Name: C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Keşfedin c-Fos ve Dusp1'in lösemide ilaç hedefleri olarak genetik ve kimyasal yöntemlerle doğrulanması. Bu teknik, onkogen bağımlılığını inceleyerek çeşitli tümör türlerine uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar BaF3 ve WEHI hücreleri sağlamak için G. s. Daley için müteşekkiriz ve T. Reya MSCV-BCR-ABL-IRES-YFP için oluşturur. Yazarlar için-mek şartıyla CML patlama krizden hasta numuneleri M. Carroll için müteşekkiriz. Bu çalışmada ncı (1RO1CA155091), lösemi Araştırma Vakfı ve V Vakfı ve NHLBI (R21HL114074-01) dan M.A. için hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kanser hücreleri toplu için TKI tedavi yanıtı Tirozin kinaz oncoprotein sinyalleri tümör bağımlısı olduğu bir abluka tarafından aracılık ettiği. Ancak, nispeten az hakkında nasıl bir azınlık MRD için katkıda bulunan kanser hücrelerinin kaçış onkogen bağımlılığı ve tedavisi4bilinir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal ilaç direnci lösemi ve solid organ tümörler aracılık eder saptandı. Bu çeşitli moleküler mekanizmaları iç direnci10,<sup class="...

Kurucu Tirozin kinaz aktivitesinin BCR-ABL1 füzyon onkogen kinaz aktivitesi küçük molekül inhibitörleri tarafından hedeflemek için bir gerekçe sağlar CML neden olur. CML hastaların tedavisinde TKIs başarısı hedefe yönelik tedavi1,2kavramı devrim. Daha sonra anti-kinaz terapisi hassas ilaç olarak solid tümör dahil olmak üzere birçok diğer maligniteler için geliştirilmiştir. Şimdiye kadar otuzdan fazla kinaz inhibitörleri çeşitli maligniteler tedavisi için United State FDA tarafından onaylanmıştır. TKI tedavi hastalık bastırmak çok etkili olmakla birlikte, iyileştirici değil. Ayrıca, tedavi sırasında kanser hücrelerinin küçük bir nüfus devam ederse: MRD3,4,5. Tam iyileşme gösterdi bile hasta sonunda sonuçları nüks içinde değilse sürekli bastırılmış MRD ile bırakılır. Bu nedenle, MRD hücreleri eradikasyonu dayanıklı veya tedavi edici bir yanıt elde etmek için gereklidir. CML tanımlama hassas tıp kavramı, oncogenesis, rasyonel hedef yönelik tedavi, hastalık ilerleme ve ilaç direnci mekanizmaları için değerli bir paradigma temsil eder. Ancak, bugün bile, TKI indüklenen hücre ölümü kanser hücrelerinde sürüş mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ne de neden MRD hücreleri (lösemik kök hücrelerinin [LSCs] oluşan) TKIs4,-6özünde dayanıklı. Yine de, mutant kinaz oncoprotein için "onkogen bağımlılık" olgusu içinde nereye TKIs tarafından hedeflenen onkogen akut inhibisyonu bir büyük proapoptotic yanıt ya da sendika hücredeki yol açan bir oncogenic şok neden TKI etkinliği karıştığı içerik bağımlı bir şekilde6,7,8,9. Ancak, mekanik destek onkogen bağımlılığı eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal onkogen bağımlılığı abrogates ve sonuç olarak direnç TKI terapi10,11,12confers karıştığı. Bu nedenle, onkogen bağımlılığı mekanizmasının bir anlayış kazanmak için biz bütün-genom ifade BCR-ABL1 bağımlısı ve nonaddicted hücreleri (büyüme faktörleri ile büyüdü), c-Fos ve Dusp1, kritik arabulucu olduğunu ortaya profil oluşturma gerçekleştirilen onkogen bağımlılığı13. C-Fos ve Dusp1 genetik silinmesi sentetik BCR-ABL1 ifade etmek için öldürücü hücreler ve deneyde kullanılan farelerde lösemi geliştirmek değil. Ayrıca, c-Fos ve DUSP1 inhibisyonu küçük molekül inhibitörleri tarafından BCR ABL1 indüklenen CML farelerde tedavi. Öyle ki daha yüksek düzeyleri terapi13direnç neden iken alt düzey ilaç duyarlılığı görüşmek ifade düzey c-Fos ve Dusp1 kanser hücrelerinde apoptotik eşik tanımlamak sonuçlar gösterir.
Onkogen bağımlılığı sürüş genlerin tanımlamak için hem fare - ve CML hasta kaynaklı hücreler (K562) kullanarak deneyler büyüme faktörü ve TKI (imatinib) profil oluşturma birkaç bütün-genom ifade seslendirdi. Bu veri paralel CML hasta veri kümeleriyle CD34 elde edilen analiz edildi+ hematopoietik kök hücre imatinib ile işlemden önce ve sonra. Bu analiz üç gen saptandı (transkripsiyon faktörü [c-Fos], Çift özgüllük fosfataz 1 [Dusp1] ve bir RNA-bağlayıcı protein [Zfp36]) hangi are sık TKI dayanıklı hücrelerdeki upregulated. İlaç direnci veriyor bu genlerin önemi doğrulamak için adım adım vitro ve in vivo analizi yapılır. Bu genlerin ifade düzeyde gerçek zamanlı qPCR (RT-qPCR) ve ilaca dirençli hücrelerde western Blot tarafından teyit edildi. Daha fazla, cDNA overexpression ve c-Fos, Dusp1, shRNA tokalar tarafından nakavt ve Zfp36 yükseltilmiş c-Fos ve Dusp1 ifadeleri yeterli ve TKI direnç danışmam gerekli olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, fare modelleri c-Fos ve Dusp1 ile sadece kullanma içinde vivo bir doğrulama işlemi. C-Fos ve Dusp1 genetik doğrulama için biz ROSACreERT indüklenebilir c-Fosfl/fl fareler (koşullu nakavt)14 oluşturulan ve onları ROSACreERT2-c-Fosfl/fl yapmak Dusp1- / - (düz nakavt)15 ile çapraz Dusp1- / - çift transgenik fareler. Kemik iliği türevi c-Seti+ hücreleri (c-Fos üzerindenfl/fl-, Dusp1- / -- ve c-Fosfl/flDusp1- / -) BCR-ABL1 ifade edildi analiz vitro bir koloni oluşturan birim (CFU) tahlil ve içinde Vivo c-Fos ve Dusp1 şartı tek başına veya birlikte lösemi gelişme test etmek için öğrenirim radyasyonlu farelerde kemik iliği nakli tarafından. Aynı şekilde, kimyasal engellemeler BCI tarafından Dusp1 ve c-Fos DFC (difluorinated curcumin)16 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 test edildi tüp bebek ve içinde vivo BCR-ABL1-ifade, kemik kullanarak vahşi-tipi (WT) fare hücrelerden kemik iliği türevi c-Seti+ . C-Fos ve Dusp1 gereksinim lösemik kök hücre olarak onaylamak için biz nerede BCR-ABL1 özellikle kök hücrelerine doksisiklin (Tet-transactivator ifade fare kök hücre lösemi (SCL) Gen 3' artırıcı altında tarafından akımıdır CML fare modeli kullanılan Yönetmelik)18,19. Kemik iliği Lin-kullanılan Sca+c-Seti+ (LSK) hücreleri bu fareler içinde vivo nakli tahlil üzerinden. Ayrıca, phopsho-p38 düzeyleri ve Il-6 Dusp1 ve c-Fos inhibisyon, ifade pharmaco dinamik biyolojik olarak sırasıyla kurduk vivo içinde. Son olarak, çalışma insan alaka, hasta kaynaklı CD34 için genişletmek için+ (c-Seti+ hücreleri eşdeğer üzerinden fareler) vardı tabi uzun vadeli için tüp bebek kültür başlatılıyor hücre deneyleri (LTCIC) hücreleri ve bir içinde vivo insanlaşmış fare modeli CML20,21. İmmünyetmezligi fareler CML CD34 + hücre, ardından ilaç tedavisi ve insan lösemik hücre sağkalım analizi ile nakledilen.
Bu projede, biz farklı preklinik modelleri kullanarak hedef tanımlama ve genetik ve kimyasal araçlarını kullanarak doğrulamaları için yöntemler geliştirmek. Bu yöntemler, terapötik geliştirme için kimyasal yöntemleri geliştirme diğer hedefler doğrulamak için başarıyla uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Biyolojik Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td> <td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td> <td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (corning)</td> <td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin Rekombinant İnsan Fibronektin Fragmanı</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 (Fare CFU için Metilselüloz)</td><td>Kök Hücre</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 Classic (İnsan CFU'su için Metilselüloz)</td><td>Kök Hücre</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-Hidroksitamoksifen</td><td>Sigma</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin Flt3-Ligand</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murine IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratuvarları Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Bilimsel</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>Imatinib</td><td>LC Laboratuvarı</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn / Strep</td><td>Cellgro (corning)</td> <td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biyolojik</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA 1x</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td>5 mg/mL su stoğu</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (yaşam teknolojileri)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/mL su stoğu</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi (%0,4)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; M acro disk filtre</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m naylon hücre yıldızı</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (polisakaroz)</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütunları</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Roche</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyli 2</td><td>Sigma</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocullulose Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli Substrat (kemilüminesans substratı)</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td><td>BD biosciences</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>558612</tr><tr><td>CD117 APC&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Eczane Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm (Sabitleme ve geçirgenlik solüsyonu)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BD Perma/Yıkama&nbsp; (fosfo akışı için geçirgenleştirme ve yıkama çözeltisi)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>fosfo p38</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>toplam p38</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG kontrolü</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>Alexa Unu 488 konjuge&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kan Kılcal Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Kan Alma Tüpü</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Yenidoğan Buzağı Serumu</td><td>Atlanta biyolojik</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>Eritropoiein</td><td>Amgen</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>insan SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (LTCIC testi için ortam)</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon Sodyum Hemissüksinat</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM alfa</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insülin şırıngası 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor havaneli</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 ve 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL su stoğu</td></tr><tr><td>Bacto agar (agar)</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Müthiş et suyu</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin yemi</td><td>TestDiet.com</td><td>52662</td><td>modifiye RMH1500, Otoklavlanabilir 5LK8&nbsp;% 0.0625 Doksisiklin & nbsp ile;</td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>İyodonitrotetrazolyum klorür ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kan ve doku kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (Yeşil yüklü boyalı taq polimeraz)</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp; (RNA izolasyon kiti)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ücretsiz Dnase Kiti (RT PCR için DNAse tedavisi)</td><td>Ambion, Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Birinci İplikli Sentez (cDNA sentezi için ters transkriptaz)</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (qPCR için yeşil interchale boya ile taq polimeraz karışımı)</td><td>Bio-Rad</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>CD117 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Uzun Süreli Kültür Başlatma Hücre Testi</td><td>Stemp Hücre Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><güçlü > Aletler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NAPCO serisi 8000 WJ CO 2 inkübatör</td><td>Termo bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salıncak kova rotor cetrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Termal döngüleyici</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Görüntüleme Sistemi (jeller ve western lekeler için görüntüleme sistemi)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (boold sayacı)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (FACS analizörü)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa I (FACS analizörü)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII (FACS Sıralayıcı)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mıknatıs Standı</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işınlayıcı</td><td>&nbsp;JL Çoban ve Ortakları, San Fernando CA</td><td>Mark I Model 68A</td><td>kaynak Cs 137</td></tr><tr><td><güçlü>Fareler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>Dr. Claudia Huettner' s lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&nbsp;</td><td>Evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr> üretilmiştir<tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>George Daley, Harvard Tıp Okulu, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI'den</td><td>Hediye George Daley, Harvard Tıp Okulu, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ ve Normal CD34+ hücrelerinden</td> <td>hediyeÜniversite Hastanesi, Cincinnati</td><td></td><td></td> Üniversitesi</tr></tbody></table>

c-fos rolü ve dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Tirozin kinaz inhibitörleri (TKIs) kronik miyeloid lösemi (CML) tedavisinde gösteri kanser tedavi yeni bir dönemin habercisi. Ancak, küçük bir nüfus hücre TKI tedavi için minimal rezidüel hastalık (MRD); kaynaklanan yanıt vermiyor Bu hücreler ortadan kaldırmak için bile en güçlü TKIs başarısız. Bu MRD hücreler tedaviye direnç geliştirmek için bir depo olarak hizmet vermektedir. Neden TKI tedavi MRD hücreleri karşı etkisiz bilinmemektedir. Büyüme faktörü sinyal MRD hücreleri hayatta kalma TKI tedavisi sırasında destek karıştığı, ama mekanik bir anlayış eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir yükseltilmiş c-Fos ve yakınsak bir sonucu olarak Dusp1 ifade oncogenic ve büyüme faktörü MRD hücreleri sinyal TKI direnç aracılık gösterdi. C-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal inhibisyonu CML TKIs zarif duyarlı işler ve her iki genetik ve insanlaşmış fare modellerinde CML tedavileri. TKI-duyarlı ve - dayanıklı hücreleri birden çok microarrays kullanarak bu hedef genlerin tespit edilmiştir. Burada, biz tüp bebek ve içinde vivo fare modelleri kullanarak hedef doğrulama için yöntemler sağlar. Bu yöntemlerin herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme kolayca uygulanabilir.

Onkogen bağımlılığı TKIs tedavi edici etkinliği karıştığı olmuştur. Ancak, onkogen bağımlılığı sürüş mekanizmaları anlaşılmadı. Biz genetik bileşen bağımlılığı düzenlediğini dahil tanımlamak için birden çok tarafsız gen ifade analizler yapılır. Bu analizler üç genler, c-Fos, Dusp1 ve Zfp36, oncogenic hayatta kalmak için sinyal üzerinde bağımlı değildir ve böylece, TKI tedavi için büyük küçük harf duyarlı olan kanser hücrelerini upregulation ortaya koydu. C-Fos ve Dusp1 downregülasyon tara...

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Bu yöntem, onkogen bağımlılığı ile ilgili temel genlerin belirlenmesi gibi kanser terapötik alanlarında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, birçok kizaz kaynaklı kanserlerde yaygın olan onkogen bağımlılığını kullanmasıdır, bu nedenle birden fazla tümör tipi için geçerlidir. Bu yöntem lösemi içine içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir, akciğer kanseri gibi katı tümörler, beyin tümörleri, ve pankreas tümörleri.Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler moleküler biyoloji ve hücresel fizyoloji deneyim eksikliği nedeniyle mücadele edecek. Başlamak için, bir ötenazi farebacak kemikleri hasat. Kemiklerdeki dokuları neşterle temizleyin.Sonra buz üzerinde soğuk PBS kemikleri yerleştirin ve bir havaneli ile kemikleri ezmek. Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik hücresüzlüksüzlük ten 10 mililitrelik pipetle 50 mililitrelik bir vidalı tüpe süzün. Harcı ve havaneleyi soğuk PBS ile birden fazla kez yıkayın ve hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik tüpekleyin.Sonraki santrifüj kemik iliği ve vakum ve cam pipet ile supernatant çıkarın. Hücre peletini 5 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Bir pipet kullanarak, yavaş y

methods-for-evaluating-role-c-fos-dusp1-oncogene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, kronik miyeloid lösemi hücre hatlarında retrovirüsler kullanarak hedef genleri transfer ederek genetik doğrulama protokolünü açıklar. Retrovirüsler, hedef genin uzun süreli ekspresyonunu sağlayan transdüksiyon adı verilen süreçle genetik materyali lösemi hücresine aktarmak için bir aracı görevi görür. Bu yöntem, genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için herhangi bir hedef hücreye uygulanabilir.

Retroviral Aracılı Transdüksiyon: Hedef Geni Kanser Hücrelerine Sokmak İçin Bir Yöntem

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Bu çalışma, bir pankreas duktal hücre hattının RNA-seq analizi yoluyla değiştirilmiş pH'ın onkogen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için bir protokolü açıklamaktadır.

Pankreatik Duktal Hücre Hattında pH Değişiklikleri ile Onkogen Ekspresyon Analizi

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Amacımız mitokondrial disfonksiyon kanser hastalarında yorgunluk ile ilişkili değerlendirmek için pratik bir protokol geliştirmekti. Bu yenilikçi protokol döneminde klinik kullanımı içeren yalnızca standart flebotomi ve Temel Laboratuvar işlemleri için optimize edilmiştir.

Kanserle ilgili yorgunluk mitokondriyal işlev rolünün değerlendirilmesi

Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Keşfedin c-Fos ve Dusp1'in lösemide ilaç hedefleri olarak genetik ve kimyasal yöntemlerle doğrulanması. Bu teknik, onkogen bağımlılığını inceleyerek çeşitli tümör türlerine uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Daha fazla video keşfet