzim, dideoxyribonucleotide trifosfatlardan (ddNTPs) gibi yüzeylerde bir "anlık görüntü" bir tek nükleotid uzantısı üzerinden sonra MALDI-TOF MS (Şekil 1) ürünleri proofreading alabilir.
Aynı şekilde, bu yöntem aynı zamanda nerede hangi taklit eder endo arakladım V onarım ara ürün içeren 3' sondan bir önceki dI lezyonlar ı onarmak bir pol tabi olan astar tahlil bir DNA onarım tahlil için geliştirilmiştir. Değil tam olarak anlaşılmış olsa da, endo V onarım pol benimçalışanlarımdan eksonükleaz aktivitesi lezyonu eksizyonu19,20proofreading için bilinen tek tamir sistemi yoludur. MALDI-TOF MS kullanarak, biz açıkça tanımlanmış onarım yama nereye dI pol tarafından eksize göstermek ben ne zaman son 2 meydana gelen nt doğru çıkarılan nükleotit eklemeden önce astar.
Proofreading ve DNA tamiri çalışma için bu yöntem daha hızlı ve önceki yöntemlerine göre daha az zahmetli ve mekanizması ve işlev doğru ek bilgi sağlar.

<table><tbody><tr><td>Oligonükleotidler</td><td>Misyon Biyoteknoloji (Tayvan)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fosforotiyoat modifiye oligonükleotidler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (Tayvan)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA polimeraz I, Büyük (Klenow) Fragman</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragmanı (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10X)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddATP</td><td>Trilink Biyoteknoloji, CA</td><td>N4001</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddGTP</td><td>Trilink Biyoteknoloji, CA</td><td>N4002</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddTTP</td><td>Trilink Biyoteknoloji, CA</td><td>N4004</td><td></td></tr><tr><td>2 ', 3' ddCTP</td><td>Trilink Biyoteknoloji, CA</td><td>N4005</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dGTP, dCTP, dTTP seti</td><td>Clubio, Tayvan</td><td>CB-R0315</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCHIP dizisi</td><td>Agena Bioscience, CA</td> <td># 01509</td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typer 4.0 yazılımı</td><td>Agena Bioscience, CA</td> <td># 10145</td><td></td></tr><tr><td>Temiz Reçine Araç Kiti</td><td>Agena Biyobilim, CA</td> <td># 08040</td><td></td></tr></tbody></table>

proofreading ve dna onarım tahlil tek nükleotid uzama ve maldi-tof kütle spektrometresi analizi ile

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Genom ve onun sadık çoğaltma bakım genetik bilginin korunması için her şeyden önemlidir. Yüksek sadakat çoğaltma değerlendirmek için basit bir sigara etiketli geliştirdiğimiz ve radyo izotopik yöntemi bir matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman--uçuş ile (MALDI-TOF) kullanarak kütle spektrometresi (MS) analiz proofreading bir çalışma için. Burada, bir DNA polimeraz [Örneğin, Escherichia coli DNA polimeraz Klenow parçası (KF) ben (pol ben) Bu çalışmada] huzurunda tüm dört dideoxyribonucleotide trifosfatlar arasında eşleşmeyen astar şablonu çift yönlü işlemek için kullanılır. Eşleşmeyen astar sonra yazım denetimini/genişletilmiş ve MALDI-TOF MS için tabi. Ürünler tek nükleotid varyasyonları aşağı astar kitle değişikliği tarafından ayırt edilir. Önemlisi, bir yazım denetleme da iç tek uyuşmazlıklar için farklı verimliliği de olsa, belirlenebilir. 2-4-nükleotit (nt) 3' uçtan bulunan uyuşmazlıklar vardı verimli pol tarafından tashih ve 5'te bir uyumsuzluk astar terminus NT'den yalnızca kısmi bir düzeltmesi gösterdi. Hiçbir yazım denetleme için astar 3' sonundan itibaren 6-9 nt bulunan iç eşleşmeme durumu oluştu. Bu yöntem ayrıca DNA onarım deneyleri (yüzeylerde endo V onarım yolu için Bankası-lezyon onarımını değerlendirmekÖrneğin, ) uygulanabilir. 3' sondan bir önceki deoxyinosine (dı) lezyonlar içeren astar pol tarafından düzeltilmiş ben. Nitekim, sondan bir önceki T-ı, G-ben ve A-ben yüzeylerde vardı son 2 dI içeren nükleotit eksize pol tarafından ben bir doğru ddN 5'-monofosfattır (ddNMP) eklemeden önce sondan bir önceki C-ben uyuşmazlıkları pol tarafından tolere ben ilk olmadan genişletilmesi için izin , DNA tamiri ölçmek için duyarlılık ve kararlılık-in belgili tanımlık Bayan tahlil gösteren onarın.

Şablonlar ve astar:
Burada, molar sentetik oligonükleotid şablonları eşit sunulan yordamını kullanarak ve astar ticari kaynaklardan elde edilen ilgili sıralarının kendi saflık ve kalite (Şekil 3A; sinyallerin belirlenmiş kitle eşleşen Not için kontrol edildi ve düşük arka plan) yanı sıra en yüksek yoğunluk ve analit kütle (Şekil 2A) arasındaki ilişki iç...

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Bu yöntem, DNA polimerleri, aslına uygunluk ve DNA onarımı alanında, düzeltme yöntemleri ve analiz gibi temel soruların yanıtlanmasına ve DNA onarım yamasının tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok spesifik, basit, hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay olmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, DNA replikasyonunda hala kendileri nedeniyle mücadele edeceklerdir ve onarım alanı, kütle spektrometresi enstrümantasyonuna ve veri yorumlamasına aşina olmayabilir.Bence en önemlisi, mutasyon ve atama gibi klinik uygulamalar için ticari olarak geliştirilen kütle spektrometresinin DNA düzeltme okuması ve onarım çalışması için nasıl uygun bir şekilde uyarlanabileceğini gösterebileceğimiz için görsel gösterimin çok kritik olmasıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan Rong-Syuan ve Kuei-Ching yüksek lisans öğrencileri olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi astar ve şablon hazırlama ile başlayın.Örnek olarak, düzeltme okuması için alt tabaka P21 ile T28'in bir TG uyumsuzluğunu kullanın. P21 astarını ve T28 şablonunu mikrolitre başına 12.5 pikorole su ile seyreltin. Daha sonra, 12 mikrolitre seyreltilmiş astar ve 12 mikrolitre seyreltilmiş

proofreading-dna-repair-assay-using-single-nucleotide-extension-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Burada, tek moleküllü AFM görüntüleme yoluyla farklı DNA lezyon tanıma yaklaşımlarının incelenmesi, örnek olarak nükleotid eksizyon onarım sistemi ile gösterilmiştir. DNA ve protein numunesi hazırlama prosedürleri ve AFM deneyleri için deneysel ve analitik detaylar açıklanmaktadır.

Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Burada, lezyon indüksiyonundan sonra DNA'nın kopyalanmasında tek sarmallı DNA boşluklarını araştırmak için DNA lif testinin iki modifikasyonunu açıklıyoruz. S1 fiber testi, ssDNA'ya özgü S1 endonükleazı kullanarak replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlarken, boşluk doldurma testi, boşluk onarımının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir.

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

MALDI-TOF, oksitlenmiş RNA ve eksoribonükleaz Xrn-1 arasındaki reaktiviteden elde edilen fragmanları karakterize etmek için kullanıldı. Mevcut protokol, RNA ve / veya DNA içeren diğer işlemlere uygulanabilecek bir metodolojiyi açıklamaktadır.

MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Öğrenin, MALDI-TOF kütle spektrometrisi ve tek nükleotid uzama stratejisi kullanarak DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım analizini. Bu yöntem, 9 nükleotidden kısa onarım yamalarını hızlı ve spesifik bir şekilde değerlendirir.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Daha fazla video keşfet