Name: Pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler Cardiomyocytes alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Öğrenin, iPS hücre kaynaklı ventriküler kardiyomiyositlerde optik aksiyon potansiyeli kaydı yöntemini. Lentiviral transdüksiyon ve genetik voltaj sensörleriyle kalp elektrofizyolojisi araştırmalarında yüksek verimlilik sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Alman Araştırma Vakfı (Si 1747/1-1), başka Kröner-Fresenius-Stiftung ve Deutsche Stiftung für Herzforschung gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması IPSC kaynaklı Cardiomyocytes görüntüleme
Not: Yöntem IPSC kültür ve kardiyak farklılaşması için12,13,14 önce yayınlandı ve burada ayrıntılı olarak ele değil. Arıtma IPSC-CMS manuel mikrodiseksiyon, manyetik hücre ayırma veya laktat seçim tarafından kullanılan farklılaşma iletişim kuralı bağlı olarak tavsiye edilir. Aşağıdaki iletişim kuralı için oluşturulan alanları, dayak üzerinden microdissected explants monolayer farklılaşma Protokolü13kullanarak, kardiyak ayırt etme günü 15 ve fibronektin kaplı plakalar üzerinde 30 güne kadar açıklandığı gibi kültürlü 10' dan önce.
<ol><li>Hücre kültür plakaları kuluçka makinesi dışarı almak ve el ile kardiyak explants 200 µL pipet kullanarak microcentrifuge tüpler içine toplamak. Sedimantasyon sonra hücre kültürü süpernatant Aspire edin ve yavaşça'nın 2 x Hank ile dengeli explants tuz yıkama çözüm (HBSS).</li>
	<li>Collagenase tip II ekleyerek IPSC-CMs ayırmak (430 U/mL HBSS) ve onları 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Sonra kalan büyük hücreli sedimantasyon kümeler, Disosiye tek IPSC CMs içeren süpernatant toplamak ve bu yüksek fetal Sığır serum (FBS) konsantrasyonu (DMEM-F12, %20 FBS, 2 mM içeren taze CM bakım ortamına Ekle L-Glutamine, 1: 100 MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 0,1 mM β-mercaptoethanol).</li>
	<li>Büyük hücreli kümeleri kalır ayrılma işlemini yineleyin. Santrifüjü tarafından tek IPSC-CMs ve onları CM orta düşük FBS konsantrasyon içeren resuspend toplamak (%2 FBS).</li>
	<li>Tek IPSC-CMs fibronektin (2 µg/cm2) ile kaplı bir 3,5 cm cam alt hücre kültür microdish üzerinde tek hücre sonraki görüntüleme sağlayan bir yoğunluk içinde yeniden tohum. Tohumlama yoğunluğu yüksek üretilen iş deneylerde kavramasindan önce en iyi duruma getirme. Genellikle, 5 – 10 kardiyak explants ücret 3.5 cm çanak yeterli; Ancak, bu ağır explant boyut ve saflık bağlıdır.</li>
	<li>Sonra onların ayrılma CM bakım Orta % 2 içeren tek IPSC CMs kültür FBS en az 48 saat için yeterli bir malın güvenliğini garantiye almak için. Not: sonraki adımda IPSC CMs kodlama GEVI VSFP-ventriküler özgü GEVI ifade ulaşmak için CR MLC2v artırıcı10 kontrol altında bir lentivirus ile transduced. Alternatif olarak, lentiviral yapıları GEVI nodal veya atriyal-benzeri hücrelerde özellikle ifade etmek için izin veya belirsiz bir yapı ubiquitously ifade PGK organizatörü yataklık kullanılan10olabilir. Lentiviral plazmid talep üzerine temin edilmektedir. Dikkat: lentiviral parçacıkları ile çalışırken, çalışma ortamı potansiyel enfeksiyöz ajanlar ile çalışmak için güvenlik talimatları için uygun ve gerekli güvenlik önlemleri yeterli Biyogüvenlik düzeyi olduğundan emin olun.</li>
	<li>Enfeksiyon orta lentivirus10karıştırılarak hazırlamak-HEK293 hücrelerde15, CMs bakım orta ile daha önce açıklandığı gibi üretilen hücre kültürü süpernatant, içeren (bkz. Adım 1.3) 1:1 oranında.</li>
	<li>Hexadimethrine bromür 8 µg/mL enfeksiyon verimliliği artırmak için son bir konsantrasyon ekleyin. Not: yüksek enfeksiyon nedeniyle verimliliği IPSC-CMs önceki konsantrasyon lentivirus ultrasantrifüj aracılığıyla, genellikle gerekli değildir.</li>
	<li>Tek IPSC CMs CM bakım ortamından Aspire edin ve 1.7 ve 1.8 adımları sırasında hazırlanan enfeksiyon orta yerine. Enfeksiyon orta 12 h 37 ° C'de için virüslü tek IPSC-CMs kültür Sonra orta Aspire edin ve tekrar CM bakım orta ile değiştirin. Not: GEVI bir floresan sinyal 48 h enfeksiyon sonra görünür. Membran potansiyeli kayıtları görüntüleme, enfeksiyon erken, sonra 72 h uygun sinyal gücü sağlamak için önerilir. Tek virüslü IPSC-CMs en az 3 hafta boyunca kültürlü ve sırayla görüntüsü. Geniş photobleaching bir görüntüleme oturumu sırasında oluşursa, floresans sinyal zaman içinde kurtarır.</li>
	<li>Görüntüleme önce hücre kültür orta Ca2 + ile desteklenmiş Tyrode'nın çözüm tarafından Döviz (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 1.8 mM CaCl2ve 10 mM HEPES; pH 7,35).</li>
</ol>2. optik membran potansiyeli kayıtları
<ol><li>Sahne Alanı'ndaki bir resim splitter, uygun filtre setleri ve bir kamera (Örneğin, bir sCMOS kamera) yüksek, yüksek hızlı görüntüleme yeteneğine sahip bir ters epifluorescence mikroskop IPSC CMs içeren görüntüleme odası yer duyarlılık. Not: Örneğin, 480/40 nm bant geçiren uyarma filtre kullanımı 500 nm uzun taramalı Dikroik ayna içinde mikroskop ile birlikte ve 568 nm uzun taramalı Dikroik ayna 520/28 ile kombine nm ve 630/75 nm bant geçiren emisyon filtrelerini resim splitter. Tek hücreli görüntüleme için en iyi sinyal / gürültü oranı yüksek büyütme, yüksek-sayısal-diyafram yağı daldırma amacı sağlar.</li>
	<li>Elektrik pacing gerekiyorsa, pacing elektrotlar görüntüleme odasında yükleyin ve bunları bir uyarıcı jeneratöre bağlayın. Not: 3,5 cm cam alt hücre kültür yemekleri iki platin elektrotlar bulunan ve donatılmış bir hız ayarlama iç metin kullanılır. Elektrotlar arasında yer alan hücreleri görüntüsü. Tipik hız ayarlama 5 ms dikdörtgen darbeleri süresi, 10 V/cm elektrot mesafe bir genliği ile parametreleridir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, bir ısıtmalı mikroskop sahne uzun vadeli görüntüleme isteniyorsa IPSC CMS istikrarlı bir sıcaklık görüntüleme veya hatta bir mikroskop kuluçka odası kurulumu sırasında emin olmak için kullanın.</li>
	<li>Hücreleri için odaklanmak ve GEVI görüntüleme alanının ortasına ifade bir hücreye yerleştirin. Not: Bu en uygun göz mercekleri yeşil flüoresan protein (GFP) veya kırmızı bir floresan protein (RFP) filtre GEVI ifade hücreleri tanımlamak için küme kullanma mikroskop kullanarak yapılır.</li>
	<li>Optik yolunu ayarlama böylece ışık yayılan resim ayırıcı yönlendirilir. Resim splitter filtrelerde ile kombine olarak bir geçiş yapmak filtre küp mikroskobu ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Kamera kontrol yazılımı, yüksek hızlı görüntüleme (Örneğin, 100 kare / saniye çekim hızı kare başına 10 MS ile) mümkündür satın alma ayarlarını ayarlayın. Not: Genellikle, bu kamera piksellerinin binning içerir (Örneğin, 8 x 8 piksel kamera Chip binned bir piksel hızlandırılmış film oluşturmak için).</li>
	<li>Resim splitter üreticinin yönerge göre ayarlayın. İki farklı emisyon dalga boyu bantları temsil eden iki resim her bir işgal birbirine bitişik olmalıdır görüntü yarısı. Not: Bu adım olmak zorunda sadece 1 x görüntüleme her oturumun başlangıcında yapılır.</li>
	<li>Kontrol edin ve gerekirse, fotoğraf makinesi tarafından üretilen görüntü odağı ayarlayın.</li>
	<li>Böylece herhangi bir doygunluk piksellerin kaçınılması aydınlatma ışık parlaklığını ayarlayın; Bu en kolay doymuş piksel tarafından benzersiz bir renk temsil edildiği bir renk paletini kullanarak yapılabilir. Not: hazırlıklar sırasında görüntüleme önce örnek maruz kalma (yani, ışığı için genişletilmiş bir süre terk) gerekli miktar ışık uyarma sınırı GEVI photobleaching önlemek için.</li>
	<li>Saat serisi edinim kadar ayarını (Örneğin, bir dizi süresince 50 saniyede 100 kare 5000 fotoğraf s). Kaçak ışık ölçüm etkileyen önlemek için (bilgisayar monitörleri de dahil olmak üzere) odada ışık loş. Uyarma ışık çekim görüntüleme yazılımı tarafından denetlenmez, o sadece satın alma başlamadan önce açın.</li>
	<li>Görüntü serisi edinimi başlatın. Elektrik pacing isterseniz, otomatik olarak görüntüleme yazılımı tarafından başlatılan sürece uygun zamanda noktada pacing sıra başlatılır. Farmakolojik Ajan uygulanması isteseydim, bunu da el ile yapmak (Örneğin, 900 µL arabelleği içeren ve yavaşça pipet ile karıştırma kayıt odası'na on kat sonunda konsantrasyon aracının pipetting 100 µL tarafından) veya kullanarak bir Sabit akış perfüzyon sistemi.</li>
	<li>Satın alma tamamlandığında, gerekirse uyarma ışık panjurları kapa. Kayıt sabit diske kaydedin.</li>
	<li>Kayıt ayarları (yani, çekim hızı, kare hızı ve ışık şiddeti) değiştirmeden bırakarak, arka plan Floresan (aynı derecede içinde adım 2.11) kaydı hücreleri içeren değil coverslip bir bölge veya başka bir coverslip hangi Hayır işlemi hücreler seçilir. Not: ardıl ölçümler satın alma ayarları değiştirmeden gerçekleştirilmesi durumunda, yalnızca bir arka plan floresans kayıt bu ölçümler için gereklidir.</li>
	<li>İsterseniz, ek deneyler (adım 2.4-2.13) farklı IPSC-CMs aynı coverslip üzerinde yer alan gerçekleştirin. Bir uyuşturucu uygulandı diye coverslip tüm CMs etkilenecek unutmayın.</li>
</ol>3. analiz
> Not: (Bu genellikle kamera veya görüntüleme sistemi bütün floresans üreticisi tarafından sağlanan bir özel mülk yazılım paketi), kullanılan görüntüleme yazılımı üzerinde bağlı olarak kısmen alınan görüntülerin çözümlemeler, hatta mümkün olabilir tamamen bu yazılım paketinin içinde. Ancak, burada bir iş akışını ile gerçekleştirilen görüntü analizi ve açık kaynak yazılım (yani, görüntü analiz platformu ImageJ) elverişli bir konuma sahip gibi Fiji17ve R paket için bir dağıtım kullanılarak yüklenebilir16, istatistiksel bilgi işlem18 açıklanır. Kısaca, hücreleri veya arka plan gösteren faiz (ROIs) bölgelerinde ImageJ içinde çekilir ve zaman içinde bu ROIs içinde floresans demek o zaman, daha fazla R veya alternatif olarak, elektronik tablo yazılımı ile analiz edilecek bir dosyaya dışa aktarılır.
<ol><li>Görüntüleme yazılımındaki veya elde görüntüsü saat serisi (hücreleri içeren kayıt ve karşılık gelen arka plan kayıt) (Örneğin, TIF) ImageJ tarafından okunabilir bir biçime verme kaydedebilirsiniz. Alternatif olarak, ImageJ görüntüleme sistemi üreticileri farklı markalardan özel dosya formatlarını okuyabilir sağlayan yordamlar sağlar BioFormats eklentisi (https://imagej.net/Bio-Formats), kullanın. Not: Aşağıdaki adımları görüntüleme aralıkları boyunca kayıt aynı olduğunu varsayar. Yoksa, zamanlama bilgilerini görüntüleme yazılımı vermek ve daha fazla çözümleme eklemek gerekli olabilir.</li>
	<li>ImageJ hücreleri içeren TIF yığın açın.</li>
	<li>Floresan cardiomyocyte kırmızı kanal üzerinde bir yatırım getirisi çizmek için serbest seçim aracını kullanın. Hücrenin dışında yatırım getirisi taahhüt ederken hareket etmez böylece ROI kadar büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>ROI Yöneticisi eklenti açın ('analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi ') ve bu yatırım getirisi ROI1 eklemek için 'Ekle [t]' düğmesine basın.</li>
	<li>ROI yeşil kanal aynı hücreye sürükleyin ve bu yatırım getirisi ROI2 ekleyin.</li>
	<li>İçinde ' analiz | Ayarla ölçümlerin menüsü, 'gri değeri Mean'hariç tüm seçenekleri seçimini kaldırır. Not: Bu sadece 1 x ImageJ oturumlarınızda yapılması gerekiyor.</li>
	<li>ROI Yöneticisi'nde, basın ' daha | Multi ölçü ' düğmesi. 'Bütün dilimleri ölçmek' ve 'Dilim başına bir satır' seçeneklerini seçin ve "OK"tuşuna basın. Üç sıra (dilim numarasını ve kırmızı ve yeşil kanal hücre sırasıyla temsil eden iki ROIs ortalama floresans) içeren bir elektronik tablo içeren bir penceresi açılır.</li>
	<li>Kullanım ' dosya | Farklı Kaydet elektronik bir virgülle ayrılmış değer (CSV) dosyasına kaydetmek için.</li>
	<li>Görüntü yığını ile pencere ve elektronik tablo penceresini ROI Yöneticisi penceresini kapatmanıza gerek kalmadan kapatın. Arka plan ölçüm içeren TIF yığın açın.</li>
	<li>ROI Yöneticisi'nde, basın ' daha | Multi ölçü' düğmesi. 'Bütün dilimleri ölçmek' ve 'Dilim başına bir satır' seçeneklerini seçin ve "OK"tuşuna basın.</li>
	<li>Kullanım ' dosya | Farklı Kaydet elektronik tablonun arka plan verileri ile başka bir CSV dosyasına kaydetmek için. Not: Aşağıdaki hesaplamaları elektronik tablo yazılımı ile yapılabilir. Biz R yazılım18kullanılır. Dosya "cell.csv" ve "background.csv" hücre ve arka plan verilerinden hesaplamaları yapar ve membran potansiyeli sinyal zaman tabii araziler okur bir basit örnek komut dosyası ek kod dosyası 1sağlanmaktadır.</li>
	<li>Arka plan kaydından ortalama yoğunluğu kırmızı ve yeşil kanal içinde hesaplamak. Bu arka plan sinyal arka plan-düzeltilmiş RFP hesaplamak için kırmızı ve yeşil kanal hücreyi temsil eden sinyalleri ve GFP sinyalleri, sırasıyla çıkarma.</li>
	<li>Potansiyel membran için bir vekil olarak, RFP/GFP oranını hesaplamak. Not: Bu boyutsuz oranıdır. Alternatif olarak, ilk değeri (yani, ΔR/R0) için normalleştirilmiş. Önemlisi, yararlı bilgiler geçici değişiklikler yerine bu oran mutlak değerler yer alıyor. Nedeniyle düzensiz photobleaching GFP ve RFP satır taban çizgisi kayması bu oran içinde ortaya çıkabilir. Gerekirse, böyle bir satır taban çizgisi kayması temel eğri oluşturmak ve RFP/GFP oranı10' dan çıkarılarak tarafından düzeltilebilir konumdadir.</li>
</ol>

<ol><li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li>
<li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23(2017).</li>
<li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li>
<li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells%3A+A+state-of-art%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li>
<li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229(2017).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2865973/">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.R-project.org">http://www.R-project.org</a> (2008).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li>
<li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464(2017).</li>
<li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan yöntemi APs optik bir kayıt belirli alt türü (yani, ventrikül benzeri hücreler) CMs insan iPSCs oluşturulan üzerinden sağlar. İnsan IPSC-CMs büyük çeşitli biyolojik ve tıbbi sorunları çözmek için ortaya çıkan bir araç, ve farklılaşma farklı CM alt türlerinden için deneysel değişkenlik önemli bir kaynağıdır. Belirli organizatörü öğeleri kullanarak, bir GEVI ifade özellikle optik yansıma sonra alt faiz, türünü temsil eden CMs içinde elde edilir.
APs başarılı edinimi tek...

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) elde edilen Cardiomyocytes (CMs) olumsuz kalp ilaç etkileri1,2 kalp hastalığı yeni tedaviler, araştırmak için ve ekran için moleküler mekanizmaları incelemek için gelişmekte olan bir araçlardır ,3. En başından beri channelopathies gibi Aritmojenik hastalıklar bu araştırma alanı4önemli bir odak noktası olmuştur. Sonuç olarak, CMs, elektrik fenotipleri aritmiler veya Aksiyon potansiyeli (AP) türleri morfoloji, değişimler gibi araştırmak için bu teknolojiyi kalbinde yöntemlerdir.
Bir önemli dikkate IPSC-CMs uygulamada geçerli kardiyak farklılaşma protokolleri hücreleri homojen bir nüfusa neden olur. Bunun yerine, onlar, daha doğrusu sinüs düğümü, atriyal, andıran hücreler ve olgunlaşma5,6,7,8farklı düzeylerde ventrikül CMs bir karışımıdır. Bu heterojenlik ilgili bir kaynak olabilir deneysel değişkenliği, özellikle AP süresi (APD) gibi parametreleri incelenmiştir, hangi özünde farklı CM alt türleri arasında (Örneğin, APD içinde daha kısa ventrikül CMS atriyal). Bu sorunu çözmek için geleneksel yaklaşım tek IPSC-CMs yama kelepçe yöntemi kullanarak araştırmak için ise her hücre nodal olarak sınıflandırmak için-, atriyal-, veya ventriküler benzeri, onun AP morfoloji9dayalı. Daha sonraki herhangi bir analiz sonra CM alt faiz türünü temsil eden hücrelere kısıtlanabilir. Bu stratejinin önemli dezavantajı onun sınırlı performans ve ölçeklenebilirlik eksikliği var. Ayrıca, yama kelepçe Elektrofizyoloji invaziv doğası aynı hücreleri görüntüleme uzun süreler boyunca sırayla izin vermez.
Burada, biz optik APs IPSC-CMs belirli alt görüntü için geliştirilmiş bir yöntem10 deneysel ayrıntılar sağlar. Bu alt tür heterojenite sorununun üstesinden gelir ve daha fazla işlem hacmi IPSC-CMs genetik varyantların taşıyan veya maruz farmakolojik ajanlar olmak hızlı fenotipleme izin geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde artırır.
Alt tür özel optik görüntüleme yaklaşım genel bakış
Depolarizasyon ve hücre zarının repolarization floresans özelliklerini değiştirmek, bir genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI), optik görüntü değişiklikleri membran potansiyeli CMS için kullanılır. Burada uygulanan GEVI gerilim algılamalı floresan VSFP-CR11çifti bir yeşil (Yonca) ve kırmızı (mRuby2) Floresan protein (Şekil 1A) erimiş bir gerilim algılamalı transmembran etki alanı oluşur, proteindir. İki fluorophores yakın yakınlığı nedeniyle, bir kısmını kırmızı floresan protein üzerinden için Förster rezonans enerji transferi (FRET) aktarılan uyarma enerji yeşil flüoresan protein uyarma sonuçlanır. Bu nedenle, salma yeşil ve kırmızı floresan proteinler (Şekil 1A, üst panel) uyarma yeşil flüoresan protein sonuçlanır. Hücre depolarizes, Gerilim Algılayıcısı bir yapısal yeniden FRET verimliliği arttırma iki floresan protein bir hale gelmesini çeviren oluşur. Böylece, daha uyarma enerji yeşil kırmızı floresan protein için (Şekil 1A, alt panel) aktarılır. Sonuç olarak, depolarized hücrede yeşil floresans emisyon dimmer ise kırmızı floresans emisyon hücre membran potansiyeli (Şekil 1B) dinlenme, daha parlak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Şekil 1: membran VSFP-iade ile potansiyel optik görüntüleme VSFP-CR gösterilir voltaj duyarlı floresan protein eylem tasvir eden (A) A şematik. Hücre zarının depolarizasyon gerilim algılamalı transmembran etki alanındaki yapısal yeniden yeşil (GFP) ve kırmızı (RFP) Floresan protein, intramolecular Förster verimliliğini artırma hale gelmesini çevirir. rezonans enerji transferi (FRET). (B) emisyon spectra, GFP istirahat membran potansiyeli (üst paneli) hücreleri ve depolarized hücreleri (alt paneli) uyarma üzerine bir VSFP tasvir edilmektedir. Spektral değişiklik depolarizasyon üzerine netlik için abartılı olduğunu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Kırmızı ve yeşil floresans emisyon ayıran ve onları iki bitişik alanları projeleri bir resim splitter ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak potansiyel membran dalgalanmaları yansıtma FRET verimliliği değişimler görüntüsü bir sCMOS kamera (Şekil 2) çip. Bu kurulum ile iki farklı dalga boyu bantları, floresans emisyon aynı anda, her zaman hata bir dizi suretinde potansiyel membran yansıtacak şekilde kırmızı yeşil floresans oranında hesaplanması sağlayan kaydedilebilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Şekil 2: görüntüleme sisteminin yapılandırmasını. Görüntüleme sistemi, asıl bileşenleri yüksek zamansal çözünürlükte membran olası değişiklikleri yansıtması voltaj duyarlı floresan protein spektral değişiklikleri tasvir edilir görüntü için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
VSFP-CR CMS ifade lentiviral iletim tarafından sağlanır. CM alt türü ifade ilgi yönlendirmek için özellikle transkripsiyon ventrikül benzeri IPSC-CMs10sürücüler bir organizatörü öğesi ( MLC2v artırıcı) lentivirus içeriyor. Ne zaman bir karışımı atriyal benzeri, nodal benzeri ve ventrikül benzeri hücre temsil IPSC-CMs ile bu lentivirus transduced, VSFP-CR sadece ventrikül benzeri hücrelerde ifade edilir. Optik Aksiyon potansiyeli görüntüleme bu floresan sensörüne bağlı olduğundan, kaydedilen Aksiyon potansiyelleri sadece CM alt faiz (Şekil 3) türünü temsil eder.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Şekil 3: organizatörü tahrik VSFP ifade alt türü özel membran potansiyeli görüntüleme için. (bir) cardiomyocyte alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları nasıl elde bu şematik gösterir. (b) IPSC-CMs ventrikül özgü MLC2v artırıcı kontrol altında bir VSFP ile enfekte gösterilir. Gerilim Algılayıcısı ifade sadece ventrikül benzeri CMs GFP kanal (sol panelde) olarak görülmektedir. Faz kontrast (orta Masası) ve Bindirme görüntüsünü (doğru kapı aynası) de temin edilmektedir. Beyaz noktalı çizgiler hücre sınırları işaretleyin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>&szlig;-Merkaptoetanol</td><td>İnvitrojen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Orta</td><td>İnvitrojen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td><td>İnvitrojen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Invitrojen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I Takviyesi</td><td>Invitrojen</td><td>35050061</td><td>alternatif L-Glutamin</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin sığır plazması</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Heksadimetrin Bromür (Polibren)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>lentiviral enfeksiyonu arttırır</td></tr><tr><td>3,5 cm cam tabanlı mikro tabaklar</td><td>MatTek şirketi, Ashland, MA, ABD</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop standı</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop objektifi</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Yağ</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS kamera</td><td>Andor Technology, Belfast, İngiltere</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop filtre küpü: uyarma filtresi</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, ABD</td><td>ET480/40X</td><td>bant geçişi 480/40</td></tr><tr><td>Mikroskop filtre küpü: dikroik ayna</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, ABD</td><td>T505lpxr</td><td>uzun geçiren 505 nm</td></tr><tr><td>Görüntü ayırıcı</td><td>&nbsp; Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü ayırıcı filtre küpü: dikroik ayna</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Almanya</td><td>568LPXR</td><td>uzun geçiş 568 nm</td></tr><tr><td>Görüntü ayırıcı filtre küpü: emisyon filtresi 1 (GFP emisyonu)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Almanya</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>bant geçiren 520/28 nm</td></tr><tr><td>Görüntü ayırıcı filtre küpü: emisyon filtresi 2 (RFP emisyonu)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Almanya</td><td>630/75 ET Bant geçişi</td><td>bant geçişi 630/75 nm</td></tr><tr><td>Pacing dahili</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, ABD</td><td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler cardiomyocytes alt türü özel optik aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPSC-CMs) oluşturulan Cardiomyocytes kardiyovasküler araştırmalarında ortaya çıkan bir araçlardır. Hücreleri homojen bir nüfusa olmak yerine, geçerli farklılaşma iletişim kuralları tarafından oluşturulan IPSC CMs ventrikül hücrelerle karışımı temsil eder-, atriyal-ve fenotipik analizlerini zorlaştırmaktadır nodal benzeri fenotipleri. Burada, ventrikül benzeri IPSC-CMs özellikle optik kayıt Aksiyon potansiyelleri için bir yöntem sunulur. Bu bir genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi ventrikül özgü organizatörü öğe kontrolü altında olduğu bir yapı ile lentiviral iletim tarafından sağlanır. Ne zaman IPSC-CMs sahip bu yapı transduced, Gerilim Algılayıcısı hızlandırılmış floresans mikroskobu kullanarak alt türü özel optik membran potansiyeli kayıtları etkinleştirme sadece ventrikül benzeri hücrelerde, ifade edilir.

Şekil 4a, bir temsilcisi tek IPSC CM RFP (sol taraf) ve GFP (sağ tarafta) kanal görüntüleme analizi sırasında çizilmiş yatırım getirisi işaretleme beyaz noktalı çizgilerle resmedilmiş. RFP kanal sinyalini her aksiyon potansiyeli sırasında (Şekil 4b, üst panel) Floresan yoğunluğu düzenli bir artış gösterir. Giriş bölümünde açıklandığı gibi bu zarda potansiyel (Şekil 1) değişiklikleri nedeniyle artan b...

Burada özellikle ventriküler benzeri indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes içinde optik görüntü Aksiyon potansiyelleri, bir yöntem mevcut. Bu yöntem bir voltaj duyarlı floresan protein organizatörü tahrik ifade üzerinde dayanır.

Pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler Cardiomyocytes alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

İndüklenen Pluripotent Kök veya IPS hücrelerinden üretilen kardiyomiyositler, kardiyak elektrofizyoloji alanındaki çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu teknolojinin ana avantajları, ventriküler özel bir organizatör unsuru kullanarak, miyosit ler gibi ventriküler durumlarda üretimde dramatik bir artış alabilen ve alt tipe özgü eylem potansiyeli kayıtları sağlamasıdır. Lentiviral transdüksiyon yoluyla genetik olarak kodlanmış voltaj sensörlerinin devreye sokulmasına izin veren insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit etki potansiyellerinin optik görüntülemesi.Kardiyomiyosit bakım ortamı ile lentivirus içeren hücre kültürü supernatant karıştırarak başlayın, bir e-bir oranda. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için mililitre başına 8 mikrogram son konsantrasyonda heksadimetherine bromür ekleyin. Ve IPS hücre kaynaklı kardiyomiyosit kültür çanak kardiyomiyosit bakım ortamı değiştirin, enfeksiyon orta ile.Kültür 37 santigrat derece 12 saat boyunca enfekte kardiyomiyositler, ve taze kardiyomiyosit bakım ortamı ile enfeksiyon orta değiştirin. Görüntülemeden önce, tyrode çözeltisi ile hücre kültürü orta değişimi, kalsiyum ile takviye. Daha sonra kardiyomiyositleri bir görüntü ayırıcıile donatılmış ters epifloresan mikroskobun sahnesine bir görüntüleme odasına yerleştirin.Elektriksel pacing gerekiyorsa, görüntüleme odasına pacing elektrotlar yükleyin ve elektrotları bir uyarıcı jeneratöre bağlayın. Hücreleri odak noktası haline getirin ve izleme alanının merkezinde genetiği kodlanmış voltaj göstergesini ifade eden bir hücre bulun. Optik yolu, yayılan ışığın görüntü ayırıcısına yönlendirilecek şekilde ayarlayın ve mikroskoptaki filtre küpünü görüntü ayırıcıdaki filtrelerle birlişecek şekilde değiştirin.Kamerayı kontrol eden yazılımda, satın alma ayarını yüksek hızlı görüntülemenin mümkün olması için ayarlayın ve görüntü ayırıcısını üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. İki farklı emisyon dalga boyu bandını temsil eden iki görüntü, her biri görüntünün yarısını işgal eden birbirine bitişik olmalıdır. Kamera tarafından üretilen görüntünün odağının gerektiği gibi kontrol edin ve ayarlayın.Ve aydınlatma ışığının parlaklığını ayarlayarak piksel doygunluğunun önüne geçti. Zaman serisinin kazanılmasını ayarlayın ve ölçümü etkileyen başıboş ışığın önüne çıkmak için odadaki ışığı karartın. Daha sonra uyarma ışık deklanşöraçına açın ve deneysel olarak uygun olduğu gibi, uygun zaman noktasında elektrik volta başlatma, görüntü serisinin edinimi başlar.Satın alma tamamlandığında, uyarma ışığı deklanşöre gerektiği gibi kapatın ve kaydı sabit diske kaydedin. Ardından, kayıt ayarını değiştirmeden bırakarak, arka planı hücre siz kapak lı bir bölge üzerinden kaydedin. Optik membran potansiyel kayıtlarının analizi için, ImageJ'deki hücreleri içeren tiff destesini açın ve serbest el seçim aracını kullanarak floresan kardiyomiyositin üzerine bir ilgi alanı çizin, kırmızı kanalda, hücrenin sözleşme sırasında bölgeden taşınmayacak kadar büyük olmasına dikkat edin.Ardından, İlgi Alanı 1 olarak bölgeyi eklemek için Analiz et, Araçlar, İlgi Alanı Yöneticisi'ni ve T Ekle'yi seçin. İlgi çekici bölgeyi yeşil kanaldaki aynı hücre üzerinde sürükleyin ve bu bölgeyi İlgi Alanı 2 olarak ekleyin. Ölçümleri Analiz et ve Ayarla menülerinde, Ortalama gri değeri dışındaki tüm seçenekleri seçin.İlgi Alanı Yöneticisi'nde, Tüm dilimleri Ölçüle'yi ve dilim başına bir satırı seçmek için Daha Fazla ve Çoklu Ölçü'yi tıklatın ve Tamam'ı tıklatın. Üç satırlı bir elektronik tablo içeren bir pencere açılır. Elektronik tabloyu virgülle ayrılmış değer dosyasına kaydetmek için Dosya ve Kaydet'i kullanın. İlgi Alanı Yöneticisi penceresini kapatmadan resim yığını ve elektronik tablo penceresiyle pencereyi kapatın ve arka plan ölçümlerini içeren tiff yığınını açın.İlgi Alanı Yöneticisi'nde, Tüm dilimleri Ölç'ü ve dilim başına bir satırı seçmek için Daha Fazla ve Çoklu Ölçü'yi tıklatın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından arka plan verilerini ayrı bir csv dosyasına kaydedin. Burada, rfp ve GFP kanallarında görüntüleme analizi sırasında çizilen ilgi bölgelerini işaretleyen beyaz noktalı çizgilerle temsili tek bir IPS hücre türetilmiş kardiyomiyosit gösterilmiştir. RFP kanalından gelen sinyal, membran potansiyelindeki değişikliklerin neden olduğu artan zorunlu veya rezonans enerji transferi nedeniyle her bir eylem potansiyeli sırasında floresan yoğunluğunda periyodik bir artış olduğunu göstermektedir.Buna uygun olarak, GFP sinyali floresan yoğunluğunda periyodik bir azalma gösterir. RFP/GFP oranı, eylem potansiyeli süresi 50 ve 90 ölçümleri gibi akış aşağı analizlerinde kullanılan biyolojik sinyaldir. Örneğin, bu yöntemi kullanarak, 0.5 Hertz yerleştirilen IPS hücre kaynaklı kardiyomiyositler gibi 30 günlük ventriküler, ortalama bir eylem potansiyel süresi gösterdi 50 439 milisaniye, ve ortalama bir eylem potansiyel süresi 90 520 milisaniye.IPS hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin her beş atımda her beş atımda artan stimülasyon oranlarında elektriksel uyarım, dayak hızı arttıkça etki potansiyellerinin kademeli olarak kısaldığını göstermiştir. Ayrıca, izoproternol ile kendiliğinden yenen IPS hücre kaynaklı kardiyomiyosittedavisi, nonselektif beta adreno reseptör agonist, dayak hızında hızlı bir artışa yol açtı, bu agonist artan dozlarda daha da artabilir. Bu yöntem klasik elektrofizyolojik ölçümlere göre üstün iş akışı sağlarken, floresan gerilim sensörünün içsel kinetik özellikleriyle sınırlı olan zamansal çözünürlük de dahil olmak üzere sınırlamalarının farkında olmak gerekir.

subtype-specific-optical-action-potential-recordings-human-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.

Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Lazer porasyon ve mikroelektrot dizilerinin (MEA) kombinasyonu, ekili birincil ve kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyeli benzeri kayıtlarına izin verir. Dalga formu şekli, test bileşiklerinin hareket tarzı hakkında standart kayıtlardan daha üstün bir fikir verir. Gelecekte kardiyo güvenliği araştırmalarını daha da optimize etmek için yama kelepçesi ve MEA okumasını birbirine bağlar.

Güvenlik Farmakolojisinin Artan Predivititesi için Mikroelektrot Dizileri Üzerindeki Kardiyomiyositlerin Lazerle İndüklenen Aksiyon Potansiyeli Benzeri Ölçümleri

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin, iPS hücre kaynaklı ventriküler kardiyomiyositlerde optik aksiyon potansiyeli kaydı yöntemini. Lentiviral transdüksiyon ve genetik voltaj sensörleriyle kalp elektrofizyolojisi araştırmalarında yüksek verimlilik sağlayın.

Pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler Cardiomyocytes alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen

Daha fazla video keşfet