Name: 3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin mesane kanseri invazyonunu tümör sferoidleri kullanarak gerçek zamanlı izleme ve tedavi ajanlarını değerlendirme yöntemini. Bu teknik hücre biyolojisi ve onkoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Howard Crawford (Michigan Üniversitesi) laboratuvar teknik destek ve sağlayan malzemeler ve bu çalışma için donatım ve teknik destek için Alan Kelleher için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser Üniversitesi Michigan Rogel Kanser Merkezi çekirdek Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PIP), bBu YIA (PIP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)'nden hibe tarafından finanse edildi.

1. artan kanser pulcuklarının
<ol><li>
Hücre satırlarından büyüyen
	<ol>
<li>Kültür insan mesane kanseri hücreleri geleneksel yapışık altında hücre kültür koşulları ve % 5 CO2ile sağlanan bir 37 ° C kuluçka korumak. Hücreleri korumak < % 90'ı confluency. Not: kültür kullanılan ortam Dulbecco'nın 4,5 g/L D-glikoz, L-Glutamine, 110 mg/L sodyum pyruvate, içeren en az temel medya (DMEM) değiştiren ve % 10 fetal Sığır serum (FBS) boyunca bu iletişim kuralı ile birlikte değil.</li>
		<li>Deneme, başlamadan önce bir gün trypsinize (% 0.25 kullanarak tripsin-EDTA) hücreleri, hücre konsantrasyonu ölçmek ve 1 x 106 hücreler her iyi 6-şey ultra düşük ek plaka 3 mL kültür ortamda dağıtabilir.</li>
		<li>≥16 h için 37 ° C'de düşük ek koşullar hücrelerde kuluçkaya. Bu hücreler için yeterli zaman izin vermelidir pulcuklarının çoğu mesane kanseri hücre hatları için içine toplamak için. Not: Pulcuklarının oluşumu ters parlak alan mikroskop tarafından görülebilir. Pulcuklarının sayısı ve en uygun boyutu üzerinde bireysel deney bağlı olabilir ama biz pulcuklarının 50 µm fan çapı 150 µm için genellikle 20 X objektif lens kullanarak zaman hata görüntüleme için uygun olduğunu öğrenin.</li>
		<li>Fibroblastlar veya pulcuklarının içine bağışıklık hücreleri gibi ek hücre türleri dahil etmek istediğiniz hücreleri kanser hücrelerinin istenilen oranında ile karıştırın (1:1, 1:10, vb.) ultra düşük bir ekinde plaka ve 37 ° c ≥16 h oluşumu izin vermek için kuluçkaya karma hücre türü pulcuklarının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Birincil tümörler büyüyor Not: tümör pulcuklarının-da var elde birincil mesane tümörü kaynakları kanserojen kaynaklı mesane tümörü modelleri8geliştirilen tümör gibi. Örneğin, fare oluşturulan mesane tümörleri N ile beslenen-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), hasat ve steril cerrahi aletler kullanarak küçük parçalar halinde (yaklaşık 0,5 mm3) kıyılmış. Birincil insan mesane kanserleri Ayrıca bu sistemde okudu olabilir örnekleri sindirilir.<ol>
<li>Toplamak ve 0,5 mm3 tümör adet 5 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) yıkayın. Santrifüjü 200 x g 4 ° C'de 5 min için de Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
		<li>Santrifüjü 200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından tümör parçaları toplamak Süpernatant kaldırın ve 5 mL % 10 içeren DMEM de ekleyin FBS. Tümör küresel/medya karışımı bir 6-şey ultra düşük ek tabağa aktarın. ≥16 kollajen matris gömme önce s için 37 ° C'de kuluçkaya (bkz. Adım 2.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 3-b kültür odası hazırlanması
<ol><li>
Tip-1 kollajen (sıçan kuyruk türetilmiş) % 10 içeren DMEM seyreltik FBS üreticinin yönergelerine uygun 2 mg/mL karışım yapmak.
	<ol>
<li>Kısacası, 1 N NaOH çözüm uygun miktarda kolajen mix ve nazik pipetting tarafından DMEM fizyolojik pH elde etmek için üreticinin talimatlarına dayalı.</li>
		<li>(Çoğu uygulama, bir numara 1.5-cam ile odası slaytlar için en uygun) kolajen ve DMEM karıştırma sonra hızlı bir şekilde odası slayt kuyu kat katılaşma (200 µL/de) önce kollajen-DMEM karışımı ile. 15 dakika oda sıcaklığında sabit olmak kaplı odası slayt izin. Not: Kollajen tabanlı matris bileşimi fibronektin veya laminin, gibi diğer hücre dışı matriks maddeler ekleyerek deney amaçlı göre değiştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaşça damlalıklı 500 µL pulcuklarının (veya tümör parçaları, birincil tümör örnek kullandıysanız) 6-şey ultra düşük ek tabaktan bir boş 1.5 mL microcentrifuge tüpüne içeren medya. Tüp altına yerleşmek pulcuklarının izin için 2 dakika bekleyin.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Başka bir tüp tip-1 kollajen (2 mg/mL) % 10 içeren DMEM ile karışık hazırlamak FBS ve hızlı bir şekilde bu karışımdan 500 µL pulcuklarının için ekleyin. Pulcuklarının ve kollajen yavaş pipetting tarafından karışımı yavaşça.</li>
	<li>250 µL pulcuklarının/kollajen karışımı kollajen-pre-kaplı odası slayt bir kuyu için ekleyin. Tamamen katılaşmaya pulcuklarının içeren kollajen matris (yaklaşık 30 dk 37 ° C'de) izin verir.</li>
	<li>Kollajen matris katılaşmış sonra % 10 içeren DMEM 1 mL ekleyin FBS her şey (Şekil 1B) için. Odası slayt görüntüleme için hazır kadar % 5 CO2 ile sağlanan bir 37 ° C kuluçka kuluçkaya.</li>
</ol>3. canlı hücre zaman hata görüntüleme
<ol><li>Üreticinin yönergelerini izleyerek confocal mikroskobunun açmak ve iklim odası 37 ° C ulaşır ve % 5 CO2ile sağlanan emin olun. Not: Bizim mikroskobu ve odası genellikle sistem denge ulaşmak için 1 h gereklidir.</li>
	<li>Dikkatle odası slayt için mikroskop ekli slayt adaptör aktarın.</li>
	<li>Bir düşük güç hedefi (Örneğin, 5 X) kullanarak ilgi pulcuklarının bulun ve görüntüleme daha yüksek güç amacı ile başlangıç (geçerli iletişim kuralında, 20 X amaç çoğu daha iyi görüntü kalitesi için canlı hücre görüntüleme için kullanılır). Not: birincil mesane tümörü örnekleri için 5 X ve 10 X hedefleri daha büyük görüntüleme alanını karşılamak için gerekli olabilir. Bizim hızlandırılmış görüntüleme için görüntüleme aralığı 30 dk ayarlanır ve Z yığın tüm küresel görüntü için kullanılır. Hücre/doku floresan protein işaretleri liman genellikle Z-dilimler arasındaki uzaklığı 4 µm için 20 X objektif ve Z ekseni toplam uzunluğu yaklaşık 200 µm. resimler DIC kullanılarak elde edilebilir için ve floresan ile küme.</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme 24-72 saat için gerçekleştirin. Not: Süresi hücre türüne ve deneme ihtiyaçlarına göre belirlenir.</li>
</ol>4. örnek blok dondurulmuş doku kesit için kanser pulcuklarının içeren hazırlanması
<ol><li>Dikkatle kollajen jel ve pulcuklarının odası slaytlardan bloğunu küçük forseps kullanarak kaldırın. Kollajen jel blok bir plastik Histoloji kalıp içine yerleştirin.</li>
	<li>Kısaca kollajen jel 1 x PBS ile durulayın ve sonra %4 paraformaldehyde (PFA) ile PBS içinde oda sıcaklığında 30 dk için düzeltebilirim. Dikkat: PFA olası kanserojen olduğu ve dikkatle ele alınmalıdır.</li>
	<li>PBS kollajen jel 1,5 mL 1 x PBS üzerinde 15 dk. eski yerine koymak için bir shaker ile yıkama ve önceki yıkama 3 x arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>İnce bir tabaka (yaklaşık 3 mm) en uygun kesme sıcaklığı (OCT) yeni bir plastik Histoloji kalıp alt kapak bileşik uygulayın. Sabit yerleştirin ve kollajen jel OKT üstüne bileşik yıkanmış, sonra dikkatlice bütün jel OCT herhangi bir hava kabarcıklarının oluşumunu OCT'de kaçınırken bileşik ile kalıp doldurarak embed.</li>
	<li>1s için 4 ° C'de kalıp bırakın.</li>
	<li>Örnek ve OCT bileşik üzerinde 100 mm Petri kabına sıvı azot üzerinde yüzen içeren kalıp yerleştirin. Tamamen flaş dondurma örnek sağlar.</li>
	<li>Donmuş örnek blok ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolayın.</li>
</ol>5. ayirt görüntüleme için dondurulmuş kesitli kanser pulcuklarının
<ol><li>Donmuş örnek blok-80 ° C dondurucudan bir cryostat-20 ° C odasına aktar.</li>
	<li>
Geleneksel donmuş 7 µm için bölüm aralığını ayarlayarak kesit gerçekleştirin. Kesitli örnekleri kırışıklık olmadan cam slayt eklemek izin veya hava tuzağa.
	<ol>
<li>Slaytları-80 ° C'de daha fazla boyama yapmadan önce depolama. Not: Deneysel ihtiyaçlarına uygun farklı aralıkları kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hava kuru oda sıcaklığında 1 h için slaytlar.</li>
	<li>Örnekleri % 0.5 içeren PBS ile permeabilize Triton X-100 15 dakika.</li>
	<li>Yıkama yıkama başına 10 min için PBS ile 3 x örnekler.</li>
	<li>Örnekleri ile hidrofobik engelleri slaytta bir hidrofobik bariyer kalemi çevreler.</li>
	<li>Örnekleri engelleme solüsyonu (%5 Sığır serum albumin (BSA) içeren 1 x PBS), muamele etmek, oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>Birincil antikor içeren çözüm (%5 BSA ile 1: 100 seyreltme, birincil antikor içeren 1 x PBS) 40 µL slaytta yer alan her örnek için geçerli.</li>
	<li>Birincil antikor için 1 h 37 ° C'de veya oda sıcaklığında (kuluçka zaman ve koşullar birincil antikor bağlı olarak değişir) bir gecede slaytları kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama PBS ile 3 x 15 dk (başına yıkama) için örnekler.</li>
	<li>İkincil antikor içeren çözüm (1 x PBS BSA % 5 ile 1:300 ikincil antikor seyreltme içeren) 40 µL slaytta yer alan her örnek için geçerli.</li>
	<li>Yıkama PBS ile 3 x 15 dk (başına yıkama) için örnekler.</li>
	<li>Höchst 33342 çözüm (1 µg/PBS içinde seyreltilmiş mL,) ile örnekleri, oda sıcaklığında 10 dakika için leke. Sonra PBS ile 5 min için örnekleri yıkayın.</li>
	<li>Örnekleri ile montaj orta dağ ve bunları uygun şekilde boy kapak torbalarla kapatın. Slaytları, oda sıcaklığında 24 h için karanlıkta bırakın ve sonra confocal mikroskobu gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Society%22">The Society</a>. , Atlanta, GA. (2018).</li>
<li>Knowles, M. A., Hurst, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+bladder+cancer%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+clinical+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).</li>
<li>DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+Cancer%3A+Diagnosis+and+Treatment.+American+Family+Physician%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician.</a> American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).</li>
<li>Repesh, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro.+assay+for+quantitating+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion.</a> Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+system+as+a+model+for+studying+cancer+cell+invasion+capacity+and+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity.</a> Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro.+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Expermintal+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion.</a> International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).</li>
<li>Rebelo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-3-culture%3A+A+tool+to+unveil+macrophage+plasticity+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment.</a> Biomaterials. , 185-197 (2018).</li>
<li>Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+BBN+as+an+urothelial+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Review: BBN as an urothelial carcinogen.</a> In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).</li>
<li>Palmbos, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC%2FTRIM29+Drives+Invasive+Bladder+Cancer+Formation+through+miRNA-Mediated+and+Epigenetic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms.</a> Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC+induces+an+invasive+switch+in+KRAS-induced+pancreatic+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis.</a> Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).</li>
<li>Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movers+and+shakers%3A+cell+cytoskeleton+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vimentin+intermediate+filaments+in+the+progression+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).</li>
<li>Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments+Play+a+Pivotal+Role+in+Regulating+Cell+Architecture+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).</li>
<li>Papafotiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRT14+marks+a+subpopulation+of+bladder+basal+cells+with+pivotal+role+in+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis.</a> Nature Communications. 7, 11914(2016).</li>
<li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).</li>
<li>Goddette, D. W., Frieden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization.+The+mechanism+of+action+of+cytochalasin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gel+three-dimensional+matrices+combined+with+adhesive+proteins+stimulate+neuronal+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).</li>
<li>LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structure and function of basement membranes.</a> Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).</li>
<li>Rakha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+in+breast+lesions%3A+the+role+of+the+epithelial-stroma+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier.</a> Histopathology. , (2017).</li>
<li>Erler, J. T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+context+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional context regulation of metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Burada kanser ilerlemesi ve metastaz için kritik olan mesane kanseri işgalinin gerçek zamanlı gözlem izin veren bir 3-b tümör küresel modeli açıklar. Bu sistem daha iyi özetlemek için Müfettişler nerede mesane kanseri istila gerçekleşir doku microenvironment izin vermek için çeşitli stromal ve hücresel bileşenleri birleşme için mükellef. Mesane kanseri pulcuklarının hücre hatları (genetiği değiştirilmiş hücre hatları işgali süreçleri etkiler yolları sinyal sınav için yararlı da dahil olmak üzere) gibi çeşitli kaynaklarda...

İstila metastaz için gereklidir ve alt hayatta kalma ve hastalarda kötü prognoz ile ilişkili kanser ilerleme kritik bir adımdır. İnsan mesane kanseri, her yıl dünya çapında yaklaşık 165,000 ölümler neden olur idrar yolu en yaygın malignite kanser sahne, tedavi ve prognoz doğrudan Invasion1içinse ilişkilendirilir. Mesane kanseri vakalarının yaklaşık % 75'i olan ve olmayan-kas invaziv yerel rezeksiyon ile yönetilir. Buna ek olarak, kas invaziv mesane kanserleri (yaklaşık %25 tüm servis talepleri) yüksek metastatik oranları ile agresif tümör ve agresif mobil terapi2,3ile tedavi edilir. Bu nedenle, istila tetiklemek moleküler yolları anlamak daha iyi karakterize invaziv ilerleme riski ve invaziv ilerleme önleyebilirsiniz tedavi müdahaleler geliştirmek için önemlidir.
Tümör invaziv ilerleme bir karmaşık üç boyutlu (3-D) ortamında oluşur ve diğer tümör hücreleri, stroma, membran ve hücreleri bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kas hücreleri de dahil olmak üzere diğer türleri ile tümör hücre etkileşimi içerir ve vasküler endotel hücreleri. Onlar gerçek zamanlı işgali sürecinde mikroskobik izleme izin vermemesi nedeniyle geçirgen destek (Örneğin, Transwell) tahlil sistemleri yaygın kanser hücre işgali4ama bu sistemleri quantitate için istihdam sınırlıdır ve daha fazla boyama ve moleküler analiz için numune alınmasını meydan okuyor. Tanımlanmış microenvironmental bileşenleri birleşme vitro sistemleri kolaylık sağlar çünkü işgal eğitim için 3-b mesane tümörü küresel sisteminin geliştirilmesi arzu edilir.
Bu protokol için biz müfettişler hücre hareketliliği izlemek izin vermek için kollajen tabanlı jel matrisler ve confocal mikroskobu birleştirilerek bir 3-b küresel işgal tahlil kullanarak insan mesane kanser hücrelerinin invaziv işlemler sorguya çekmek için bir sistem tarif ve gerçek zamanlı (Şekil 1A)'ı işgal. Bu sistem çok yönlü ve çeşitli stromal/tümör ayarları sorgulamak için değiştirilebilir. Fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri5,6,7kanser ilişkili gibi çoğu mesane kanseri hücre hatları veya birincil mesane tümörleri ve ek stromal hücreler ekleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı tip-1 kollajen oluşan bir matris açıklar, ancak diğer molekülleri fibronektin laminin veya diğer kollajen protein gibi dahil etmek için değiştirilebilir. İnvaziv işlemler için 72 saat veya daha uzun mikroskop ve kullanılan sistemi bağlı olarak izlenebilir. Fiksasyon ve 3-b matrix önce sırasında ve sonrasında işgal gömülü tümör ayirt boyama sağlar böylece çok önemli bilgiler genellikle yok veya toplamak zor sağlayan proteinler upregulated invaziv hücrelerdeki sorgulama diğer 3-b kültür modellerini kullanarak. Bu sistem ayrıca işgal engellemek ekran bileşikleri ve sinyal yollar böyle bileşikler tarafından etkilenen betimlemek için yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>İnsan mesane kanseri hücre hatları UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM hücre kültürü ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultral-düşük ataşman 6 kuyulu küme&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Konvansiyonel ters mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>Hücre kültürü ve sferoidlerin kontrolü için genel kullanım</td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğundan kollajen tip 1, yüksek konsantrasyon&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>İklim odası, çok konumlu görüntüleme ve Z-yığını tarama işlevine sahip bir konfokal miskoskop&nbsp;</td></tr><tr><td>Kriyostat mikromtomu</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Görüntü işleme yazılımı&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP Kalem</td><td>Vektör Laboratuvarları&nbsp;</td><td>H4000</td><td></td></tr><tr><td>OCT bileşiği&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solüsyonu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATDC (Trim29) antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sitokeratin 14 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Montaj ortamı</td></tr></tbody></table>

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Mesane kanseri önemli sağlık sorunudur. Bu 16.000'den fazla insan mesane kanseri gelen Amerika Birleşik Devletleri'nde bu yıl ölecek tahmin edilmektedir. Mesane kanserleri % 75'i non-invaziv ve metastaz olası olsa da, yaklaşık % 25 için bir invazif büyüme desen ilerleme. İnvaziv kanser hastalarının yarısı kadar öldürücü metastatik nüks gelişecektir. Böylece, invaziv mesane kanseri ilerlemesinde mekanizmasını anlamak hasta sonuçları tahmin ve öldürücü Metastazlari önlemek çok önemlidir. Bu makalede, biz tümör hücreleri ve mesane tümörü microenvironment meydana gelen vivo içinde koşulları taklit stromal bileşenleri sağlayan bir üç boyutlu kanseri istila modeli mevcut. Bu model içinde gerçek zaman zaman hata Imaging'i kullanma invaziv işlem gözlemlemek, moleküler yollar blok işgali potansiyeline sahip confocal immünfloresan görüntüleme ve ekran bileşikleri kullanarak ilgili sorguya fırsatı sağlar. Bu iletişim kuralı mesane kanseri üzerinde duruluyor olsa da, benzer yöntemleri işgali ve motilite diğer tümör tipleri de incelemek için kullanılan olabilir muhtemeldir.

İnvaziv mesane kanseri tümörü küresel başarılı oluşturulmasını uygun boy tümör pulcuklarının hücre hatlarından veya birincil tümör oluşumu gerektirir. Resim 2 A uygun ölçekli pulcuklarının dört insan mesane kanseri hücre satırlarından (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J ve UM-UC18) geliştirilen gösterir. Resim 2 B bir tümör küresel kollajen matris içinde gömülü bir BBN tarafından oluşturulan fare mes...

Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

İnvaziv progresyon, mesane kanserli hastalarda klinik sonucun çok önemli bir belirleyicisidir. Burada, istilayı incelemek için hücre dizileri veya primer tümörler kullanılarak oluşturulan tümör sferoidlerini kullanan basit bir in vitro yöntemi tanımlayacağız. Bu tekniğin temel avantajı, kanser istilası sürecini gerçek zamanlı olarak izleyebilmemiz ve ayrıca deneyin sonunda örnekleri sorgulamak için immünofloresan boyama kullanabilmemizdir.Bu teknik, fibro blast veya bağışıklık hücreleri gibi diğer hücre tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir. İstilayı engellemek için yararlı olabilecek bileşikleri test etmek için de kullanılabilir. Başarı için kritik faktörler arasında tümör sferoid oluşumunun optimizasyonu ve kollaje gömülmesi, uygun mikroskopi kullanımı, doğru çalışma mesafesi ve uygun immün boyama prosedürleri yer alır.Hücre hatlarından sferoidler üretmeye başlamak için, geleneksel yapışma hücre kültürü koşulları altında insan mesane kanseri hücrelerini kültürleyin. Deneyden bir gün önce, hücreleri tripsinize edin ve üç mililitre hücre kültürü ortamında 1.000.000 hücreyi altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Daha sonra, hücreleri en az 16 saat boyunca 37 santigrat derecede düşük bağlanma koşullarında inkübe edin.Primer tümörlerden sferoidler oluşturmak için, beş mililitre buz gibi soğuk PBS'de 0,5 milimetre küp küp tümör parçalarını toplayın ve yıkayın. Tümör parçalarını dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Bundan sonra, tümör parçalarını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleme yoluyla toplayın.Daha sonra süpernatanı çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş beş mililitre DMEM ekleyin. Tümör sferoid ortam karışımını altı oyuklu ultra düşük bağlantı plakasına aktarın. Daha sonra plakayı en az 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.İlk olarak, mililitre başına iki miligramlık bir karışım yapmak için% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de tip bir kollajeni seyreltin. Daha sonra, bir oda slaytının kuyularını hızlı bir şekilde karışımla kaplayın. Oda sürgüsünü oda sıcaklığında 15 dakika sabit tutun.Bundan sonra, ultra düşük bağlantı plakasından 500 mikrolitre küresel ortamı 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne nazikçe pipetleyin. Daha sonra sferoidlerin iki dakika boyunca tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Süpernatanı tüpten dikkatlice çıkarın.Daha sonra hızlı bir şekilde 500 mililitre taze kollajen DMEM karışımını sferoidlere ekleyin. Sferoidleri ve kolajeni nazikçe karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, kollajen kaplı hazne slaytının kuyucuklarına 250 mikrolitre küresel kollajen karışımı ekleyin.Sferoid içeren kollajen matrisinin tamamen katılaşmasına izin verin. Kollajen matrisi katılaştıktan sonra, hazne slaytlarının her bir oyuğuna FBS ile takviye edilmiş bir mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra hazne slaytını 37 santigrat derecede% 5 CO2 ile inkübe edin.Konfokal mikroskobu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve iklim odasının 37 santigrat dereceye ulaştığından ve %5 CO2 ile beslendiğinden emin olun. Ardından, hazne slaytını mikroskop slayt adaptörüne aktarın. Düşük güçlü bir objektif kullanarak, ilgilenilen sferoidleri bulun, ardından yüksek güçlü objektifle görüntülemeye başlayın ve 24 ila 72 saat boyunca hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.İlk olarak, kollajen jeli ve sferoid bloğunu oda slaytından kaldırmak için küçük forseps kullanın. Ardından kollajen jel bloğunu plastik bir histoloji kalıbına yerleştirin. Kollajen jel bloğunu 1x PBS ile kısa bir süre durulayın.Ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA ve PBS ile sabitleyin. Bundan sonra, kollajen jel bloğunu 1.5 mililitre 1x PBS ile bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika yıkayın. Yeni bir plastik histoloji kalıbının altına ince bir OTC bileşiği tabakası uygulayın.Ardından, kalıbın geri kalanını OTC bileşiği ile dikkatlice doldurmadan önce sabitlenmiş ve yıkanmış kollajen jel bloğunu OTC bileşiğinin üzerine yerleştirin. Kalıbı bir saat boyunca dört santigrat derecede tutun. Bundan sonra, kalıbı sıvı nitrojen üzerinde yüzen 100 milimetrelik bir petri kabında hızlı dondurun ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.Donmuş numune bloğunu bir kriyostatın eksi 20 santigrat derece odasına aktarın. Ardından, yedi mikrometre kesit aralığı ile geleneksel donmuş kesit alma işlemini gerçekleştirin. Bundan sonra, slaytları oda sıcaklığında bir saat havayla kurutun.Daha sonra% 0.5 Triton X-100 içeren PBS ile numuneleri 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Daha sonra, numuneleri PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra numuneleri hidrofobik bir bariyer kalemle çevreleyin.Numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici solüsyon ile muamele edin. Daha sonra her numuneye 40 mikrolitre primer antikor içeren solüsyon uygulayın. Slaytları 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.Bundan sonra, numuneyi yıkama başına 15 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra her numuneye 40 mikrolitre ikincil antikor içeren çözelti uygulayın. Daha sonra numuneleri yıkama başına 15 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.Numuneyi Hoechst 33342 çözeltisi ile oda sıcaklığında 10 dakika boyayın. Daha sonra numuneleri PBS ile beş dakika yıkayın. Numuneleri montaj ortamı ile monte edin ve üzerlerini lamel ile örtün.Son olarak, konfokal mikroskopi yapmadan önce slaytları oda sıcaklığında 24 saat karanlıkta bırakın. Bu protokolde hücre hatları ve primer tümörlerden invaziv mesane kanseri tümör sferoidleri oluşturuldu. Temsili hızlandırılmış video, mesane kanseri tümörünün kollajen matrisine sferoid istilasını göstermektedir.Temsili hızlandırılmış video, GFP işaretli mesane kanseri tümör sferoidlerinin tek başına veya RFP etiketli fibroblastlarla birlikte kültürlenmiş invaziv davranışını göstermektedir. Protein belirteçlerinin immünofloresan boyamasının kullanılmasının fizibilitesini göstermek için, sferoidler 24 veya 72 saatte sabitlendi, kesitlere ayrıldı ve boyandı. UM-UC-14 sferoidlerinin daha yüksek büyütme görünümü, ataksi telenjiektazi grup D ile ilişkili protein için filamentli boyamayı gösterir.24 saatlik invazyondan sonra UM-UC-18 sferoidlerinden yayılan yüksek invaziv hücreler, Epitelden Mezenkimal geçişin bir belirteci olan yüksek düzeyde Vimentin eksprese eder. Bu test, mesane kanseri invazyonunun farmakolojik inhibitörlerinin sınırlı taramaları için yararlıdır. Sitokalasin D burada invazyonun farmakolojik inhibisyonunu temsil etmek için kullanılır.Burada, mesane kanseri istilasının gerçek zamanlı gözlemine izin veren bir model açıklıyoruz. Bu sistem, araştırmacıların mesane kanseri istilasının meydana geldiği doku mikro ortamını daha iyi özetlemelerini sağlayan çeşitli stromal ve hücresel bileşenlerin dahil edilmesine uygundur. Bu sistem sadece istilayı 3D ortamda incelemek için yararlı bir araç sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kanser hücresi istilasını engelleme potansiyeline sahip farmolojik bileşiklerin sınırlı taraması için de uygundur.

3-d-cell-culture-system-for-studying-invasion-evaluating-therapeutics

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

İnterstisyel sıvı akışı solid tümörler yüksek olan ve tümör hücre invazyonu modüle olabilir. Burada bir matris içinde gömülü hücrelere interstisyel sıvı akışı uygulayıp sonra hücre işgali üzerine etkilerini ölçmek için bir tekniği açıklar. Bu teknik, kolayca diğer sistemlerle çalışmaya adapte edilebilir.

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

Bu video, meme kanseri hücrelerini bir 3B bazal membran protein matrisinde büyütmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlar ve çevredeki ortama hücre istilasının değerlendirilmesinde 3B kültürün potansiyelini örneklendirir.

3D Kültür Bazal Membran Deneyi: Hücre İstilasını İncelemek için 3D Bazal Membran Protein Matrisi Üzerinde Kanser Hücrelerinin Kültürlenmesi

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Bu protokol, kanserojen kaynaklı murin mesane kanserinden elde edilen mesane tümörü organoidlerinin üç boyutlu in vitro kültürünü oluşturmak için ayrıntılı deneysel adımlar sağlar. Paslanma, genetik mühendislik ve tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonlarını içeren kültür yöntemleri tanımlanmıştır.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO'ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.

Hassas Tıp Araçları Olarak Mesane Kanseri Organoidleri Kültürü

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Öğrenin mesane kanseri invazyonunu tümör sferoidleri kullanarak gerçek zamanlı izleme ve tedavi ajanlarını değerlendirme yöntemini. Bu teknik hücre biyolojisi ve onkoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet