Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili
7 Eylül 2018
Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.
Bu yöntem, biyoloji alanında, hücresel zarlarda bulunan biyo-proteinlerin, biyo-replikasyon ve montajı destekleyen ortamlar yaratmak için nasıl olduğuna dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur. Burada birleştirilen iki teknik köşe taşı, birincisi, canlı hücre görüntüleme ve elektron mikroskobu arasındaki korelasyon ve ikincisi, yüksek basınçlı dondurmadır. Bu yöntem, virüs kaynağı etkileşimlerinin üstesinden gelmek için tasarlanmış ve başarılı bir şekilde kullanılmış olsa da, hücre biyolojisindeki bir dizi uygulamaya kolayca genelleştirilebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, özellikle yüksek basınçlı dondurma ile Kriyo-immobilizasyon ve sonraki adımlar olmak üzere, başarı ile pratik deneyim gerektiren birçok adım olduğu için kritik öneme sahiptir. Yüzeylerinden birine kazınmış alfanümerik desenli safir diskleri 15 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne yerleştirerek ve diskleri etanol ile iyice yıkayarak başlayın. Yıkanmış safir diskleri kurutmak için filtre kağıdı ile kaplı bir Petri kabına yerleştirin ve kurumuş safir diskleri cam slaytlara aktarmak için uzun, ince cımbız kullanın. 4x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, her safir diskteki koordinat deseninin okunabilir olduğunu onaylayın. Ardından, diskleri ultraviyole çapraz bağlayıcı ile beş dakika sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabininde, hücre kültürü ortamının yarısını bir hücre kültürü kabına ekleyin ve safir diskleri dikkatlice tabağa aktarmak için uzun cımbız kullanın. Ardından, 1x10 tohum
Genel Bakış
Bu makale, virüslerin tetiklediği hücre içi yapıları görselleştirmek için korelatif ışık elektron mikroskobisi (CLEM) yöntemini sunmaktadır. Işık mikroskobisi (LM) ve elektron mikroskobisini (EM) entegre ederek, araştırmacılar virüs-konak etkileşimleri hakkında derinlemesine bilgi edinebilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Teknikleri
- Virüs-Konak Etkileşimleri
Arka Plan
- Bu yöntem, canlı hücre görüntülemeyi elektron mikroskobisi ile birleştirir.
- Yüksek basınçlı dondurma, tekniğin kritik bir bileşenidir.
- Yöntem, virüs etkileşimlerinin incelenmesinde başarıyla uygulanmıştır.
- Bu yöntem, hücre biyolojisindeki çeşitli uygulamalara genellenebilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücrelerde virüs kaynaklı yapıları görselleştirmek.
- Hücresel membranlardaki biyo-protein etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirmek.
- Bu yöntemi kullanan araştırmacılar için pratik bir kılavuz sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için desenli safir disklerin hazırlanması.
- Desen onayı için ters mikroskobinin kullanımı.
- Ultraviyole çapraz bağlama ile disklerin sterilizasyonu.
- Hücrelerin safir disklere ekimi için hücre kültürü teknikleri.
Temel Sonuçlar
- Virüs kaynaklı hücre içi yapıların başarılı bir şekilde görüntülenmesi.
- Virüs-konak etkileşimlerinin incelenmesinde CLEM'in etkinliğinin gösterilmesi.
- Yöntemin uygulanması için ana hatları belirlenmiş pratik adımlar.
- Daha geniş hücre biyolojisi bağlamlarındaki potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- CLEM yöntemi, virüs biyolojisine dair değerli bilgiler sunar.
- Bu yöntem, ışık ve elektron mikroskobisi arasındaki boşluğu doldurur.
- Hücre biyolojisindeki daha ileri uygulamalar teşvik edilmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobisi (CLEM), nadir transfekte edilmiş veya enfekte olmuş hücre popülasyonlarının hedeflenmiş analizine olanak tanıyarak viroloji araştırmalarındaki kritik bir darboğazı gidermektedir. Floresan tabanlı canlı hücre görüntülemesini, yüksek basınçlı dondurma yoluyla elde edilen yüksek çözünürlüklü ultrastrüktürel koruma ile birleştiren bu yöntem, virüs-konak etkileşimlerinin mekanistik çalışmalarındaki öngörü güvenilirliğini artırır. Fonksiyonel fenotipler ile hücre altı mimarisi arasında köprü kuran korelatif veriler sağlayarak erken evre hedef doğrulama ve assay geliştirmeyi destekler ve antiviral keşif süreçlerindeki devam/durdurma kararlarına temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Floresan işaretli viral protein ekspresyonunu, kriyojenik olarak immobilize edilmiş hücrelerdeki ultrastrüktürel değişikliklerle ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Işık mikroskopisi yoluyla ön tarama yaparak, düşük verimli transfeksiyon veya enfeksiyon olaylarının incelenmesindeki verimliliği artırır.
- Öngörücü Değer: Replikasyon kompleksleri ile ilgili virüs kaynaklı membran değişikliklerini ve montaj bölgelerini görselleştirerek mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Viral protein lokalizasyonunun ve yapısal bozulmaların kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyan korele floresan ve elektron yoğunluğu okumaları üretir.
- Operasyonel Değer: Desenli safir diskler kullanarak örnek hazırlama sürecini standartlaştırır; böylece deneyler ve kullanıcılar arasında tekrarlanabilir korelasyonu kolaylaştırır.
- Analiz Hazırlığı: Tarama kampanyalarında aşağı akış görüntüleme ve morfometrik analizler için uygun, ultrastrüktürel olarak korunmuş örnekler üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Canlı hücre görüntülemeden elektron mikroskobisine kadar yapısal sadakati koruyarak, hastalıkla ilgili sistemlerde biyobelirteç odaklı fenotipik taramayı destekler.
- Preklinik Modelleme: Virüs kaynaklı sitopatik etkilerin doğal duruma yakın hallerinde ayrıntılı karakterizasyonuna olanak tanıyarak translasyonel ekstrapolasyona olan güveni artırır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Antiviral adayların etki mekanizmalarını destekleyecek veya çürütecek ultrastrüktürel kanıtlar sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
CLEM, erken dönem virolojisindeki hipotez oluşturmadan, özellikle protein fonksiyonunun yapısal korelatlarına ihtiyaç duyulduğunda, ön aday optimizasyonundaki mekanistik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Tanımlanmış hücresel alt popülasyonlarda viral proteinle ilişkili yapıların doğrudan görselleştirilmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış hücre lokalizasyonu ve kriyoprezervasyon yoluyla analiz güvenilirliğini artırır ve yapısal okumalardaki değişkenliği azaltır.
- Analitik: Floresan yoğunluğu ve ultrastrüktürel özelliklere dayalı olarak koşulların kantitatif karşılaştırılmasına olanak tanıyan, korele ışık ve elektron mikroskobu veri setleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Fonksiyonel görüntüleme ile yüksek çözünürlüklü yapısal veriler arasında köprü kurarak, hücre tabanlı analizlerden mekanistik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef ve viral aile genelinde uygulanabilen, virüs-konak etkileşimlerini incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Viral protein lokalizasyonuna ve indüklenen yapısal değişikliklere dair doğrudan korelatif kanıtlar sağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Desenli substratların ve yüksek basınçlı dondurmanın standart kullanımı yoluyla tekrarlanabilirliği artırır ve kimyasal fiksasyondan kaynaklanan artefaktları minimize eder.
- Stratejik Değer: Hedef etkileşimini ultrastrüktürel düzeyde doğrulayarak daha iyi devam/dur kararları verilmesini sağlar ve geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Viral replikasyon kompartmanları veya montaj bölgeleri üzerindeki onaylanmış etkilere dayanarak, antiviral adayların riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre floresan görüntüleme, yüksek basınçlı dondurma, dondurarak yer değiştirme ve transmisyon elektron mikroskobu konularında uzmanlık gerektirir.
- Yüksek basınçlı donduruculara, ultramikrotomlara ve korelatif ışık ve elektron mikroskobu görüntüleme sistemlerine erişime bağlıdır.
- Ekipler arasında fidüsiyal işaretçilerin (örneğin, desenli safir diskler) ve koordinat eşleme protokollerinin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı hücre tiplerine veya viral sistemlere adaptasyon; transfeksiyon verimliliğinin, floresan etiketlemenin ve dondurma parametrelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Kaynak materyalde belirtildiği üzere, pratik sınırlamalar arasında özel ekipmanlar nedeniyle düşük işlem hacmi ve korelatif yazılım hizalaması ihtiyacı yer almaktadır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
