Ekstrapulmoner Tüberküloz Tespiti için Süperparamanyetik Demir Oksit Nanoprobukların Sentezi, Karakterizasyonu ve Uygulanması

Spesifik olmayan klinik sunum ve tanı testlerinde düşük performans nedeniyle onay için cerrahi bir müdahale gerektirdiğiiçin, küresel olarak ekstrapulmoner tüberküloz tanısı genellikle gecikebilir. Mycobacterium tuberculosis antijenleri için serolojik tanı testlerini geliştirmek için ekstrapulmoner tüberkülozu saptamak için süper paramanyetik demir oksit nanoprobları geliştirdik. TB-SPIO nanoproblar herhangi bir otoimmün yanıt indüklemeden paramanyetik özellikleri nedeniyle düşük konsantrasyonlarda hassas manyetik rezonans görüntüleri sağlayabilir.

Tüberküloz-SPIO nanoprobları Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun hedeflenmesini ve saptanmasını sağlar. Ayrıca diğer hastalıkların tespiti için MRG kontrast maddesi olarak da uygulanabilir. Deneyin her parçası belirli bir çekirdek teknolojisini kullandığından, protokolü denemeden önce protokolü dikkatle incelediğinden emin olun.

Yöntemin görsel gösterisi, öğrencilerin süreci nasıl uygulayacaklarını anlamalarına yardımcı olabilir, özellikle de daha karmaşık deneylerin bazıları için. Dekstran kaplı demir oksit manyetik nano tanecikleri hazırlamak için, kuvvetle dextran T40 beş mililitre ile 45 miligram sulu demir klorür heksahidrat ve oda sıcaklığında demir klorür tetrahidrat çözeltileri 32 miligram birleştirir. Hızla amonyum hidroksit 10 mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca ortaya çıkan siyah süspansiyon karıştırmak için bir karıştırma çubuğu kullanın.

Karıştırma kuluçka sonunda, çözelti santrifüj ve agregalar kaldırın. Son SPIO ürünlerini bağlanmamış dekstran T40'tan ayırmak için, beş mililitrelik reaksiyon karışımının tamamını 2,5 ila 33 santimetrelik jel filtrasyon kromatografi sütununa yükleyin ve 0,1-molar sodyum asetat ve 0,15 molar sodyum klorür tampon çözeltisi ile dekstran'ı aşındırın. Daha sonra, boşluk hacminde saflaştırılmış dekstran kaplı demir oksit manyetik nano tanecikleri toplamak ve test sütun standart protokollere göre 330 ve 490 nanometre demir ve dextran için eluates.

SPIO konjuge Mycobacterium tuberculosis yüzey antikorları oluşturmak için, ilk spio-EDBE-succinic anhidrit sentezlemek SPIO-EDBE-succinic anhidrit bir gram SPIO-EBDE alkali çözeltisi ile oda sıcaklığında 24 saat boyunca bir gram succinic anhidrit karıştırarak. Ertesi gün, değişim başına iki litre distile su 26 saatlik değişiklikler ile çözelti diyaliz için 12, 000-4, 000 moleküler ağırlık kesme moleküler gözenekli membran boru kullanın. Son değişiklikten sonra, mililitre Başına 4.5 miligram 400 mikrolitre elde edilen çözeltinin 100 mikrolitre ekleyin TB yüzey antikor, 1-hidroksibenzotriazol ve benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinofosfonofhate eklenmesi ile oda sıcaklığında katalizör olarak 24 saat karıştırma ile.

Tampon olarak PBS kullanarak jel filtrasyon kromatografisi ile bağlanmamış antikordan çözeltileri ayırın. Ortalama parçacık boyutunu, morfolojisini ve boyut dağılımını belirlemek için kompozit dağılım200 örgülü bakır ızgaraya damla damlatın ve 100 kilovoltgörüntüleme için iletim elektron mikroskobuna yüklemeden önce numuneyi oda sıcaklığında hava kurutun. Nanoprobların gevşeme süresi değerlerini ölçmek için, 20 megahertz ve 37 santigrat derece artı veya eksi bir derece bir nükleer manyetik rezonans relaxometre kullanın.

Nanoprob darbeli hücre görüntüleme için, ilk standart hücre kültürü protokollerine göre insan THP-1 monositler yetiştirmek. Hücreler uygun aktivasyon aşamasına ulaştığında, bir saat boyunca Mycobacterium bovis BCG'nin altıncı koloni oluşturan birimlerine bir kere 10 ile yedi monosite bir kere preinkübat. Kuluçka sonunda, bir mililitrelik mikrosantrifüj tüpler hücreleri aktarın ve SPIO Mycobacterium tüberküloz yüzey antikor-konjuge nanoprozlar iki milimolar ekleyin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir saatlik kuluçka için her tüp için.

Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve taze orta 200 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra, nanoprobların özgüllüğünü ve hassasiyetini belirlemek için 3.0-T manyetik rezonans görüntüleme yoluyla hızlı bir degrade yankı darbesi dizisi kullanarak örnekleri tarayabilirsiniz. Deneysel hayvanları M.bovis BCG ile aşılamak için, önce Sauton'un ortamındaki liyofilize aşıyı veya bakteri stoğunu yeniden oluşturmak ve yeniden oluşturulmuş stok çözeltisini tuzlu su çözeltisi ile seyreltmek.

Daha sonra, çözeltinin 100 mikrolitresini hayvan başına bir mililitreşile şırıngaya yükleyin ve bakterilerin tüm hacmini her farenin sol veya sağ sırt skapular derisine enjekte edin. Canlı nanoprob enjekte hayvanların in vivo manyetik rezonans görüntüleme için, her bir farenin kuyruk damar içine tuzlu 200 mikrolitre içine asılı SPIO-TB antikor probları iki nanomolar enjekte etmeden önce her anestezi deneysel hayvan temel T2 ağırlıklı hızlı spin-yankı görüntüleri elde. Daha sonra, enjeksiyondan hemen sonra ve sonraki 30 dakika boyunca her beş dakikada bir hayvanları tekrar görüntüleyin.

Görüntüleme seansının sonunda, bir M.tuberculosis granülom merkezinin ve granülomatis bölgesine bitişik arka kanın karşılaştırılabilir yerlerinde tanımlanan ilgi bölgelerinin ölçümü olarak sinyal yoğunluğunu kullanarak manyetik rezonans görüntülerinin tümünün sayısal olarak analiz edilmesi. Ardından, kontrast maddelerin enjeksiyonundan önce ve sıfır-üç saat sonra sinyal yoğunluğu ölçümünü kullanarak göreli sinyal geliştirmelerini hesaplamak için formülü kullanın. Aşılamadan bir ay sonra, her hayvanın intradermal aşılama sitesinden doku toplamak ve hematoksilin ve eosin ile formalin-sabit parafin gömülü beş ila 10 mikrometre kalınlığında doku örnekleri leke, asit hızlı bakteriler için Ziehl-Neelsen lekeleri, ve ferrik demir için Berlin mavi.

SPIO-TB yüzey antikor nanoproblarının iletim elektron mikroskobu görüntülemesi, nanoprobların çekirdek başına ortalama 3,8 artı veya eksi 0,4 nanometre boyutuyla iyi dağılmış bir görünüm sergilediklerini ortaya koymaktadır. M.bovis BCG ve asit hızında bakteriyel zorlanma Ziehl-Neelsen boyama yoluyla saptanabilir. Ferrik demir içeren sondalar ile izolasyon ve kültür den sonra, bakteri Berlin mavi boyama ile tespit edilebilir.

SPIO-TB yüzey antikor nanoproblarının TB hedefleme derecesi, konsantrasyona bağımlı bir şekilde oluşan nanoprozların varlığında sinyal yoğunluğunda bir azalma ile belirtildiği gibi T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleme ile belirlenebilir. Nanosonda enjekte edilen hayvanlarda, M.tüberküloz granülomatis bölgelerinde ki sinyal azaltmanın T2 ağırlıklı geliştirilmesi kontrol sahalarından yaklaşık 14 kat daha yüksektir. Enfeksiyondan bir ay sonra nanoprob enjekte edilen C57 siyah 6 faresinde yeni kan vaskülarizasyonu, lenfosit ve epiteloid makrofaj agregaları ile organize bir deri altı granülom görülebilir.

Lezyon bölgesinde pozitif m.tüberküloz ekspresyonu da granülomatöz alanlarda asit hızlı basilboyası ile gözlenir. Berlin mavisi, ferrik demir pozitif bir leke, aynı zamanda tüberküloz sondaların hassasiyetini belirlemek için kullanılabilir. Yaşamın vivo manyetik rezonans görüntüsü için, nanoprob enjekte edilen hayvanlar SPIO-TB antikor problarını enjekte etmeden önce her anestezili deneysel hayvanın temel T2 ağırlıklı hızlı spin-yankı görüntüsünü elde eder. Ekstrapulmoner tüberkülozu saptamak için SOP tekniğini oluşturduğumuza göre, bu antikorlar özellikle ekstrapulmoner tüberküloz tanısında kullanılabilir.