Name: Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Öğrenin senoterapötik ilaçları yüksek verimli tarama yöntemiyle tanımlamayı. SA-beta-Galactosidase aktivitesi ölçülerek senolitik ve senomorfik ilaçlar ayırt edilir. Bu teknik yaşlanma hastalıkları için yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NıH hibe AG043376 (Proje 2 ve Core A, PDR tarafından desteklenmektedir; Proje 1 ve Core B, LJN) ve AG056278 (Proje 3 ve çekirdek A, PDR; ve proje 2, LJN) ve Glenn Vakfı (LJN) bir hibe.

Hayvan kullanımı Scripps Florida kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. dölsel murin embriyonik fibroblast (MEF) üretimi – 12-15 gün
<ol><li>Daha önce33açıklandığı gibi embriyonik gün 13 (E13) hamile kadın fareler vahşi tip ve Ercc1-/- MEFS izole. Not: tüm aşağıdaki adımlar aseptik koşullarda ve steril aletler kullanılarak bir doku kültürü kaputu içinde gerçekleştirilir.</li>
	<li>Embriyo kafasını gözlerinizin üstüne resekt.</li>
	<li>Kırmızı dokusu (kalp ve karaciğer) çıkarın ve gerekirse Genotipleme için kullanın.</li>
	<li>500 mL, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM) ve ham 's F10 ile% 10 fetal sığır serumu, 1x uçucu olmayan amino asitler, penisilin ve streptomisin büyüme ortamı olarak 1:1 karışımı hazırlayın ve her kullanmadan önce yaklaşık 15 dakika boyunca 37 °C ' ye kadar ısıtın. 4 °C ' de büyüme ortamını saklayın.</li>
	<li>10 dakika boyunca% 0,25 tripsin/EDTA ile embriyonun geri kalanının inküyü.</li>
	<li>Embriyo 1 mm parça içine Mince ve birkaç kez yukarı ve aşağı doku pipet.</li>
	<li>10 cm çapı hücre kültürü plaka başına bir embriyo büyüme orta ve plaka dokularının 10 mL ekleyin (geçiş 0).</li>
	<li>37 °C ' de hücreleri yetiştirmek,% 3 O2, 5% Co2. Not: sadece MEF hücreleri bu koşullar altında kaplı olmayan doku kültürü plakaları ekleyin.</li>
	<li>Değiştirme orta her gün geçiş 0 bağlı olmayan doku ve hücre parçaları kaldırmak için. Not: embriyonun boyutuna ve yalıtım kalitesinin bağlı olarak, hücre genellikle 2 ila 3 gün sonra konfluency ulaşmak.</li>
	<li>Tripsinizasyon<ol>
<li>Büyüme ortamını dikkatle kaldırın ve hücreleri 10 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>10 cm çap plakalı hücrelere 2 mL% 0,025 tripsin/EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 °C ' de 2-3 dakika boyunca inküye yapın.</li>
		<li>Hücrelerin mikroskobun altındaki hücreleri inceleyerek yüzeyden ayrılmasını sağlayın.</li>
		<li>Büyüme orta aynı miktarda ekleyerek tripsin sindirim sonlandırmak.</li>
		<li>Hücreleri 3 dakika için 200 x g 'de konik bir tüp ve Santrifüjlü hücrelere aktarın ve süpernatant atın.</li>
		<li>Yeniden resuspend hücreleri dikkatle taze büyüme ortamında, saymak hücreler ve tohum onları yeni plakalar içinde öngörülen hücre yoğunluğu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Non-senesans alt ekimi Split confluent hücreleri 1:4 ve başka bir geçiş için uzatmak 3% O2, 37 °c daha fazla hücre verim (geçiş 1). Not: Bu noktada hücreler ya kültürde muhafaza edilebilir veya sıvı azot daha sonra kullanmak için saklanan, kriyovials yaklaşık 1.000.000 hücreleri içeren her. Bu adım aynı zamanda tek hayvan analizinden gelen varyasyon azaltmak için farklı hayvanlardan hücre karışık bir toplu oluşturmak için imkanı sunuyor.</li>
	<li>Hücre yaşlılığı, tohum bölünmüş konfluent hücrelerini 1:4 oranındaki geçiş 1 ' e kadar teşvik etmek ve onları% 20 O2, 37 °c, 5% Co2 ' ye 3 gün boyunca inküymek için; Bu kültür koşulları oksijen için atmosferik. Not: ortam oksijen konsantrasyonları altında hücreler ve blastosist ekimi özellikle DNA hasar onarımı34,35,36özürlü olduğunda hücresel senesans belirteçleri yükseltedersin.</li>
	<li>2 daha fazla geçiş için bu yordamı tekrarlayın.</li>
	<li>Hücresel senescence izlemek için, gelişmiş Coulter hücre sayacı sistemi kullanarak her tripsinization adım sırasında hücre çapı ve hücre hacmi kademeli artış ölçmek.</li>
	<li>Denklem kullanarak nüfus ikiye katlama (PD) belirlenmesi ile hücre proliferasyonu azalma değerlendirmek PDT = (t2-t1)/3,32 x (log n2 – log n1) Not: nüfus iki katına zaman sadece olmayan-parlak hücreler için kullanıldı.</li>
	<li>Erken geçiş Wild-Type veya Ercc1-/- MEF hücreleri% 3 O2, 37 °c, 5% Co2 olarak tutulmamış kullanımı olmayan-senesans kontrol hücreleri.</li>
</ol>2. senesans ilişkili β-GAL tarama tahlil – 2-3 gün
<ol><li>Test edilecek tüm ilaçların DMSO 'da 10 mM stok solüsyonu hazırlayın ve-80 °C ' de alquots 'u saklayın. Bu ilaçların etkinliğini azaltabilir gibi donma-çözülme stok çözümleri yok. Not: burada, HSP90 inhibitörü 17DMAG özellikle parlak hücreler17öldürme yeteneğine sahip bir senolitik ilaç olarak kullanıldı.
</li>
	<li>Deney gün, aliquot çözüyor, taze kültür ortamında ilaçlar seyreltmek ve büyüme ortamında son konsantrasyon verim için bir 1:1 oranında şartlık orta içeren hücrelere ekleyin.</li>
	<li>Seri dilüsyonlar ve uyuşturucu kombinasyonları için 96-iyi ön seyreltme plakaları kullanın. Not: MEF hücreleri Için, DMSO konsantrasyonlarının% 2 ' sini aşmaması ve kullanılan en yüksek DMSO konsantrasyonları ile tedavi edilen hücrelerin her çalıştırılmasına dahil edilmesi gereken ampirik olarak belirlenmiştir.</li>
	<li>Tohum 5 x 103 senesans hücreler ya da 3 x 103 iyi tabakalar başına 96 iyi plakaları en az 6 h tedavi önce 100 μL büyüme orta ve Inkük 20% O2, 37 °c, 5% Co2. Not: hücreler yaklaşık 80% tedavi öncesi confluent olmalıdır.
</li>
	<li>Floresan sinyal Crosstalk ve arka planı en aza indirmek için 96 iyi plakalar tedavi siyah duvar/Clear alt doku kültürü kullanın. Not: ancak, açık plakalar da başarıyla test edilmiştir.</li>
	<li>MEF hücrelerine ilaç dilüsyonları ekleyin ve 24 h için 48 h altında 20% O2, 37 °c,% 5 Co2 koşullar inkük.</li>
	<li>% 3 O2, 37 °c,% 5 Co2 koşulunda olmayan parlak hücreleri tutun.</li>
	<li>Lizozomal alkali için, 10 mm bafilomycin a1 solüsyonu hazırlayın, kısım ve-20 °c ' de donmuş tutun.</li>
	<li>SA-β-GAL aktivitesinin floresan analizi için 2 mM C12fdg Stock solüsyonu hazırlayın,-20 °c ' de saklayın ve ışıktan koruyun.</li>
	<li>Çalışma çözümü için, deneme gününde 100 μM C12fdg büyüme ortamına hazırlanın. Not: C12fdg içeren tüm (Kuluçk) adımlar karanlıkta yapılmalıdır.</li>
	<li>100 μL 1x PBS ile ilaç çözümünü çıkarın ve hücreleri 1 kez yıkayın.</li>
	<li>% 20 O2, 37 °c, 5% Co2' de 1 saat boyunca taze hücre kültürü ortamında hazırlanan 100 Nm bafilomycin a1 çözeltisi 90 μL ile hücreleri ön tedavi ederek lizozomal alkali atıklaştırma.</li>
	<li>Kültür ortamına 10 μL 100 μM C12fdg çalışma çözümü ekleyin (son konsantrasyon 10 μM).</li>
	<li>Hücreleri 2 saat boyunca kulbe etme.</li>
	<li>Kültür için 2 μL 100 μg/mL Hoechst 33342 boya (son konsantrasyon 2 μg/mL) ekleyin ve 20 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve 100 μL taze büyüme ortamını ekleyin.</li>
</ol>3. nicel yüksek içerik floresan görüntü analizi
<ol><li>Hoechst ve C12FDG floresans (örneğin, DAPı ve FITC kanal hazır ayarları, sırasıyla) yakalama için uygun iki kanalda hücrelerin floresan görüntüleri elde etmek için yüksek içerik floresan görüntü edinme ve analiz platformu kullanın. Not: edinme protokolleri, tahlil için spesifik olan çeşitli değişkenlerin tanımını gerektirir. Bir edinme protokolünün amacı, akım nicel analizi için yeterli sayıda hücre içinde yeterli sayıdaki odaklama floresan görüntüsünü yakalamakta.</li>
	<li>Her kanal seçerek ve tanımlama, bir veya daha fazla seçici ölçüt ayarlayarak, her kanaldaki ilgi özelliği olarak niteleyen uygun bir analiz Protokolü geliştirin.<ol>
<li>Çekirdek için, bu kadar segmentasyon ön setleri kullanın (örneğin, nükleer segmentasyon, vezikül segmentasyon, sitoplazma segmentasyon) bu morfoloji dahil olmak üzere birden fazla ölçüt temelinde hücresel organel tanımlaması sağlayacak, boyutu, ve sinyal Yoğun -luğu. Bir sinyal olabilir, ama hangi, örneğin, çok büyük ya da çok küçük çekirdekler gibi nükleer parçaları ve enkaz hariç iken çekirdekleri dahil etmek için bu ölçütleri ayarlayın.</li>
		<li>Parçalanabilen C12fdg 'den floresans olan fitc kanalındaki sinyali kontrol edin ve hücrelerde senescence ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin miktarını temsil eder. Not: parlak hücreler, daha yüksek bir yaşlılığı ilişkili β-galaktosidaz aktivitesine sahip olmayan-durgun hücrelerden; Ancak c 12fdg floresan, c 12 fdg-Positive ve c12fdg-negative hücre olarak düşünülür arasında bir eşik kurulması gerektiren,ayrık ve sürekli olmayan olacak.</li>
		<li>Ticari olarak kullanılabilen analitik yazılımları kullanarak, çekirdeğin çevresindeki tanımlanmış bir bölgenin (varsayımsal bir hücre) üst eşik C12fdg ile en az bir kez örtüşmüş olduğu örneklerin sayısını üretir. Not: analitik yazılım otomatik olarak hedef bağlama kullanarak bir sayım oluşturur. Bu bir senesans, C12fdg-pozitif hücre tahlil 's pratik tanımı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her iyi ve ortalama değerleri ve standart sapmaları buna göre hesaplanır 3-5 alanları ile triplicate tüm örnekleri analiz edin.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak senesans hücrelerin yüzdesini hesaplayın: Senesans hücreler (%) = <img alt="Statik denge formülü, hücre biyolojisi araştırmaları için yaşlanma oranı diyagramı." src="/files/ftp_upload/58133/58133eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> x 100</li>
</ol>4. tahlil doğrulama parametreleri
<ol><li>Tüm örnekler için-ve inter-tahlil varyasyonları katsayısı (% CVs) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: Intra-assay CV (n = 10 tekrarlar bir denemede ölçülür <img alt="Ortalama hesaplamayı gösteren denklem, formül: ortalama/n, eğitimsel matematik bağlamı." src="/files/ftp_upload/58133/58133eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> ) = x 100 (%) Inter-assay CV (n = 5 bağımsız deneyler) = <img alt="Ortalama hesaplamayı gösteren denklem, formül: ortalama/n, eğitimsel matematik bağlamı." src="/files/ftp_upload/58133/58133eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> x 100 (%)</li>
	<li>Tarama amacıyla, Z ' değerini belirlemek, bir tahlil kalitesini değerlendirmek için bir istatistiksel parametre, ile tedavi hücrelerinden 200 nM Rapamycin 24 h için 20% O2, 37 °c, 5% Co2 (senoterapötik ilaçlar için olumlu bir kontrol) ve tedavi edilmemiş (negatif kontrol). Not: Z ' değeri Zhang ve al.37göre hesaplanır. Z ' değerleri 0,5 ve 1 arasında bir tahlil ilaç taraması için kullanılabilir olduğunu gösterir.</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

SA-β-GAL, aslında dimri ve Al tarafından keşfedilen hücresel yaşlanma için iyi tanımlanmış bir biyomarker . (1995) pH 623 ' de proliferasyon hücrelerine göre değerlendirildiğinde, senesans insan fibroblastların sa-β-GAL aktivitesinin arttığını gösteriyor. Bu arada, In vitro ve In vivo tahlil için sa-β-GAL farklı hücre tipleri ve dokular için kurulmuştur25,39,40. Bu protokolde açıklanan canlı hücr...

Hücresel yaşlanma Leonard Hayflick ve Paul Moorhead, normal hücrelerin kültür1çoğalmak için sınırlı bir yeteneği olduğunu gösterdi tarafından ilk kez tanımlanmıştır. İnce hücreler besin varlığı, büyüme faktörleri ve temas inhibisyonu eksikliği rağmen çoğalırlar başarısız, ancak metabolik olarak aktif kalır2. Bu fenomen çoğaltıcı yaşlanma olarak bilinir ve ağırlıklı olarak telomer kısaltma atfedildi, en azından insan hücrelerinde3. Daha fazla çalışmalar, hücrelerin aynı zamanda diğer uyaranlara yanıt olarak, Onkojenik stres (onkojen indüklenen senesans, OIS), DNA hasarı, sitotokleş ilaçlar veya ışınlama (stres indüklenen yaşlanma, SIS)4 gibi senesans geçmesi indüklenmiş olabilir göstermiştir , 5 , 6. DNA hasarına yanıt olarak, telomer erozyonu dahil, hücreler ya senesce, kontrollü hücre büyümesini başlatmak, ya da hasar onarılamaz eğer apoptozis geçmesi. Bu durumda, hücre yaşlanma bir tümör bastırıcı şekilde davranır gibi yararlı görünüyor2. Bunun aksine, DNA hasarı da dahil olmak üzere hücresel hasar birikimi nedeniyle yaşlanma ile senesans artar. Sert hücreler sitokinleri, metalloproteinazlar ve büyüme faktörlerini salgılayan, yaşlılık ilişkili salgı fenotipi (SASP) olarak adlandırılan bu yana, hücresel senesans ve SASP bu yaş bağımlı artış azaltılmış doku homeostaz katkıda ve daha sonra yaşlanma. Ayrıca, yaşlılık yükü bu yaş bağımlı artış metabolik hastalıklar, stres hassasiyeti, Progeria sendromlar, ve7,8 iyileşme bozulmuş ve kısmen, çoğunlukla sorumlu olduğu bilinmektedir çok sayıda yaş ile ilgili hastalıklar, ateroskleroz gibi, osteoartrit, kas dejenerasyonu, ülser oluşumu, ve Alzheimer hastalığı9,10,11,12,13. Sertleşme hücrelerinin giderilmesi, doku fonksiyon bozukluğu önlemeye veya geciktirmeye ve healthspan14' e uzatmaya yardımcı olabilir. Bu transgenik fare modelleri14,15,16 yanı sıra hem ilaç tarama çabaları ve Biyoinformatik analizi ile keşfedilen senolitik ilaçlar ve ilaç kombinasyonları kullanarak gösterildi Özellikle senesans hücrelerde indüklenen yollar17,18,19,20,21,22. Daha optimal senoterapötik ilaçların belirlenmesi, daha etkili bir şekilde parlak hücre yükünü azaltabilir, sağlıklı yaşlanma için terapötik yaklaşımlar gelişiminde önemli bir sonraki adımdır.
Parlak hücreler, hem kültürde hem de in vivo karakteristik fenoipik ve moleküler özellikleri gösterir. Bu senesans belirteçleri ya neden ya da senesans indüksiyon sonucu ya da bu hücrelerde moleküler değişikliklerin bir yan ürün olabilir. Ancak, hiçbir tek Marker özellikle parlak hücrelerde bulunamadı. Şu anda, yaşlanma-ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-GAL) algılama, en iyi karakterize ve kurulan tek hücreli temel yöntemlerle yaşlanma in vitro ve In vivo ölçmek için biridir. SA-β-GAL pH 4 ' de optimum enzimatik aktivite ile lizozomal hidrolaz 'dir. PH 6 ' da aktivitesini ölçmek mümkündür, çünkü senesans hücreler daha fazla lizozomal etkinliğini gösteriyor23,24. Yaşayan hücreler için, artmış lizozomal pH, vakolar H+-ATPaz inhibitörü bafilomisin a1 veya endozomal asitleştirme inhibitörü chlorokine ile lizozomal alkali ile elde edilir25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranoside (C12FDG), 12 karbon lipophilik kısım25nedeniyle hücrelerde parçalanabilen ürün korur gibi yaşayan hücrelerde substrat olarak kullanılır. Daha da önemlisi, SA-β-GAL aktivitesinin kendisi, doğru bir şekilde herhangi bir yol ile doğrudan bağlı değildir ve senesans vermek için gerekli değildir. Bu tahlil ile, yaşlı bireylerin cilt biyopsileri gibi heterojen hücre nüfusu ve yaşlanma dokularında bile, düzensiz hücreler tespit edilebilir. Ayrıca, çeşitli organizmalar ve koşullarda27,28,29, parlak hücre algılama için güvenilir bir marker olarak hücre yaşlanma ve yaşlanma23 arasında bir korelasyon göstermek için kullanılmıştır 30' a kadar. Burada, yüksek verim sa-β-GAL tarama tahlil floresan substrat dayalı C12fdg birincil fare embriyonik fibroblastlar kullanarak (MEFS) sağlam oksidatif stres indüklenen hücre yaşlanma açıklanan ve avantajları ve dezavantajları ele alınmaktadır. Bu tahlil farklı hücre türleri ile yapılabilir rağmen, Ercc1-eksikliği kullanımı, DNA tamir MEFS oksidatif stres koşullarında daha hızlı senesans indüksiyon için izin verir. Farelerde, DNA onarımının azaltılmış ifadesi ERCC1-XPF bozulmuş DNA onarımı, endojen DNA hasarının hızlandırılmış birikimi, yükseltilmiş ROS, mitokondriyal disfonksiyon, artmış parlak hücre yükü, kök hücre fonksiyonunun kaybı ve erken yaşlanma, doğal yaşlanma benzer31,32. Benzer şekilde, Ercc1-eksikliği MEFS kültür17daha hızlı bir şekilde yaşlanma geçmesi. İnanılmaz MEF tahlil önemli bir özelliği, her iyi, parlak hücre spesifik etkileri net gösteri için izin, parlak ve non-parlak hücrelerin bir karışımı vardır. Ancak, biz primer hücrelerde oksidatif stres kullanımı daha fizyolojik olduğunu inanıyoruz rağmen, bu tahlil aynı zamanda yaşlanma DNA zararlı ajanlar etoposid veya ışınlama gibi indüklenen hücre hatları ile kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>orta</td></tr><tr><td>Jambon F10</td><td>Gibco</td><td>12390-035</td><td>orta fetal</td></tr><tr><td>sığır serumu</td><td>Doku Kültürü Biyolojikler</td><td>101</td><td>serum</td></tr><tr><td>1x esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td>amino asitler</td></tr><tr><td>bafilomisin A1 ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td>lizozomal inhibitör</td></tr><tr><td>C12FDG</td><td>Setareh Biotech</td><td>7188</td><td>b-Gal substrat</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>H1399</td><td>DNA interkalasyon ajanı</td></tr><tr><td>17DMAG</td><td>Selleck Chemical LLC</td><td>50843</td><td>HSP90 inhibitörü</td></tr><tr><td>InCell6000 Hücre Görüntüleme Sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi</td></tr></tbody></table>

senoterapötik ilaçların tanımlanması için sa-β-galactosidaz tabanlı tarama tahlili

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Hücre yaşlanma olumsuz sağlıklı bir ömrünü etkileyen bilinen yaşlanma damgasını biridir. Özellikle hücre kültüründe, denir senolytikler, güçlü hücreleri öldürebilir ilaçlar, in vivo ve genişletmek healthspan içinde parlak hücre yükü azaltabilir. Senolytikler birden fazla sınıf HSP90 inhibitörleri, bcl-2 aile inhibitörleri, piperlongumine, bir FOXO4 inhibitör peptid ve Dasatinib/Quercetin kombinasyonu dahil olmak üzere bugüne kadar tespit edilmiştir. Daha yüksek bir lizozomal pH 'da sa-β-GAL tespiti, parlak hücrelerin tespiti için en iyi karakterize işaretliklere biridir. Canlı hücre ölçümleri ile ilişkili β-galaktosidase (SA-β-GAL) etkinliğini kullanarak floresan substrat C12fdg ile kombinasyon halinde toplam hücre numarasının belirlenmesi ile birlikte bir DNA enterkalasyon Hoechst boya imkanı açar (senolytics) ya da SA-β-Gal ve diğer fenotipleri (senomorfik) önleyici hücreleri öldürerek ya da genel SA-β-GAL etkinliğini azaltan senoterapötik ilaçlar için ekran. Yüksek içerik floresan görüntü edinme ve analiz platformu kullanımı SA-β-GAL, hücre Morfoloji ve hücre numarası üzerinde etkileri için ilaç kütüphaneleri hızlı, yüksek verim taraması için izin verir.

SA-β-GAL aktivite çoğaltıcı tükenmesi, genotoksisik ve oksidatif stres, onkojen aktivasyonu için çeşitli şekillerde senesce indüklenen hücrelerde tespit edilebilir23,25,38. Geçerli modelde Ercc1-eksikliği fare embriyonik fibroblast hücreleri kullanarak, normoxic büyüme koşulları (20% O2) birkaç pasajlar için onları yetiştirdikten sonra hücre yaşlanma ikna etmek için yeterli ol...

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Burada ilk kez yaşlanmaya bağlı hastalıklarda yararlı olduğu gösterilmiştir senoterapötik bileşikler için yüksek iş itme ilaç tarama sağlayan bir yöntem açıklar. Aslında, bu özünde test edilen ilaçlar ile çeşitli klinik çalışmalar şu anda devam etmektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı senoterapötik ilaçların iki tip ayırt etmektir, senolitik ve senomorfikler, senescent hücrelerde SA-beta-Galaktosidaz iyi tespit kullanarak.Bu teknik yeni senoterapötik bileşikler için önemli bir tarama aracıdır. Aslında, bu ekran yardımıyla tespit edilmiş çeşitli bileşikler çeşitli yüksek profilli yayınlarda yer almaktadır, ve klinik deneme şu anda bulunmaktadır. Bu teknik son derece çok yönlüdür ve birkaç yüksek işlem ekranlarına uyarlanabilir.Aslında, çok katlı ekranlar için mümkündür, ve birkaç yollarından birinin aktivasyonu veya inhibisyonu yoluyla senescence bastırmak bileşikler için ekran. Her embriyoyu bir milimetrelik parçalara ayırın ve birkaç kez yukarı ve aşağı boru. Daha sonra, her embriyodokularına 10 mililitre büyüme ortamı ekleyin.10 santimetrelik bir kültür kabına koyun ve 2-3 gün boyunca %3 oksijen ve %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ve her embriyonun geri kalanını

sa-galactosidase-based-screening-assay-for-identification

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Bu videoda, kanser hücrelerinde ilaca bağlı sitotoksisiteyi ölçmek için yüksek verimli kolorimetrik tarama testi, sülforhodamin B testi açıklanmaktadır. Tahlil, hücresel protein içeriğine dayalı olarak hücre yoğunluğunu ölçerek ilaç direncini belirler.

Sülforhodamin B Testi: Kanser Hücrelerinde Hücresel Protein İçeriğinin Belirlenmesi Yoluyla İlaç Direncini Ölçmek İçin Hassas Bir Test

Bu videoda, ilaçların hassas ve hızlı taranması için biyolüminesans testinin faydasını vurgulayan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu ilaçlar, etki şekillerindeki sinerjizmi değerlendirmek için tek başına veya kombinasyon halinde test edilebilir.

Hücresel Biyolüminesans Tabanlı Test: Kombinatoryal İlaç Taraması için Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu videoda, β-galaktosidaz enzimini eksprese eden bir parazit olan Trypanosoma cruzi'ye karşı tripanosidal bir ilacın sitotoksik potansiyelini belirlemek için basit ve sağlam bir yöntemi açıklıyoruz. β-galaktosidaz bir hücre lizis göstergesi olarak hizmet eder ve aktivitesi ilacın etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Parazitlerde İlaca Bağlı Sitotoksisiteyi Değerlendirmek için β-Galaktosidaz Testi

Bu video, çift yaşlanma belirteçleri ile tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Yaşlanan hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi, bir β-galaktosidaz substratının kullanılmasını içerir. Substrat, yaşlanan hücreler içindeki aktif lizozomal β-galaktosidaz ile parçalanır ve otofloresan lipofusin granülleri ile birlikte yaşlanan kanser hücrelerini işaretleyen bir floresan ürün üretir.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinin Akış Sitometrisine Dayalı Miktar Tayini

Glutatyon S-transferazlar (GSTs) çok sayıda kemoterapötik ilaçların metabolizmasında rol oynayan detoksifikasyon enzimleridir. GST'lerin aşırı ekspresyonu kanser kemoterapi direnci ile ilişkilidir. Bu fenotip karşı bir yolu inhibitörleri kullanmaktır. Bu protokol, potansiyel GST inhibitörlerini taramak için spektrofotometrik bir test kullanarak bir yöntem tanımlar.

Sitosolion Glutatyon S-Transferazlarının Potansiyel Inhibitörleri için Spektrofotometrik Tarama

Glioma kök hücreleri (GSC' ler), en yaygın ve yıkıcı primer beyin tümörü olan glioblastomda (GBM) tümör başlatma, anjiogenez ve ilaç direncinde önemli roller oynayan kanser hücrelerinin küçük bir kısmıdır. GSC'lerin varlığı GBM'yi hedeflenen ajanların çoğu için çok refrakter hale getirir, bu nedenle potansiyel etkili kombinasyon terapötiklerini tanımlamak için yüksek verimli tarama yöntemleri gerekir. Protokol, sinerjik etkileşim ile potansiyel kombinasyon tedavisi için hızlı tarama sağlamak...

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Kemoterapi ilaçlarının hücre kültüründe veya murin tümör modellerinde indüklediği yaşlanan kanser hücrelerinin floresan, akım sitometrik nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur. İsteğe bağlı prosedürler arasında ko-immün boyama, büyük parti veya zaman noktası analizini kolaylaştırmak için numune fiksasyonu ve akış sitometrik sıralama ile canlı yaşlanan hücrelerin zenginleştirilmesi yer almaktadır.

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Burada, insan γ-sekretazı yeniden yapılandıran bir maya sistemini tarif ediyoruz. Bu sistem, aktiviteyi etkileyen mutasyonların tanımlanmasına ve incelenmesine ve γ-sekretaz inhibitörlerinin (GSI'ler) taranmasına izin verir. Ailesel Alzheimer hastalığı mutantlarının fonksiyon kaybı özelliklerini kullanarak, γ-sekretaz modülatörlerini (GSM'ler) taramak mümkündür.

Saccharomyces cerevisiae Amiloid Beta Üretimini Etkileyen Genleri, Mutasyonları ve Kimyasalları γ-Sekretaz ile Taramak için Alzheimer Hastalığı Modelleri

Öğrenin senoterapötik ilaçları yüksek verimli tarama yöntemiyle tanımlamayı. SA-beta-Galactosidase aktivitesi ölçülerek senolitik ve senomorfik ilaçlar ayırt edilir. Bu teknik yaşlanma hastalıkları için yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Daha fazla video keşfet