Pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler Cardiomyocytes alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen

İndüklenen Pluripotent Kök veya IPS hücrelerinden üretilen kardiyomiyositler, kardiyak elektrofizyoloji alanındaki çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu teknolojinin ana avantajları, ventriküler özel bir organizatör unsuru kullanarak, miyosit ler gibi ventriküler durumlarda üretimde dramatik bir artış alabilen ve alt tipe özgü eylem potansiyeli kayıtları sağlamasıdır. Lentiviral transdüksiyon yoluyla genetik olarak kodlanmış voltaj sensörlerinin devreye sokulmasına izin veren insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit etki potansiyellerinin optik görüntülemesi.

Kardiyomiyosit bakım ortamı ile lentivirus içeren hücre kültürü supernatant karıştırarak başlayın, bir e-bir oranda. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için mililitre başına 8 mikrogram son konsantrasyonda heksadimetherine bromür ekleyin. Ve IPS hücre kaynaklı kardiyomiyosit kültür çanak kardiyomiyosit bakım ortamı değiştirin, enfeksiyon orta ile.

Kültür 37 santigrat derece 12 saat boyunca enfekte kardiyomiyositler, ve taze kardiyomiyosit bakım ortamı ile enfeksiyon orta değiştirin. Görüntülemeden önce, tyrode çözeltisi ile hücre kültürü orta değişimi, kalsiyum ile takviye. Daha sonra kardiyomiyositleri bir görüntü ayırıcıile donatılmış ters epifloresan mikroskobun sahnesine bir görüntüleme odasına yerleştirin.

Elektriksel pacing gerekiyorsa, görüntüleme odasına pacing elektrotlar yükleyin ve elektrotları bir uyarıcı jeneratöre bağlayın. Hücreleri odak noktası haline getirin ve izleme alanının merkezinde genetiği kodlanmış voltaj göstergesini ifade eden bir hücre bulun. Optik yolu, yayılan ışığın görüntü ayırıcısına yönlendirilecek şekilde ayarlayın ve mikroskoptaki filtre küpünü görüntü ayırıcıdaki filtrelerle birlişecek şekilde değiştirin.

Kamerayı kontrol eden yazılımda, satın alma ayarını yüksek hızlı görüntülemenin mümkün olması için ayarlayın ve görüntü ayırıcısını üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. İki farklı emisyon dalga boyu bandını temsil eden iki görüntü, her biri görüntünün yarısını işgal eden birbirine bitişik olmalıdır. Kamera tarafından üretilen görüntünün odağının gerektiği gibi kontrol edin ve ayarlayın.

Ve aydınlatma ışığının parlaklığını ayarlayarak piksel doygunluğunun önüne geçti. Zaman serisinin kazanılmasını ayarlayın ve ölçümü etkileyen başıboş ışığın önüne çıkmak için odadaki ışığı karartın. Daha sonra uyarma ışık deklanşöraçına açın ve deneysel olarak uygun olduğu gibi, uygun zaman noktasında elektrik volta başlatma, görüntü serisinin edinimi başlar.

Satın alma tamamlandığında, uyarma ışığı deklanşöre gerektiği gibi kapatın ve kaydı sabit diske kaydedin. Ardından, kayıt ayarını değiştirmeden bırakarak, arka planı hücre siz kapak lı bir bölge üzerinden kaydedin. Optik membran potansiyel kayıtlarının analizi için, ImageJ'deki hücreleri içeren tiff destesini açın ve serbest el seçim aracını kullanarak floresan kardiyomiyositin üzerine bir ilgi alanı çizin, kırmızı kanalda, hücrenin sözleşme sırasında bölgeden taşınmayacak kadar büyük olmasına dikkat edin.

Ardından, İlgi Alanı 1 olarak bölgeyi eklemek için Analiz et, Araçlar, İlgi Alanı Yöneticisi'ni ve T Ekle'yi seçin. İlgi çekici bölgeyi yeşil kanaldaki aynı hücre üzerinde sürükleyin ve bu bölgeyi İlgi Alanı 2 olarak ekleyin. Ölçümleri Analiz et ve Ayarla menülerinde, Ortalama gri değeri dışındaki tüm seçenekleri seçin.

İlgi Alanı Yöneticisi'nde, Tüm dilimleri Ölçüle'yi ve dilim başına bir satırı seçmek için Daha Fazla ve Çoklu Ölçü'yi tıklatın ve Tamam'ı tıklatın. Üç satırlı bir elektronik tablo içeren bir pencere açılır. Elektronik tabloyu virgülle ayrılmış değer dosyasına kaydetmek için Dosya ve Kaydet'i kullanın. İlgi Alanı Yöneticisi penceresini kapatmadan resim yığını ve elektronik tablo penceresiyle pencereyi kapatın ve arka plan ölçümlerini içeren tiff yığınını açın.

İlgi Alanı Yöneticisi'nde, Tüm dilimleri Ölç'ü ve dilim başına bir satırı seçmek için Daha Fazla ve Çoklu Ölçü'yi tıklatın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından arka plan verilerini ayrı bir csv dosyasına kaydedin. Burada, rfp ve GFP kanallarında görüntüleme analizi sırasında çizilen ilgi bölgelerini işaretleyen beyaz noktalı çizgilerle temsili tek bir IPS hücre türetilmiş kardiyomiyosit gösterilmiştir. RFP kanalından gelen sinyal, membran potansiyelindeki değişikliklerin neden olduğu artan zorunlu veya rezonans enerji transferi nedeniyle her bir eylem potansiyeli sırasında floresan yoğunluğunda periyodik bir artış olduğunu göstermektedir.

Buna uygun olarak, GFP sinyali floresan yoğunluğunda periyodik bir azalma gösterir. RFP/GFP oranı, eylem potansiyeli süresi 50 ve 90 ölçümleri gibi akış aşağı analizlerinde kullanılan biyolojik sinyaldir. Örneğin, bu yöntemi kullanarak, 0.5 Hertz yerleştirilen IPS hücre kaynaklı kardiyomiyositler gibi 30 günlük ventriküler, ortalama bir eylem potansiyel süresi gösterdi 50 439 milisaniye, ve ortalama bir eylem potansiyel süresi 90 520 milisaniye.

IPS hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin her beş atımda her beş atımda artan stimülasyon oranlarında elektriksel uyarım, dayak hızı arttıkça etki potansiyellerinin kademeli olarak kısaldığını göstermiştir. Ayrıca, izoproternol ile kendiliğinden yenen IPS hücre kaynaklı kardiyomiyosittedavisi, nonselektif beta adreno reseptör agonist, dayak hızında hızlı bir artışa yol açtı, bu agonist artan dozlarda daha da artabilir. Bu yöntem klasik elektrofizyolojik ölçümlere göre üstün iş akışı sağlarken, floresan gerilim sensörünün içsel kinetik özellikleriyle sınırlı olan zamansal çözünürlük de dahil olmak üzere sınırlamalarının farkında olmak gerekir.