Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Burada ilk kez yaşlanmaya bağlı hastalıklarda yararlı olduğu gösterilmiştir senoterapötik bileşikler için yüksek iş itme ilaç tarama sağlayan bir yöntem açıklar. Aslında, bu özünde test edilen ilaçlar ile çeşitli klinik çalışmalar şu anda devam etmektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı senoterapötik ilaçların iki tip ayırt etmektir, senolitik ve senomorfikler, senescent hücrelerde SA-beta-Galaktosidaz iyi tespit kullanarak.

Bu teknik yeni senoterapötik bileşikler için önemli bir tarama aracıdır. Aslında, bu ekran yardımıyla tespit edilmiş çeşitli bileşikler çeşitli yüksek profilli yayınlarda yer almaktadır, ve klinik deneme şu anda bulunmaktadır. Bu teknik son derece çok yönlüdür ve birkaç yüksek işlem ekranlarına uyarlanabilir.

Aslında, çok katlı ekranlar için mümkündür, ve birkaç yollarından birinin aktivasyonu veya inhibisyonu yoluyla senescence bastırmak bileşikler için ekran. Her embriyoyu bir milimetrelik parçalara ayırın ve birkaç kez yukarı ve aşağı boru. Daha sonra, her embriyodokularına 10 mililitre büyüme ortamı ekleyin.

10 santimetrelik bir kültür kabına koyun ve 2-3 gün boyunca %3 oksijen ve %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ve her embriyonun geri kalanını %0.25 tripsin EDTA karışımı ile 10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri denemek için, ilk olarak, büyüme ortamını dikkatlice çıkarın ve hücreleri 10 mililitre 1X PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra hücrelere 025 tripsin EDTA çözeltisinin iki mililitresini ekleyin ve 2-3 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, hücrelerin yüzeyden ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Tripsin sindirimini sonlandırmak ve hücreleri konik bir tüpe aktarmak için aynı miktarda büyüme ortamı ekleyin.

Sonra, hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve hücreleri yeniden askıya almak için taze büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri sayın ve öngörülen hücre yoğunluğunda yeni plakalar halinde tohum.

Senesiz alt ekimiçin, ilk olarak, bir-dört oranında bölünmüş konfluent hücreler. Sonra hücreleri 37 derecede %3 oksijen ve %5 karbondioksitle başka bir geçit için genişletirler. Daha sonra, hücre senescence indüklemek için, tohum bir-dört oranında bir pasajdan confluent hücreleri bölmek ve 37 santigrat derece% 20 oksijen ve% 5 karbondioksit ortamında üç gün boyunca onları kuluçka.

Hücresel senescence izlemek için, gelişmiş bir Coulter Hücre Sayacı sistemi ile, her trypsinization adım sırasında hücre çapı ve hücre hacminde kademeli artış ölçmek. Beta-Gal tarama testine başlamak için, tohum 5, 000 senescent hücreleri veya 3, 000 non-senescent hücreleri iyi başına 96 iyi plakalar. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede, %20 oksijen ve %5 karbondioksitle altı saat boyunca kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, MEF hücrelerine ilaç seyreltmeleri ekleyin ve hücreleri %20 oksijende 37 derecede ve %5 karbondioksitle 24 ila 48 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, ilaç çözeltisini çıkarın ve hücreleri 1X PBS'nin 100 mikrolitresiyle yıkayın. Lysozomal alkalinizasyon ikna etmek için, bafilomisin A1 çözeltisi 90 mikrolitre ile hücreleri tedavi, taze hücre kültürü ortamda seyreltilmiş 100 nanomolar son konsantrasyonda.

Daha sonra hücreleri 37 derecede %20 oksijen ve %5 karbondioksit ortamında bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. SA-beta-Gal aktivitesinin floresan analizi için, 100 mikromolar nihai konsantrasyonda, büyüme orta seyreltilmiş C12FDG taze bir çalışma çözümü yapmak. Daha sonra, 10 mikromolar son konsantrasyonunda kültür ortamına çalışma çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin ve 20% oksijen ve% 5 karbondioksit% 27 santigrat derece hücreleri iki saat boyunca kuluçka hücreleri.

Hücreleri 1X PBS'nin 100 mikrolitresiyle yıkayın. Daha sonra, mililitre başına iki mikrogram-mililitre Başına Hoechst 33342 boya mililitre başına iki mikrogram son konsantrasyonda ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede, %20 oksijen ve %5 karbondioksitle 20 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, ortamı çıkarın, 100 mikrolitre taze büyüme ortamı ekleyin ve görüntülemeye devam edin. Bu çalışmada, 17-DMAG gibi senolitik ilaçların tanımlanmasına izin verilen yüksek içerikli floresan görüntü edinimi ve analiz platformu, beşinci geçitte senescent hücreleri içeren murine embriyonik fibroblast hücre kültürlerinde genel SA-beta-Gal aktivitelerini azaltmıştır. Senescent ve senesiz hücrelerin karışımlarının yazılım tarafından oluşturulan kantitatif analizleri, senescent hücreye özgü etkilerin net bir şekilde gösterilmesine ve bafilomisin A.A.'nın arka plan beta-galaktosidaz aktivitesinin ortadan kaldırılmasına olanak sağlar.

Bu deneme oksidatif stres altında birincil hücreler ile çalışma içerir, hangi izlenmesi gereken varyasyon yol açabilir. Bu işlem senoterapötik ilaçların saptanmasında ilk adımdır. Tarama sonuçlarını doğrulamak için ek hücre canlılığı ve hücre yılscent denemeler yapılması gerekir.

İlk senolitik ilaç kombinasyonu dasatinib quercetin, ısı şok proteini 90 inhibitörleri, Bcl-2 aile inhibitörleri ve polifenol fisetin dahil olmak üzere birçok yeni senolitik ilaç bu deneme kullanılarak tespit edilmiştir.