Name: Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Keşfedin TGF-β/Smad3 sinyal yolunu canlı hücre görüntüleme ile adenovirus muhabir sistemi kullanarak. Bu yöntem, kanser hücre hatlarında gerçek zamanlı sinyal izleme sağlar ve terapötik gelişim için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) dan gelen hibe için H-JZ tarafından desteklenmiştir. TMBW Avustralya hükümeti bir Avustralya yüksek lisans Ödülü ve Ann Henderson kontör Burs Avustralya Rotary sağlık bir alıcı Templestowe Rotary ve Dine tedavi için ortak olduğunu.

Tüm hayvan deneyleri Melbourne hayvan Etik Komitesi üniversite tarafından kabul edildi.
Not: PReklam-CMV-Td-Tomadenoviral için sıra, inşaat ve üretimi iletişim kuralı vektörler, pReklam-CMV-GFP ve pReklam-SIÇ12- Luc/Td-Tom yukarıda açıklanan11,12olmuştur, 13. Piyasada bulunan tüm vektörleridir.
1. virüs titresi belirlenmesi % 50 doku kültürü bulaşıcı doz (TCID50) kullanma
<ol><li>1 x 106 DMEM + % 10 FBS medya 10 mL HEK293A hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon, 100 µL 96-şey düz-alt hücre kültür plaka her kuyuya tohum.</li>
	<li>1 mL 1: 100 seyreltme tam orta virüs stokunun hazırlayın. 11 µL seyreltilmiş şunun sütun 1 her şey için ekleyin.</li>
	<li>Seri 10 kat dilutions doğrudan 96 iyi tabak içinde seyreltilmiş şunun 11 µL hücre süspansiyon 100 µL ile 1 son bir seyreltme kadar karıştırılarak gerçekleştirmek12 ulaşıldığında x10. Yapışık olmayan hücreleri olmasına rağmen bu aşamada kuyular arasında transfer hücre sayısı sabit kalır.</li>
	<li>10 en yüksek seyreltme ile başlayan her sütuna her seyreltme 11 µL pipet4. Pipet ipuçları dörtlü viral parçacıkların sınırlamak için her seyreltme ile değiştirin.</li>
	<li>Virüs tam ortam 11 µL sütununu 12 negatif bir denetim ekleyin.</li>
	<li>7-10 gün 37 ° c % 10 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Bir mikroskop kullanarak, her sütunda cytopathic ya da sitotoksik efekt belirtileri wells sayısı puanı. Herhangi bir enfeksiyon belirtisi varsa iyi bir pozitif düşünün.</li>
	<li>Reed ve Muench (1938) istatistiksel yöntem14kullanarak her seyreltme için olumlu wells kısmını hesaplayın.</li>
	<li>Orantılı uzaklığı (PD) kullanarak hesaplama: (A-50)/(A-B), nereye A yüzde yanıt yukarıdaki veya % 50 eşit ve B % 50'in altında yüzde yanıttır.</li>
	<li>50 TCID kullanarak hesaplama: 10X-PDX seyreltme nerede, % 50'den büyük bir yanıt veriyor.</li>
	<li>Aşağıdakileri kullanarak viral titresi hesaplamak: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. adenovirus MOI belirlenmesi
<ol><li>Tohum 1.0-1.5 x 500 μL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 12 de plaka içeren medya (% 35 hücre confluency, toplamda 6 kuyu).</li>
	<li>Birimler gerekli 0, 250, 500, 2500 için Reklam-CMV-Td-Tom stok ve 5000 MOI formülü kullanarak hesaplar: MOI = (birim [μL] PFU/μL x) / hücre sayısı. 1 x 1010 (PFU/mL), virüs enfeksiyonu hacimleri titresi ile Reklam-CMV-Td-Tom için gerekli MOIs 0, 3,75, 7.5, 37.5 ve 75 μL sırasıyla vardır.</li>
	<li>Bölüm 2,2 Reklam-CMV-Td-Tom hesaplanan miktarda hücrelerle doğrudan viral stok ayrıntılı karıştırma ile kuyu içine pipetting tarafından bulaştırmak.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Kuyulardan medyayı çıkarın ve hücrelerin % 10 formalin 5 min için 500 μL ile sorunu hemen.</li>
	<li>Formalin kuyulardan Aspire edin ve PBS 500 μL Wells'le bir kez yıkayın.</li>
	<li>Hücre çekirdeği Höchst çözüm 5 min için 500 μL ile leke.</li>
	<li>Höchst çözümü kaldırmak ve wells PBS 3 kez 500 μL ile yıkayın.</li>
	<li>Görüntü 200 X büyütme bir floresan mikroskop kullanarak Td-domates protein ve hücre çekirdeği sinyal. TD-domates protein 554, heyecanlandırmak nm ve Höchst boya 352, nm.</li>
	<li>MOI Td-domates%15100 enfeksiyon için gerekli çalışma belirlemek için ImageJ kullanarak görüntüleri analiz.</li>
</ol>3. çift-adenovirus iletim canlı tek kişilik hücrelerde
<ol><li>Tohum 1.0-1.5 x 500 μL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 12 de plaka içeren medya (% 35 hücre confluency, toplam 2 kuyu).</li>
	<li>Reklam-CMV-GFP 75 μL içeren hücreleri enfekte (titresi = 5 x 109 PFU/mL) ve Ad-SIÇ12-Td-Tom 7.5 μL (titresi = 5 x 1010 PFU/mL) % 100 enfeksiyon pozitif elde edebilirsiniz bir 2500 MOI elde etmek için.</li>
	<li>Hücreleri veya TGF-β 0,25 μL iyi (10 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 5 ng/μL) ücret olmadan hemen sonra adenovirus enfeksiyonu tedavi.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü faz kontrast floresans mikroskobu ile canlı hücreler. 470 nm ve Td-domates protein 554, GFP heyecanlandırmak nm.</li>
	<li>Hücreleri tamir ve adımları 1,6 - 1,9 açıklandığı gibi hücre çekirdeği leke.</li>
	<li>Görüntü Td-domates protein ve Höchst floresan mikroskop kullanarak leke. Höchst boya 352, heyecanlandırmak nm.</li>
	<li>ImageJ kullanarak, GFP ve Td-domates pozitif yüzdesi15hücreleri hesaplama.</li>
</ol>4. canlı tek hücre sinyallemesi olarak tahlil yaranın
<ol><li>Tohum 4-5 x 1 mL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 6 de plaka içeren medya (% 50 cep confluency, toplam 2 kuyu).</li>
	<li>Reklam-SIÇ12-Td-Tom 22.5 μL hücrelerle bulaştırmak (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =).</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>İki çapraz çizgiler P200 pipet ucu kullanarak her şey hücre tabakası kaşı.</li>
	<li>Eski medya kuyulardan kaldırın ve FBS medya ile ya da ezelî TGF-β 0.5 μL iyi (10 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 5 ng/μL) başına 2 mL taze %5 ile değiştirin.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 5 min için plaka yerleştirin ve 100 X büyütme bir faz kontrast mikroskop kullanarak seçili yara alanlarda görüntüleri al.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Daha önce aynı alanları olarak yara kapatma görüntülerini atın.</li>
	<li>Hücreleri tamir, hücre çekirdeği adımları 1,6 - 1,9 açıklandığı gibi leke ve Td-domates sinyal yara alan ve sigara-yara alan 200 X büyütme bir floresan mikroskop kullanarak görselleştirmek.</li>
	<li>Td-domates pozitif hücrelerinin yüzdesi, yara ve sigara-yara alan ImageJ yazılım15kullanarak ölçmek.</li>
</ol>5. Vitro Luciferase tahlil
<ol><li>3-5 x 1 mL % 5 içeren DMEM medya 104 MDA-MB-231 hücrelerde hücre süspansiyon hazırlamak FBS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 2.5 μL ile enfekte Ad-SIÇ12- Luc (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =).</li>
	<li>Tohum 96 içine enfekte hücreleri de 3.000 hücreler/100 µL/kuyuda plaka.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Eski medya kuyulardan kaldırmak ve taze %5 FBS medya ile ya da ezelî TGF-β 0.1 μL iyi (1 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 1 ng/μL) başına 100 µL yerine ve iyi (hisse senedi 7 mg/mL başına inhibitörü TGF-β, 0,17 μL olup Son konsantrasyonu olarak 12 ng/μL) (yayımlanmamış bir roman TGF-β ligand tuzak protein, Chen ve ark., iş).</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Luciferase tahlil sistem yüzey çözülme ve 1 x hücre kültür lizis reaktif Çift Kişilik distile su (DDW) hazırlayın.</li>
	<li>96 kuyulardan medyayı çıkarın ve 1 x hücre kültür lizis arabelleği için 30 dk nazik ajitasyon ile bir orbital çalkalayıcı kullanarak buz üzerinde 50 μL Wells'le parçalayıcı.</li>
	<li>Lysate, 30 μL her kuyudan bir opak luciferase plaka aktarmak ve oda sıcaklığında sıcak plaka izin.</li>
	<li>Luminometer yazılım, yeni bir iletişim kuralı oluşturun. Ölçümleri ile 1 enjektör için önce ve sonra enjeksiyon seçin. Ayarla ölçümleri enjeksiyon önce 1 için ölçüm gecikme ve Entegrasyon zamans. Enjeksiyon ölçüm sonra ayarlamak Enjeksiyon birim için bir ölçüm gecikme 1 40 µL enjeksiyon ve 5 sonra s s Entegrasyon zaman. Tamamseçerek ayarları onaylayın.</li>
	<li>Enjektör tüp DDW yerleştirin ve enjektör tüp kullanmadan önce temizlemek için Prime ayarları altında enjektör 1 düğmesini tıklatın. Sonraki enjektör boru DDW ve iki daha fazla asal tüm çözüm tüm tüpünden temizlemek için 1 enjektör, ardından hava yerde kaldırın. Enjektör tüp Firefly substrat ve yine iki kere belgili tanımlık substrate hazırlamak için Prime içine yerleştirin.</li>
	<li>Opak luciferase plaka örnekleri ile luminometer yerleştirin ve yazılım seçenekleri belirleyin. Faiz kuyu vurgulayın ve Uygula' yı tıklatın. Luciferase sinyal ölçmek için Başlat tuşuna basın.</li>
	<li>Ölçümler tamamlandıktan sonra kaldırma ve plaka su ile durulayın. Kalan herhangi bir yüzey enjektör tüpün içine hava ve Prime enjektör 1 firefly substrat tüp içine geri içine tüp yerleştirerek yeniden elde etmek. Enjektör tüp DDW yerleştirin ve kalan herhangi bir yüzey enjektör tüp temizlemek için iki daha fazla asal gerçekleştirmek.</li>
</ol>6. hücre hazırlık için canlı sinyal görüntüleme Vivo içinde
<ol><li>48 tümör İmplantasyondan önce s 175 cm2 şişeler (Toplam 10 şişe) içine 2-3 x 106 MDA-MB-231 hücre tohum. Kültür DMEM medya % 5 içeren 20 mL hücrelerde FBS 37 ° c, % 10 CO2.</li>
	<li>24 saat sonra 300 μL eklemek Ad-SIÇ12- Luc (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =) her şişeyi içine. Hücre kültürü için başka bir 24 saat tutun.</li>
	<li>İmplantasyon günü, eski medyayı çıkarın ve adenovirus enfekte hücreleri kez PBS, pH 7.4 20 mL ile yıkayın. 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA balonun ekleyin ve biraz tripsin tüm şişeyi yüzey kapsayacak şekilde izin vermek için şişeyi sallayın. 37 ° C, % 10 CO2 3 dk için kuluçka için şişeye koyun.</li>
	<li>Tripsin FBS içeren DMEM medya 8 mL şişe ekleyerek gidermek. Tüm hücre süspansiyonlar cam reaktif şişe aktarın.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücre saymak ve 4.8 x 107 hücrelerde iki 50 ml santrifüj tüpleri aktarın.</li>
	<li>Senaryo Özeti 400 x g tripsin kaldırmak ve 720 mL taze FBS-DMEM medya hücrelerde resuspend RT, 5 min için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar steril 5 mL tüp içine nakletmek ve 160 μL eklemek Matrigel (% 10 toplam matrigel süspansiyon).</li>
	<li>Hücreler buz implantasyon kadar tutmak.</li>
</ol>7. Orthotopic implantasyon
<ol><li>12 SCID fareler tartmak ve rastgele fare kontrol ve tedavi gruplara (6 fare/grup) ayırır.</li>
	<li>İmplantasyon bir steril biyo-steril bir ortam sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. 1 L/dak yeri bir ısı yastık üzerinde fareyi bir oksijen akış hızı % 2.5-4.5 isoflurane kullanarak fare uyuşturan ve kornea zarar görmemesi için her iki gözde üzerine göz merhem yağlama bir damla dağıtmak. Burun burun konisi yerleştirerek anestezi korumak için isoflurane bağlıyken ısı pad fare sırtüstü pozisyonda düzeltmek.</li>
	<li>Anestezi başarısı çimdik tırnağa tepki eksikliği onaylayın. İdame dozu implantasyon hatırlatılması için 1 L/dak oksijen ile % 1.5-2.5 için İsoflurane azaltın.</li>
	<li>Dördüncü meme iki cilde orta hat % 80 etanol batırılmış pamuk bez kullanarak temizleyin.</li>
	<li>4th meme yağ yastığı palpasyonla aracılığıyla bulmak ve daha fazla doku ortaya çıkarmak için yağ yastığı sıkmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. Yavaşça hücre karışımdan 50 µL 27 G insülin enjektör Aspire edin ve her iki fare meme yağ yastığı içine enjekte.</li>
	<li>Başarılı bir enjeksiyon yağ yastığı şişlik için duygu tarafından onaylayın. Yağ yastığı hafifçe yayın ve fare kafesin içine yerleştirin.</li>
	<li>Kafesleri ısı panelindeki fareler bilinç kazanmak ve sonra 3 gün boyunca holding odanın kafesleri yerleştirmek izin vermek en az 30 dk için bırakın.</li>
</ol>8. IVIS görüntüleme
<ol><li>Görüntü yaşayan yazılımını açın.</li>
	<li>IVIS Sistem Denetim Masası IVIS sistem başlatma butonuna basarak başlatın. Sıcaklık işareti yeşile kadar bekleyin.</li>
	<li>Luminescent görüntüleme modunu kontrol panelinde seçin.</li>
	<li>İsoflurane anestezi odası ve IVIS sistemi açın.</li>
	<li>Fareler 1 L/dak oksijen ile % 2.5-4.5 isoflurane kullanarak uyuşturan. Bir kez anaesthetized, isoflurane 1,5-%2,5 bakım için ayarlamak. 150 mg/kg vücut ağırlığı ile D-biyoluminesans mayi (IP) enjeksiyonu ile fareler enjekte.</li>
	<li>Hemen fareler IVIS sisteme aktarmak, ısı kontrollü görüntüleme platformu koyup ve onların burun burun konisi içine yerleştirin.</li>
	<li>Denetim Masası Sıra Kur düğmesini tıklatın ve Orta Binningseçin.</li>
	<li>Görüntüleme çekim hızı kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s ve 120 başlangıç yaklaşık 3 dakika sonra biyoluminesans enjeksiyon görüntüleme s. ve sinyal düşmeye başlayıncaya kadar görüntü devam (normalde bu yaklaşık 20 dakika sürer).</li>
	<li>Fareler isoflurane anestezi burun konisi ile korunarak IVIS kaldırın ve fare ile 50 µL PBS ya da 50 µL TGF-β sinyal inhibitörü (50 μg/tümör) içi tümör enjeksiyon yolu ile tedavi.</li>
	<li>Fareler geri koyarlar ve ısı yastık en az 30 dk için açık bırakırım. Sonra kafes geri tutarak Odaya yerleştirin.</li>
	<li>IVIS tedavi ertesi günü açıklanan yordamı Imaging yineleyin.</li>
</ol>9. veri analizi
<ol><li>Açık dosyaları içinde Yaşayan görüntü yazılım kaydedilir.</li>
	<li>Görünümü ' nü kullanarak görüntü bilgileri bulmak | Görüntü bilgileri.</li>
	<li>Aynı çekim hızı ile benzer bir zaman noktasında çekilen fotoğrafları seçin. Fotoğrafları bir grup olarak yükleyin.</li>
	<li>Yoğunluğu normalleştirmek için Görüntü ayarı içinde bireysel kutunun işaretini kaldırın.</li>
	<li>Yoğunluk analiz için foton modu seçeneğini belirleyin. Yatırım getirisi araçları' nda Faiz bölge (ROI) düğmesini seçerek sinyalin yoğunluğunu ölçmek.</li>
	<li>Yatırım getirisi daire kollarındaki sinyal içeren bölgesine sürükleyin ve sinyal yoğunluğu elde etmek için ölçü birimi düğmesini tıklatın.</li>
</ol>

<ol><li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li>
<li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992590">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16322555">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li>
<li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li>
<li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology+research+communications+%3A+MCBRC%22%5BJournal%5D)">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3512574/">TGFβ in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25744371">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50(2015).</li>
<li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biol.ogy%22%5BJournal%5D)">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li>
<li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+factors%22%5BJournal%5D)">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aje/article-abstract/27/3/493/99616">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li>
<li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).</li>
<li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li>
<li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+vector%3A+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li>
<li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li>
<li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li>
<li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells%3A+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li>
<li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li>
<li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li>
<li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li>
<li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li>
<li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li>
<li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+neurology+and+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388(2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları rapor.

Biz tek canlı hücreler TGF-β/Smad3 sinyal, gerçek zamanlı görüntüleme için izin vermek için bir teknik geliştirdi. Roman bu yöntemi kullanarak, biz daha önce hücre alt nüfus gelişmiş işgali ve geçiş8ile ilişkili dinamik TGF-β/Smad3 transkripsiyon aktivite ile belirledik. Bu yöntem TGF-β, Smad3 fosforilasyon Batı lekesi gibi sinyal için geleneksel deneyleri geliştirir ve TGF-β heterojenite yakalayarak gen ekspresyonu, hedef, TGF-β/Smad3 tümör nüfus içinde sinyal ve vurgulama tek hücre biyolojisi ön...

Transforming büyüme faktörü β (TGF-β) olduğunu bir heterodimeric tip II oluşan karmaşık sinyaller insan gelişiminde karıştığı bir temel sitokin ve reseptörleri1yazın. Bağlama II reseptör yazın sonuçları işe alım ve fosforilasyon türü ben sırayla aşağı akım Smad2/3 proteinler2,3phosphorylates reseptör. Bunlar Smad4, Smad2/3 proteinler bağlama çekirdeği translocates ve Gen transkripsiyonu4düzenleyen bir kompleksi oluşturan aktif. Homeostatik koşullarda TGF-β/Smad sinyal sıkı bir şekilde düzenlenmiştir; Ancak, birçok hastalığın, sinyal yolu kuralsız ve genellikle ilerleme hastalık5,6,7' nin önde gelen overexpressed. Son yıllarda yapılan çalışmalarda altgrupları TGF-β/Smad etkin hücre bir saat-bağımlı bir şekilde8,9biyolojik işlev sorumludur ve TGF-β hücresel yanıt hànzú gösterdi. TGF-β/Smad sinyal yaygın hücresel Analizi hücresel hareketlilik sadece bir görüntüsünü sağlayan ve ortalama TGF-β/Smad etkisi10kez quantitate sabit bitiş noktası deneyleri kullanımını gerektirir. Bu yöntemler, ancak, doğru bir şekilde TGF-β/Smad fizyolojik durumda hastalık ilerlemesi sırasında sinyal moleküler davranışları temsil etmeyebilir. Yansıma tabanlı canlı hücreleri yakalama bir kayma ve zamansal anlayış ile hücresel ve biyolojik süreçlerin dinamiği analizi.
Amacımız TGF-β/Smad adenovirus tabanlı reaktifler kullanarak sinyal canlı hücre görüntüleme için hassas bir yüksek-den geçerek yöntemi geliştirmekti. Burada, bir adenovirus Smad3 SIÇ motifi bağlama sırası ve bir luciferase (Luc) veya Td-domates (Td-Tom) muhabir gen ifade insan meme kanseri hücre satırında MDA-MB-231 bulaşmış. Adenoviral muhabir sistemleri % 100 enfeksiyon oranını kanser hücre hatlarında sonuçlanabilir plazmid giriş için hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar. Adenoviral muhabir sistemleri de başarıyla geleneksel plazmid11ile transfect zor olan hücre hatları için uygulanmış. Bu protokol için tekrarlanabilir ve noninvaziv bir süreç canlı hücre görüntüleme TGFβ/Smad sinyal yolu elde etmek için anlatacağız içinde in vitrove in vivo .

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>37 °C &°C; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S Kullanmadan</td><td>önce ısı inaktive</td></tr><tr><td>edildi Rekombinant İnsan TGF-&beta; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot, 10 mg / mL'de son konsantrasyonu sağlamak için DDW'de</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>1 & mu'da nihai konsantrasyon yapmak için PBS'ye seyreltin; L/mL</td></tr><tr><td>Lusiferaz Raportör Test Kiti</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Kullanmadan önce PBS'de 5 kez seyreltin</td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Faz kontrast floresan mikroskobu</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>%0,5 Tripsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>PBS Hücre Kültürü Lizizinde %0,05 (1x) Diltue</td></tr><tr><td>5x Reaktif</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>DDW'de 1x'e Seyreltin</td></tr><tr><td>%10 Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Hayvan Kaynakları Merkezi</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kimyasal tedarik</td><td>EA043-10LP</td><td></td></tr><tr><td>Yenile Gece</td><td>Alerjisi</td><td>1750D</td><td>Kayganlaştırıcı Göz Merhemi</td></tr><tr><td><güçlü>Çözelti</güçlü></td><td></td><td></td><td><güçlü>Bileşim</güçlü></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt>.2H<alt>2</alt>O (4 mM); NaHPO<alt>4 </alt>(16 mM); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>% 5 ısı inaktive edilmiş FBS; 10 & mu; g/mL penisilin; 100 ve mu; g/mL streptomisin</td></tr></tbody></table>

hücre görüntüleme tgf-β/smad3 sinyal yolu vitro ve adenovirus muhabir sistemiyle vivo içinde yaşamak

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştüren hücresel homeostazı için gerekli birçok önemli işlevleri düzenleyen ve yaygın kanser de dahil olmak üzere birçok hastalıklarda overexpressed bulunur. TGF-β şiddetle geç sahne kanseri ilerleme sırasında metastaz göçmen ve invaziv tümör hücre alt grubunu aktive karıştığı. Sinyal yolu analiz için geçerli yöntemleri kez sinyal post-hoc biyolojik olay ölçmek girişimi ve hastalık ilerici doğası yansıtmamaktadır bitiş noktası modellerde odaklanmak. Burada, canlı hücrelerde transkripsiyon harekete geçirmek algılayabilir TGF-β/Smad3 sinyal yolu için belirli bir roman adenovirus muhabir sistemi göstermektedir. Bir Reklam-SIÇ12-Td-Tom muhabir kullanmak, MDA-MB-231 hücre içinde 24 saat içinde in vitrobir % 100 enfeksiyon hızı elde edebilirsiniz. Floresan muhabir canlı tek hücre içinde görüntüleme için kullanılmasına doğrudan kimlik transcriptionally etkin hücre ile gerçek zamanlı. TGF-β ile enfekte hücreleri uyarılması yalnızca bir alt kümesini transcriptionally aktif ve belirli Biyolojik işlevleri dahil olan hücreleri görüntüler. TGF-β sinyal vitroiçin ilgili biyolojik fonksiyonlar anlayışı geliştirmek için yüksek özgüllük ve bir tek hücre düzeyinde duyarlılık için bu yaklaşım sağlar. Transkripsiyon etkinliği de olabilir Smad3 bildirilen in vivo olarak uygulanması yoluyla gerçek zamanlı bir Ad-SIÇ12- Luc muhabir. Reklam-SIÇ12- Luc ve geleneksel stabil transfected luciferase hücre hatları ile aynı şekilde ölçülebilir. İmplante hücreleri içinde vivo Smad3 transkripsiyon faaliyet geleneksel IVIS görüntüleme ile analiz ve canlı tümör ilerleme, TGF-β sinyal yolu dinamikleri içine benzersiz fikir veren sırasında izlenen. Canlı hücre sinyal yolları hızlı yüksek üretilen iş görüntüleme için izin veren bir avantajlı gazeteci dağıtım sistemi bizim protokolünü açıklar vitro ve içinde vivo. Bu yöntem bir dizi görüntü dayalı deneyleri ve temel biyoloji ve terapötik geliştirme için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak hediye için genişletilebilir.

Vitro Imaging tek hücreli canlı
TGF-β/Smad dayalı adenovirus reaktifler kullanarak tek kişilik hücrelerde sinyal aktif doğru değerlendirmek için ilk en iyi çokluğu, enfeksiyon (MOI) her hücre satırı için belirlemek önemlidir. 0 hücre mevcut hiçbir cytopathic veya sitotoksik etkisi ile adenoviral enfeksiyon için pozitif olduğunda en iyi MOI belirlenir. Bunu belirlemek için biz pozitif enfeksiyon bir işareti olarak hareket y...

Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Bu yöntem, hücre sinyalini gerçek zamanlı olarak noninvaziv olarak izleyerek hücre sinyalleme alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, adenovirüs sistemlerinin, kanser hücre hatlarında %100 enfeksiyon oranı elde edebilen hücre sinyalizasyonu tespiti için hızlı ve kolay bir yöntem sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri, kanserler için terapötik gelişime doğru uzanır ve diğer sinyal yollarına genişletilebilir.Bu yöntem meme kanseri modelleri hakkında fikir verebilse de, beyin, kemik ve akciğer gibi diğer kanser türlerine de uygulanabilir. Adenovirüs enfeksiyonu gününde,% 35'lik bir birleşme için 500 mikrolitre ortamda yaklaşık 1.25 kez 10 ila beşinci MDA-MB-231 hücresi ile 12 oyuklu bir plakanın kuyularını tohumlayın % 100 enfeksiyon pozitifliği elde edebilen 2.500 MOI elde etmek için 75 mikrolitre adenovirüs-CMV-GFP ve 7.5 mikrolitre adenovirüs CAGA12-Td-Domates ile tüm kuyucuklardaki hücreleri enfekte edin. Daha sonra adenovirüs enfeksiyonundan hemen sonra tedaviye TGF-beta ekleyin.37 santigrat derecede% 10 karbondioksit ile 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, faz kontrastlı floresan mikroskobu ile canlı hücreleri görüntüleyin. Daha sonra hücreleri sabitledikten ve çekirdekleri Hoechst boyası ile boyadıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak TD-Tomato proteinini ve Hoechst boyasını görüntüleyin.Tüm kuyucukları görüntüledikten sonra, ImageJ kullanarak GFP ve Td-Tomato pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Yara iyileşme tahlili için, enfeksiyon gününde% 50 birleşme için bir mililitre ortamda yaklaşık 4.5 kez 10 ila beşinci MDA-MB-231 hücresi ile altı oyuklu bir plakanın kuyularını tohumlayarak başlayın. Hücreleri 22.5 mikrolitre adenovirüs CAGA12-Td-Domates ile enfekte edin, ardından plakayı 24 saat boyunca% 10 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin.24 saat sonra, her bir oyuğun hücre tabakasında iki çapraz çizgi çizmek için bir P200 pipet ucu kullanın. Ortamı kuyucuklardan çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi TGF-beta ile muamele edin, ardından plakayı beş dakika boyunca% 10 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, plakayı inkübatöre geri göndermeden önce bir faz kontrast mikroskobunda 100X büyütme kullanarak seçilen yara alanlarının görüntülerini alın.24 saat sonra, yara kapanmasını değerlendirmek için aynı alanların faz kontrast görüntülerini alın. Hücreleri sabitledikten ve çekirdekleri boyadıktan sonra, bir floresan mikroskobunda 200X büyütme kullanarak yara bölgesinde ve yara olmayan alanda Td-Tomato sinyalini görselleştirin. Tümör implantasyonundan 48 saat önce, yaklaşık 2,5 kez 10 ila altıncı MDA-MB-231 hücresini 10 adet 175 santimetrekarelik şişelere tohumlayın.Kültürde 24 saat sonra, hücreleri 24 saat daha inkübatöre geri göndermeden önce her şişeye 300 mikrolitre adenovirüs CAGA12-lusiferaz ekleyin. İmplantasyon gününde, eski ortamı çıkarın ve adenovirüs ile enfekte olmuş hücreleri bir kez 20 mililitre PBS ile yıkayın. Şişeye iki mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve Tripsin'in tüm şişe yüzeyini kaplamasını sağlamak için şişeyi hafifçe sallayın.37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin, ardından şişelere sekiz mililitre FBS içeren DMEM ortamı ekleyerek Tripsin'i söndürün. Tüm hücre süspansiyonlarını bir cam reaktif şişesine aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.Bundan sonra, yedi hücreye 4.8 kez 10 kez 250 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, hücreleri 720 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 50 mikrolitre başına 10 ila altıncı hücreye üç kez seyreltmek için% 10 Matrigel içeren ortam ekleyin.Hücre süspansiyonunu steril beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve implantasyona kadar buz üzerinde tutun. 12 SCID fareyi tartın ve fareleri kontrol ve tedavi grupları arasında rastgele eşit olarak paylaştırın. Fareyi uyuşturduktan sonra, kornea hasarını önlemek için her iki göze bir damla kayganlaştırıcı göz merhemi damlatın, ardından fareyi steril bir biyo-kabindeki bir ısı yastığına sabitleyin ve burnu izoflurana bağlı bir nosekon içine yerleştirerek anesteziyi sürdürün.Anestezinin başarısını, bir ayak parmağı tutamına reaksiyon olmamasıyla onaylayın. İmplantasyonun geri kalanı için izofluranı bir idame dozuna düşürün. Ardından, cildi her dördüncü meme ucundan orta hatta kadar temizlemek için %80 etanole batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın.Palpasyon yoluyla dördüncü meme yağ pedini bulun ve dokuyu daha fazla açığa çıkarmak için yağ pedini sıkın, ardından hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 50 mikrolitre hücre karışımını 27 gauge insülin şırıngasına nazikçe aspire edin ve meme yağ yastığına enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonu onaylayın ve yağ pedini nazikçe serbest bırakın.Fareyi ev kafesine geri yerleştirin. Fareler bilincini geri kazandıktan sonra, IVIS görüntülemeye geçmeden önce kafesi üç gün boyunca bekleme odasına geri koyun. Canlı MDA-MB-231 hücreleri, hücreler arasında TGF-beta'ya bağımlı Smad3 transkripsiyonunun heterojen aktivasyonunu gösteren GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi% 100 enfeksiyona rağmen çeşitli seviyelerde Td-Tomato ekspresyonu sundu.Sabit hücrelerin analizi yine %100 GFP ekspresyonu gösterirken, hücrelerin sadece yaklaşık %26'sı, %0 pozitiflik tedavisine kıyasla TGF-beta olmadan TGF-beta stimülasyonundan 24 saat sonra saptanabilir TGF-beta/Smad3 transkripsiyonel aktivite gösterdi. Yara iyileşme testinde, adenovirüs CAGA12-Td-Tomato ile enfekte olmuş MDA-MB-231 hücreleri normal göç davranışı sergiledi ve TGF-beta ile tedavi edilen hücreler gelişmiş yara kapanması gösterdi. Özellikle, yara bölgesindeki hücrelerin yaklaşık% 62'si, TGF-beta tedavisinden sonra yara dışı alanda gözlenenden önemli ölçüde daha yüksek olan pozitif TGF-beta'ya bağımlı Smad3 transkripsiyonel aktivite gösterdi.Adenovirüs CAGA12-lusiferaz reaktifi, bir meme tümörü ortotopik implantasyon hayvan modelinde test edildi. Hem kontrol hem de TGF-beta-inhibitörü ile tedavi edilen gruplar, tedaviden önce benzer CAGA12-lusiferaz raportör aktivitesi gösterdi. Bununla birlikte, kontrol grubu için, PBS tedavisinden sonra lusiferaz sinyali değişmedi, oysa TGF-beta inhibitörü ile tedavi edilen fareler yaklaşık üç kat sinyal azalması gösterdi.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, aşırı yüksek miktarda adenovirüsün, sonuçlarınızın doğruluğunu etkileyebilecek sitotoksik ve sitopatik etkilere sahip olabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bu sistem, hücre sinyalizasyonu çapraz konuşması ile ilgili ek soruları yanıtlamak için birden fazla sinyal yolunu aynı anda analiz edecek şekilde genişletilebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser hücresi sinyalizasyonu alanındaki araştırmacıların meme kanseri modellerinde tümör ilerleme davranışını keşfetmelerinin yolunu açtı.

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Preparation of Reporter-Expressing Cancer Cells for In Vivo Imaging

Hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan tükenme-kurtarma deneyleri için bir yöntem tanımlıyoruz. Adenofeksiyon, tek hücre düzeyinde mitotik hücre bölünmesi ve miyogenez gibi ince ayarlanmış aktin bazlı dinamiklere dayanan biyolojik süreçler içindeki proteinlerin fonksiyonel analizlerini sağlar.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Keşfedin TGF-β/Smad3 sinyal yolunu canlı hücre görüntüleme ile adenovirus muhabir sistemi kullanarak. Bu yöntem, kanser hücre hatlarında gerçek zamanlı sinyal izleme sağlar ve terapötik gelişim için uygulanabilir.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Daha fazla video keşfet