Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Bu yöntem, mozaikliğin tespiti ve sıvı biyopsi tabanlı genetik test gibi genetik test alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, düşük değişkenli alel fraksiyonunun yüksek verimli tespitidir. Bu tekniğin etkileri, tümörlerin teşhisine kadar uzanır, çünkü onkojenik mutasyonları yüksek hassasiyetle tespit etmek hassas tıbba katkıda bulunabilir.

Bu deneye, 8 tüplü bir şeridin tüplerine 10 L DNA örnek tamponu ekleyerek başlayın. Daha sonra 8 tüplü şeridin ilk tüpüne 1 mikrolitre DNA merdiveni ve kalan tüplerin her birine bir mikrolitre örnek genomik DNA ekleyin. 8 tüplü şeridin içeriğini bir dakika boyunca girdaplayarak karıştırmak için mikroplaka ekini kullanın.

Şeridi, pipet uçlarını ve bir jel cihazını bir elektroforez aletine yerleştirin. Çalıştırmayı başlatmak için başlat düğmesine basın. Tam çalışmadan sonra, DNA örnek tamponunda bulunan alt işaretleyicinin elektroferogramda doğru şekilde atandığını doğrulamak için ekrandaki elektroferogramı kontrol edin.

Değilse, işaretleyiciyi yazılımın elektroferogram modunda manuel olarak atayın. Ardından, yazılımın bölge modunda, DNA konsantrasyonunu otomatik olarak hesaplamak için genomik DNA'nın boyut bölgesini belirtin. Karıştırmak için toplam 15 L.Pipette yukarı ve aşağı hacim elde etmek için önceden tasarlanmış primerleri, probları ve genomik DNA'yı 8 tüplü yeni bir şeride ekleyin.

Yükleme platformunu yeni 8 tüplü şeritte yerleşik olarak bulunan talaşların üzerine ekleyin ve ardından tüp şeridini otomatik yükleyiciye yerleştirin. Talaşlar ve yükleme platformu arasında bir temas olduğundan emin olun. Ardından, platforma bir yükleme kaydırıcısı yerleştirin ve kaydırıcıyı yükleyiciden uzak tutmak için bir durdurucu kullanın.

Kaydırıcının ucuna yakın bir yere 15 L PCR karışımı pipetleyin ve ardından yükleyiciyi bir dakika çalıştırmak için yükleyici düğmesine basın. Çalıştırmadan sonra boru şeridini yükleyiciden çıkarın ve sızdırmazlık arttırıcıya yerleştirin. Sürgülü kapağı ve üst kapağın kenarını dikkatlice itin.

Sızdırmazlık arttırıcıyı yaklaşık iki dakika çalıştırın. Sızdırmazlık eksikse, bir sıvı birikintisi ile gösterilirse, çalışmayı bir dakika daha tekrarlayın. Tüplere 230 L sızdırmazlık sıvısı ekleyin.

Tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin ve PCR'yi protokolde açıklandığı gibi çalıştırın. Pozitif bölümlerin eşit olmayan bir dağılımı varsa, PCR'nin sıcaklığını veya süresini ayarlayın. PCR ürünlerinin floresan yoğunluğunu tespit etmek ve analiz etmek için tüp şeridini algılama aparatına yerleştirin ve 6 mL damıtılmış su ekleyin.

Bir pipet ucu kullanarak görünür hava kabarcıklarını çıkarın. Jig'i dedektöre yükleyin. Algılama yazılımında Floresan, Deney ve ardından NTC Örneği sekmelerini seçin ve çalıştırmayı başlatmak için ÇALIŞTIR düğmesine tıklayın.

Tam çalıştırmadan sonra, konum grafiğini, histogramı ve 2-B dağılım grafiğini onaylayın. PCR ürününü toplamak için sızdırmazlık sıvısını tüpten çıkarın. 100 L TE tamponu ekleyin ve 30 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın.

Tüpleri bir masa üstü santrifüjde kısaca santrifüjleyin ve PCR ürününü toplamayı bitirmek için metin protokolünde açıklandığı gibi ilerleyin. Dijital PCR ile oluşturulan pozisyon grafikleri, hem hastalarda hem de baba örneklerinde sarı HEX floresan gösterir, bu da APC alel varyant T'nin varlığını gösterir, ancak şablon kontrolünde değildir. Sadece hastaların genomik DNA'sı, FAM'ın yeşil floresansı ile gösterildiği gibi C-varyantı içerir.

Dağılım grafikleri ile daha fazla doğrulandığı gibi, hem hasta hem de baba HEX veya varyant T için pozitiftir, oysa sadece hasta varyant C'nin varlığını gösterir. Öte yandan, hastaların ebeveynlerinin ve sağlıklı donörlerin VAF'leri %0.1'den azdı Toplanan ve konsantre DPCR ürünlerinin elektroferezi, tahmin edilen fragmanın boyutunun hastaların ve ebeveynlerin DNA'sında 123 baz çifti olduğunu doğrulamaktadır. Bu prosedürü denerken, örneğin bir fan filtre ünitesi kullanarak tezgahı temiz tutmayı unutmamak önemlidir.