Name: Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Öğrenin, bitki ve mantar örneklerini dinamik nükleer polarizasyon ile katı hal NMR analizi için nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, karmaşık karbonhidratların atomik çözünürlükte yapısal karakterizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NSF OIA-1833040 Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ulusal yüksek manyetik alan Laboratuarı (NHMFL) DMR-1157490 ve Florida eyaletinde Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir. MAS-DNP sistem NHMFL, kısmen NIH S10 OD018519 ve NSF CHE-1229170 tarafından finanse edilmektedir.

1. büyüme 13C, 15N etiketli Aspergillus fumigatus sıvı orta
<ol><li>Etiketlenmemiş hazırlanması ve 13C, 15N etiketli büyüme orta Not: Her ikisi de Maya Extract pepton dekstroz Orta (YPD) ve geliştirilmiş en az orta43 mantar kültür bakımı için kullanılmıştır. Isıyla sonra tüm adımlar bir laminar akış hood kontaminasyon en aza indirmek için gerçekleştirilir.<ol>
<li>Etiketlenmemiş sıvı orta hazırlanması: 6.5 g YPD tozu 100 ml distile su ve sonra 25 dakika 134 ° C'de otoklav dağıtılması</li>
		<li>Etiketlenmemiş katı orta hazırlanması<ol>
<li>1.5 g agar ve 6.5 g YPD tozu 100 mL distile su ekleyin.</li>
			<li>Otoklav ortamı için 121 ° C, sonra serin aşağı yaklaşık 50 ° c 25 dk</li>
			<li>13-15 mL orta her öncesi steril plastik Petri kabına aktarın ve hemen bir kapak kullanarak çanak kapağı.</li>
		</ol>
</li>
		<li>13C, 15N etiketli sıvı orta hazırlanması Not: büyüme çözüm için izotop etiketleme, 13içeren en az bir ortam hazırlamak için C-glikoz ve 15N sodyum nitrat ve bir trace öğe çözüm ayrı ayrı hazırlanan ve kullanmadan önce karışık.<ol>
<li>100 mL izotop içeren en az orta Tablo 1' de listelenen olarak hazırlamak. PH NaOH (1 M) veya HCl (1 M) bir çözüm kullanarak 6,6 için ayarlayın.</li>
			<li>Otoklav 121 ° C'de 25 min için en az orta</li>
			<li>100 mL hazırlamak (1, 000 x) eser elementler çözümü, Tablo 2 distile su içinde listelenen tuzları geçiyoruz. Otoklav 134 ° C'de 25 min için çözüm Sakinleş ve çözüm kısa süreli kullanım için 4 ° C'de depolayın. PH yaklaşık 6.5 olacak ve pH metre kullanarak kontrol edilebilir.</li>
			<li>Eser elementler çözüm 0.1 mL 100 mL 13C, 15N etiketli en az orta kullanmadan önce Tablo 2 ' de listelenen gibi ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Büyüme mantar malzemelerin<ol>
<li>Mantar az miktarda depolama laminar akış mahallede inoculating bir döngü kullanarak bir YPD plaka üzerine aktarın. Kültür 30 ° C'de bir kuluçka 2 gün boyunca tutun.</li>
		<li>İnoculating bir döngü bir aktif büyüyen mantar kenar 13C,15N etiketleme çözüm laminar akış başlıklı aktarmak için kullanın. Kültür 30 ° C'de 3-5 gün titreyen bir kuluçka 220 rpm'de tutun.</li>
		<li>4000 x g 20 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet toplamak.</li>
		<li>~0.5 g iyi sulu Pelet toplamak için bir cımbız kullanın (> 50 wt % hidrasyon) NMR çalışmalar için. Herhangi bir noktada hidrasyon kaybı önemli ölçüde spektral çözünürlüklü kötüleşeceğini. Not: gerekirse, küçük bir miktar (0,1 g) sulu mycelia getirilebilir ayrılmış ve tam olarak N2 gaz akışı bir başlık veya hidrasyon düzeyi tahmin ve kuru kitle yüzdeyi hesaplamak için bir lyophilizer altında kurutulmuş. Genellikle, bir Pelet ~0.3 g içeren kuru kitle 3 gün sonra elde edilebilir. Yapılacak NMR deney uzun ise (> 7 gün) ve/veya mantarlar durumunun düzeltilmesi gerekiyorsa, mantar malzeme derinden sıvı N2 için 10-20 dk daha fazla işleme önce donmuş olabilir. Deneme kısa olması durumunda örnek taze kalabilmeniz (3-6 gün),-ebilmek var olmak kaptan donma.</li>
		<li>% 20'si (v/v) gliserol santrifüj tüpü içinde kalan fazladan malzemeleri karıştırın ve uzun süreli depolama için bir-80 ᵒC dondurucuda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Solid-state NMR ve DNP çalışmaları için A. fumigatus hazırlanması
<ol><li>A. fumigatus hazırlanması solid-state NMR deneyler için<ol>
<li>13C, 15N etiketli mantar örnek (adım 1.2.4.) 10 mM fosfat tampon (pH 7,0) küçük moleküller büyüme ortamından bir toplam 3 gün boyunca kaldırmak için bir 3,5 kDa molekül ağırlığı ile kesme bir diyaliz çanta kullanma 4 ° C'de 1 L karşı diyaliz. Arabellek günde iki kez değiştirin. Not: Alternatif olarak, örnek için var olmak yıkamak 6 - 10 kat deiyonize suyla kalan küçük moleküller kaldırmak için kullanma.</li>
		<li>Örnek bir 15 mL tüp ve benchtop santrifüj kullanarak santrifüj 5 min (10.000 x g) için aktarın. Süpernatant kaldırmak ve kalan mantar malzemeleri toplamak.</li>
		<li>70-80 mg paketi düzgün 13C harfiyle ve iyi sulu örnek hamur içine 4-mm ZrO2 rotor veya 30-50 mg 3.2 mm rotor NMR deneyler için için. Hkr yavaşça bir metal çubuk kullanarak örnek sıkmak ve kağıt kullanarak aşırı su emer.</li>
		<li>Sıkı bir şekilde rotor kap ve Spektrometre solid-state NMR karakterizasyonu için örnek yerleştirin. Not: Yepyeni rotor rotor kilitlenme olasılığını en aza indirmek ve NMR spektrometresi sızıntısı örnek için önerilmektedir. Gerekirse, vida mühürleme ile tek kullanımlık bir Kel-F eklemek rotor ikincil bir kapsayıcı olarak hizmet etmek için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNP deneyler için A. fumigatus örnekleri hazırlanması<ol>
<li>DNP çözücüler29,44 (DNP matris olarak da bilinir) 100 µL 13için C,15N etiketli mantar örnekleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüpü hazırlayın. Bu DNP matris d8karışımı içerir-gliserol/D2O/H2O (Vol % 60/30/10). Not: Eğer etiketlenmemiş örnekleri araştırılması için o zaman 13C tükenmiş d8kullanarak DNP matris hazırlamak-gliserol (12C3, %99,95; D8, % 98) ve D2O ve H2O 13C önlemek için sinyal katkı maddeleri.</li>
		<li>AMUPol45 $ 100 µL DNP çözücüler formu 10 mM radikal hisse senedi çözüm için 0.7 mg geçiyoruz. Radikaller tam çözüm içinde çözünmüş emin olmak 2-3 dakika için girdap.</li>
		<li>10 mg diyaliz 13C, 15N etiketli mantar malzemeleri AMUPol çözüm 50 µL (adım 2.1.1 ve 2.1.2) önceki adımlarda açıklandığı gibi emmek ve hafif radikaller nüfuz sağlamak için bir havaneli ve bir havan topu kullanarak karışımı eziyet gözenekli hücre duvarları. Not: hidrasyon kayıp oranını azaltmak için taşlama da bir micropestle kullanarak microcentrifuge tüp içinde gerçekleşebilir.</li>
		<li>Başka bir 30 µL radikal çözüm için daha fazla hidrat öğütülmüş Pelet mantar örnek ekleyin.</li>
		<li>Pelet 3.2 mm Safir rotor topla, hafif sıkmak ve aşırı DNP solvent kaldırın. Nem kaybını önlemek için 3,2 mm silikon tak ekleyin. Tipik olarak, örnek 5-30 mg için rotor paketlenebilir. Tam miktarı yapılacak duyarlılık şartı NMR deneyler tarafından belirlenecektir gerekir.</li>
		<li>Ekle ve DNP Spektrometre örnek'e kadar DNP gelişmiş bir spektrum mikrodalga ışınlama altında ölçmek ve mikrodalga-off spektrum ile karşılaştırın. Bu bir geliştirme faktör εaçma/kapamaiçin hangi-meli var olmak 20-40 karmaşık bu malzemeler için yol açacaktır. Hücre duvar yapısını belirlemek için tasarlanmış deneyler çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bitki biyolojik kütle NMR ve hazırlık DNP çalışmaları
<ol><li>Bitki malzeme solid-state NMR için hazırlanması<ol>
<li>Aynı şekilde 13C harfiyle bitki46,47 daha önce açıklandığı gibi bir büyüme odası veya 13C-glikoz ortamda 13CO2 malzemeleri kullanarak kurum içi üretmek veya doğrudan etiketli malzeme satın almak izotop etiketleme şirketler. Not: 13C-glikoz yalnızca karanlık büyüme 12C giriş önlemek için fotosentez tarafından kullanılabilir.</li>
		<li>Kesme düzgün 13C etiketli bitki materyali küçük parçalara (genellikle 1-2 mm içinde boyut) laboratuvar jilet kullanarak. Not: amaç bağlı olarak, ayıklanan hücre duvarları bazen yapısal karakterizasyon için kullanılır ve detaylı iletişim kuralları önceki çalışmaları21,46de raporlanır.</li>
		<li>Örnek daha önce kurudu, su 100 µL bitki malzemeler 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 30 mg ekleyin girdap, oda sıcaklığında 1 gün için equilibrate. 4000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve aşırı su bir pipet kullanarak kaldırın.</li>
		<li>Hiçbir zaman herhangi bir noktada kurutulmuş örnek, doğrudan örnek daha ileri tedavi olmadan kullanın.</li>
		<li>3.2 mm veya 4 mm ZrO2 rotor solid-state NMR deneyler için içine elde edilen bitki malzeme paketi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNP çalışmaları için bitki malzeme hazırlanması<ol>
<li>60 µL hisse senedi çözüm 10 mm AMUPol olarak açıklanan adımları 2.2.1 ve 2.2.2 radikal hazırlayın.</li>
		<li>Kesme düzgün 13C bitki materyali (1-2 mm içinde boyut) küçük parçalara incelenecektir için etiketli bir laboratuvar jilet kullanarak ve bitki malzemelerin 20 mg tartmak.</li>
		<li>El-bitki parçaları küçük parçacıklar (~ 1-2 mm boyutunda) eziyet bir harç ve havaneli kullanarak. Son tozlar homojen bir görünüme sahip.</li>
		<li>Bitki materyali için önceki adımda (adım 2.2.2) 40 µL DNP hisse senedi çözüm hazırlanan ekleyin ve hafif radikal ile karıştırma homojen sağlamak 5 min için eziyet.</li>
		<li>Başka bir 20 µL daha fazla bitki materyali taşlama sonra hidrat için hisse senedi çözüm ekleyin.</li>
		<li>DNP deneyler için 3,2 mm Safir rotor içine dengelenmiş bitki örnek paketi. Hidrasyon kayıplarını önlemek için silikon tak takın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Standart Solid-State NMR deneyler için karbonhidrat açısından zengin Biyomalzeme ilk karakterizasyonu
Not: Bu bölümde NMR deneyler kısa bir genel bakış sağlanmaktadır. Ancak, yapısal aydınlatma genellikle geniş uzmanlık gerektirir. Bu nedenle, NMR spectroscopists ile ortak çalışmaları tavsiye edilir.
<ol><li>Ölçü birimi 1D 13C çapraz polarizasyon (CP), 13C doğrudan polarizasyon (DP) 2-s ve 35-s ile geri dönüşüm gecikmeler ve dinamik bir genel iyi anlamak için 1H -13C BECERİKSİZ48,49 spectra Dağıtım hücre bileşenleri (Şekil 1a). Hücre duvarlarının genellikle nispeten sert bölümüdür ve CP spektrumda baskın sinyalleri sergilemek.</li>
	<li>Bir dizi standart 2D 13C -13C korelasyon deney 13C sinyallerin rezonans atamaların ölçmek. Başlatmak, karbon bağlantısı almak için yetersiz refocused50,51 ile hangi aracılığıyla uzay deneyleri 1.5-ms RFDR52 (Şekil 1b) ve 50-ms kablosu gibi bir dizi yardımcı olabilir gerek/DARR53 deneyler. Not: ilgi belirli bir bileşen, örneğin, zengin bir örnek bulmak için birincil veya ikincil hücre duvarları, Eğer o zaman birden çok kesimi ya da birden çok bitki optimal bileşimi ile örnek bulmak için ayrı olarak ölçülecek gerekebilir.</li>
	<li>Rezonans atamaları kattım karbonhidratlar ve proteinler kolaylaştırmak için ölçülen 2D 15N -13C korelasyon deneyler. Not: Rezonans atama genellikle zaman alır. Bir yöntem şu anda bilimadamlarından deneyiminiz olmadan için karbonhidrat sinyallerin rezonans atama kolaylaştırmak için geliştirilmektedir.</li>
	<li>Kayma proximities (Şekil 1 c, d), hidrasyon ve karbonhidrat açısından zengin malzemesi olarak üç boyutlu yapısını belirlemek için karmaşık biomolecules mobilities belirlemek için daha özel deneyler ölçmek sistematik olarak daha önce açıklanan22,29.</li>
</ol>

İfşa etmek yok.

Biyokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, solid-state NMR bir non-yıkıcı ve yüksek çözünürlüklü Teknik olarak avantajları vardır. NMR da kompozisyon analizde nicel ve çoğu diğer analitik yöntemler aksine, değil belirsizlikler tanıttı biyopolimer sınırlı çözünürlük tarafından. Geçerli protokol kurulması karbonhidrat açısından zengin Biyomalzeme ve functionalized polimerler gelecek çalışmalar kolaylaştırır. Ancak, rezonans atama ve veri analizi zaman alıcı olması ve genellikle sistematik eğitim gerektiren unutulmamalı...

Karbonhidratlar enerji depolama, yapısal bina ve hücresel tanıma ve yapışma gibi çeşitli biyolojik süreçlerin merkezi bir rol oynamaktadır. Onlar hücre duvarı zenginleştirilmiş olan bitkiler, mantarlar, algler ve bakteri1,2,3temel bir bileşenidir. Hücre duvarı biyoyakıt ve biyomalzeme üretiminde için merkezi bir kaynak yanı sıra antimikrobiyal tedaviler4,5,6,7,8 için umut verici bir hedef olarak hizmet vermektedir , 9.
Bu karmaşık malzemelerin çağdaş anlayış önemli ölçüde dört önemli biyokimyasal veya genetik yöntemlerle yapısal karakterizasyon adamış çabaları onlarca tarafından ileri. İlk büyük Yöntem sıralı tedavileri farklı bölümleri, içine hücre duvarları yıkmak için kuvvetli kimyasallar veya enzimler kullanarak kompozisyon tarafından takip kullanır ve bağlantı analizi her Kesir10şekerler. Bu yöntem polimerlerin etki alanı dağıtım ışık tutuyor ama yorumu biomolecules kimyasal ve fiziksel özellikleri nedeniyle yanıltıcı olabilir. Örneğin, alkali ekstrakte kesir daha az yapılandırılmış moleküllerin tek bir etki alanı veya dağınık şekilde ayrılmış molekülleri ile karşılaştırılabilir çözünürlük gelmektedir olup olmadığını belirlemek zordur. İkinci olarak, ayıklanan bölümleri veya tüm hücre duvarları da farklı molekül11,12,13, arasında çapraz olarak da adlandırılan kovalent bağları belirlemek için çözüm NMR kullanarak ölçülebilir 14,15. Bu şekilde ayrıntılı yapısı, kovalent çapa probed ancak sınırlamaları nedeniyle polisakkaritler, crosslinking sitelerin nispeten az sayıda ve stabilize kovalent olmayan etkileri cehalet çözünürlük düşük var olabilir polisakkarit ambalaj, hidrojen bağı, van der Waals kuvvetleri, elektrostatik etkileşim ve polimer dolanması gibi. Üçüncü olarak, bağlama benzeşme kararlı vitro izole polisakkaritler16,17,18,19ama yordamlar önemli ölçüde değiştirebilir arıtma kullanarak oldu yapısı ve özellikleri bu biomolecules. Bu yöntem aynı zamanda karmaşık ifade ve oluştururlar Meclisi biyosentezi sonra çoğaltmak başarısız olur. Son olarak, fenotip, hücre morfolojisi ve genetik mutantlar mekanik özellikleri belirli hücre duvarı bileşeni zayıflatılmış üretimi ile polisakkaritler yapısal işlevleri ışıkları döken, ama daha moleküler kanıtlar bunlar köprü için gereklidir protein makineleri20makroskopik gözlemleri ile mühendislik görev.
Geliştirilmesi ve çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi son gelişmeler bu yapısal bulmaca çözme için eşsiz bir fırsat girmiştik. 2D/3D solid-state NMR deneyler kompozisyon yüksek çözünürlüklü incelenmesi ve karbonhidrat açısından zengin malzemeler büyük pertürbasyon olmadan yerel devlet mimarisini etkinleştirin. Yapısal başarıyla yürütülen çalışmalar hem birincil hem de ikincil hücre duvarları bitkiler, catalytically tedavi biyokütle bakteriyel biyofilm, pigment hayaletler mantar ve son zamanlarda yazarların, patojenik bir mantar sağlam hücre duvarları Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. dinamik nükleer polarizasyon (DNP)32,33,34,35,36,37,38 gelişimi , 39 , 40 , 41 , DNP tarafından duyarlılık geliştirme belirgin bu karmaşık Biyomalzeme deneysel zamanı kısaltır gibi 42 NMR yapısal aydınlatma önemli ölçüde kolaylaştırır. Burada açıklanan protokol için izotop etiketleme-mantar A. fumigatus ve mantar hazırlama yordamları ve bitki örnekleri solid-state NMR ve DNP karakterizasyonu için ayrıntıları. Benzer etiketleme yordamlar değişmiş orta ile diğer mantarlar için geçerli olmalı ve örnek hazırlama yordamları genellikle diğer karbonhidrat açısından zengin Biyomalzeme uygulanabilir olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Amonyum Molibdat Tetrahidrat</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Analitik tartı terazisi</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Model PA84C</td></tr><tr><td>Biyoklav 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td>Borik asit 302319100</td><td></td><td></td>Labconco şirketi</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH9222</td><td>mağazası 15-30 > C</td></tr><tr><td>Kobalt(II) Klorür Hekzahidrat</td><td>Honeywell|Fluka</td><td>60820</td><td>&ge; % 98</td></tr> <tr><td>Bakır (II) Sülfat Pentahidrat</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; % 98</td></tr> <tr><td>Corning LSE çalkalama inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D 2 O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99.9 atom % D</td></tr><tr><td>d 6 -DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99.9 atom % D</td></tr><tr><td>d <sub<>8 / sub>-gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 atom % D</td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü 3.2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Dipotasyum Fosfat</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td> <td>ve ge; % 98</td></tr> <tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td> <td>& ge; %99,5</td></tr> <tr><td>Heraus Megafuge 16R Santrifüj</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Maksimum RCF 25.830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS Tek Kullanımlık Kesici Uç Kiti</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Demir(II) Sülfat Heptahidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; %99+</td></tr> <tr><td>Magnezyum Sülfat Heptahidrat</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>18-26 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Manganez (II) Klorür Tetrahidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td> <td>& ge; % 99</td></tr> <tr><td>Monopotasyum Fosfat</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; % 99</td></tr> <tr><td>pH Metre</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasodyum Etilendiamintetraasetat</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; % 99,5</td></tr> <tr><td>Çinko Sülfat Heptahidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge; %98</td></tr> <tr><td>12C3, d8-gliserol</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarı</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, %99.95; D8,% 98</td></tr> <tr><td>13 C6-glikoz</td><td>Sigma Alrdrich</td><td>364606</td> <td>& ge; % 99 (CP)</td></tr><tr><td>15N-sodyum nitrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; % 98 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr><tr><td>3,2 mm safir NMR rotor</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm Silikon tapa</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4 mm MAS Rotor Kiti</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zirkonya</td></tr></tbody></table>

yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon solid-state nmr için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Bu protokolü nasıl düzgün 13C, 15N etiketli mantar malzemeleri gösterir üretilen ve deneyler nasıl bu yumuşak malzeme solid-state NMR ve duyarlılık gelişmiş DNP için devam. Örnek işleme yordamı bitki biyolojik kütle Ayrıca ayrıntılı. Bu yöntem, bir dizi 1 D ve 2D 13C -13C ölçüm sağlar / yerli onların durumunda, en az pertürbasyon ile karmaşık Biyomalzeme yüksek çözünürlüklü yapısal aydınlatma sağlar15N korelasyon spectra. İzotop etiketleme 1 D spectra şiddeti ve 2D korelasyon spectra polarizasyon transfer verimi miktarının tarafından incelenebilir. Dinamik nükleer polarizasyon (DNP) numune hazırlama başarısı duyarlılık geliştirme faktörüyle değerlendirilebilir. Daha fazla deney polisakkaritler ve proteinler yapısal açılardan incelenmesi üç boyutlu mimari modeli için yol açacaktır. Bu yöntemler değiştirilebilir ve karbonhidrat açısından zengin malzemeler, bitkiler, mantarlar, algler ve bakteri, doğal hücre duvarları da dahil olmak üzere hem de sentez veya karbonhidrat polimerler ve onların karmaşık diğer tasarlanmış bir yelpazede araştırmak için uyarlanmış molekülleri.

İzotop etiketleme önemli ölçüde NMR hassasiyeti artırır ve bir dizi 2D 13C -13C ve 13C -15N kompozisyon, hidrasyon, hareketlilik analiz etmek için korelasyon spectra ölçme ve ambalaj için mümkün kılar Polimerler, hücre duvarı mimarisi (Şekil 1) üç boyutlu bir model oluşturmak için entegre edilecek. Tek tip etiketleme işlemi başarılı olursa, 1D 13C ve 15N spectra tam bir set içinde 1 h toplanabi...

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Bu protokol katı hal nükleer manyetik rezonans, veya NMR ve dinamik nükleer polarizasyon, ya da DNP, karmaşık biyosistem karakterizasyonu için deneyler için mantar ve bitki malzemeleri hazırlamak için kullanılabilir. Bu teknik, biyomateryalleri ana ortamlarında, örneğin tüm hücrelerde atomik çözünürlük düzeyine kadar araştırmamıza olanak sağlar. Mantar malzemeleri hakkında yüksek çözünürlüklü yapısal bilgilerin edinimi antifungal ilaçların geliştirilmesine yardımcı olacaktır.Yöntem, mantar hücre duvarlarındaki kompleks karbonhidratların bileşimi ve yapısı hakkında bilgi sağlar ve bitkiler, mantarlar, yosunlar ve bakteriler de dahil olmak üzere birçok karbonhidrat açısından zengin organizmaya uygulanabilir. Bazı araştırmacılar kendi hücresel kültürlerde mantar kontaminasyonu ile mücadele edebilir. Benim tavsiyem bu kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce orta ve ekipman iyice sterilize etmektir.Bu gösteri, NMR veya hücre kültüründe çok az deneyime sahip araştırmacıların bu teknikleri mantar ve bitki sistemlerinde nasıl uygulayacaklarını öğrenmelerine yardımcı olacaktır. Etiketsiz sıvı büyüme ortamı hazırlamak için, 6,5 gram maya özü peptone dekstroz veya YPD tozunu 100 mililitre distile suda çözün ve elde edilen çözeltiyi 134 santigrat derecede 25 dakika otoklavlayın. Etiketsiz katı büyüme ortamı hazırlamak için, 100 mililitre distile suya 6,5 gram YPD agar tozu ekleyin ve ortayı yaklaşık 50 santigrat dereceye kadar soğutmadan önce 121 santigrat derecede 25 dakika otoklavlayın.Daha sonra, eritilmiş katı büyüme ortamının 13 ila 15 mililitresini tek tek steril plastik Petri kaplarına aktarın ve kapakları hemen tabakların üzerine yerleştirin. Karbon-13, azot-15 etiketli sıvı büyüme ortamı hazırlamak için, gerektiğinde asit veya baz ile 6,6 pH'a kadar izotop içeren 100 mililitrelik bir izotop hacmini ayarlayın. Daha sonra, distile su 100 mililitre tabloda listelenen tuzları eritin, karbon-13, azot-15 etiketli sıvı büyüme ortamı ekleyin ve 121 santigrat derece 25 dakika için ortaya çıkan çözelti autoclave.Çözelti oda sıcaklığına soğuduğunda, karbon-13, azot-15 etiketli minimum ortam tüm hacmine 100 mikrolitre eser element çözeltisi ekleyin. Mantar malzemelerini yetiştirmek için, depolamadan küçük miktarda mantarı YPD plakasına aktarmak için aşılayıcı bir döngü kullanın ve mantarı 30 derecelik bir kuluçka makinesinde iki gün boyunca kültüre aktarın. Kuluçka sonunda, aktif büyüyen bir mantar kenarını karbon-13'e, azot-15 etiketli sıvı büyüme ortamına aktarmak için yeni bir aşılama döngüsü kullanın ve kültürü sallayarak bir kuluçka makinesinde üç ila beş gün boyunca dakikada 30 santigrat derece ve 220 dönüşe yerleştirin.Mantar büyük miktarlarda şişe alt kapak ve sıvı içinde yüzen, santrifüj ile mantar toplamak ve supernatant atın. Peleti uygun bir çözeltiyle nemlendirin ve NMR ve DNP analizleri için yaklaşık 0,5 gram iyi sulu pelet toplamak için forseps kullanın. Daha sonra, konik bir tüp te %20 gliserol çözeltisi ile kalan malzemeyi karıştırın ve mantar örneğini uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede yerleştirin.Katı hal NMR analizi için A.fumigatus hazırlamak için, ilk olarak 0.5-gram karbon-13 diyaliz 3.5-kilodalton moleküler ağırlık kesme ile bir diyaliz torbası kullanmak, azot etiketli mantar örneği bir litre karşı 10-milimolar fosfat tampon dört derece santigrat üç gün boyunca büyüme ortamı küçük molekülleri kaldırmak için. Diyaliz sonunda, santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp içine örnek aktarın ve dört milimetrezirkonyum dioksit rotor içine düzgün karbon-13 etiketli ve iyi sulu örnek macun 70 ila 80 miligram paketi. Aşırı suyu emmek için kağıt kullanarak numuneyi hafifçe ve tekrartekrar sıkmak için metal bir çubuk kullanın.Daha sonra, rotorsıkıca kapve katı hal NMR karakterizasyonu için spektrometre içine örnek ekleyin. A.fumigatus'u DNP analizi için hazırlamak için, karbon-13 başına 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 100 mikrolitre DNP matrisi ekleyin, karbon-15 etiketli mantar numunesi ve 10 milimolar radikal stok çözeltisi oluşturmak için her tüpe 0,7 miligram polarize etkeni çözün. Radikallerin çözeltide tamamen çözünmesini sağlamak için iki ila üç dakika girdap yaptıktan sonra, 10 miligram arabozkarbon-13, polarize ajan çözeltisinin 50 mikrolitresinde azot-15 etiketli mantar numunesi ıslatın ve radikallerin gözenekli hücre duvarlarına nüfuz etmesini sağlamak için karışımı hafifçe öğütmek için bir havaneli ve harç kullanın.Mantar örneğini daha fazla nemlendirmek için zemin peletine 30 mikrolitre daha radikal çözelti ekleyin ve peleti 3,2 milimetrelik safir rotora sığdırın. Hafifçe sıkın ve gösterildiği gibi aşırı DNP çözücü kaldırın ve hidrasyon kaybını önlemek için 3.2 milimetrelik silikon fişi ekleyin. Daha sonra, rotoru rutin deney için bir NMR spektrometresine veya mikrodalga ışınlama altında DNP ile geliştirilmiş spektrumun ölçümü için bir DNP spektrometresine ekleyin.DNP çalışmaları için tesis malzemeleri hazırlamak için, düzgün karbon-13 etiketli bitki malzemesini bir ila iki milimetrelik parçalarhalinde kesmek için bir jilet kullanın. Son toz homojen bir görünüme sahip olana kadar küçük parçacıklar halinde parçaları öğütmek için bir harç ve havaneli kullanın. Bitki materyaline 40 mikrolitre 10 milimolar radikal stok çözeltisi ekleyin ve radikal ile homojen karıştırma sağlamak için numuneyi beş dakika daha hafifçe öğütün.Zemin örneğini 20 mikrolitre daha radikal stok çözeltisi ile nemlendirin ve dnp analizi için dengelenmiş bitki örneğini 3,2 milimetrelik safir rotora sığdırın. Ardından, hidrasyon kaybını önlemek için silikon fişi takın ve numuneyi DNP spektrofotometresine yükleyin. İzotop etiketleme önemli ölçüde NMR duyarlılığını artırır ve iki boyutlu karbon-13-karbon-13 ve karbon-13-azot-15 korelasyon spektrumları bir dizi ölçmek için mümkün hale getirir kompozisyon analiz etmek, hidrasyon, hareketlilik, ve hücre duvarı mimarisinin üç boyutlu bir model ininşaat için polimerlerin entegrasyonu için polimerlerin ambalaj.2B karbon-13-karbon-13 spektrumunda çapraz dışı sinyallerin elde edilmesi zorsa, istatistiksel etiketleme meydana gelmiş olabilir. İki karbon-13 zirvesi 96 ve milyonda 92 parça glikoz imzası karbon-1 sinyalleri vardır. Bu nedenle, 35 saniye uzun geri dönüşüm gecikmeleri ile ölçülen kantitatif karbon-13 doğrudan polarizasyon spektrumlarındaki güçlü yoğunlukları genellikle eksik diyaliz veya yıkama nedeniyle küçük moleküllerin hakimiyetini gösterir.İyi etiketlenmiş numunelerle, biyomoleküllerin mekansal yakınlıklarını tespit etmek ve bozulmamış hücre duvarlarının yapısal bir modelini oluşturmak için uzun menzilli korelasyonlar daha da ölçülebilir. Bu teknik, karbonhidrat açısından zengin biyomalzemeler ve işlevsel polimerler üzerinde gelecekteki çalışmaları kolaylaştırarak, birçok doğal olarak meydana gelen ve tasarlanmış malzemelerin yapı işlevinin araştırılmasını sağlar. Bazı mantarlar insanlarda enfeksiyona veya sistematik hastalıklara neden olabileceğinden, mantar malzemelerini korunmak ve maruziyeti en aza indirmek için laminar akış kaputunda ele aldığından emin olun.

preparation-fungal-plant-materials-for-structural-elucidation-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Çözünme dinamik nükleer polarizasyonu (DNP) tarafından sağlanan duyarlılık artışı, metabolik süreçlerin NMR ve MRI ile gerçek zamanlı olarak takip edilmesini sağlar. Enzimatik reaksiyonları incelemek için tasarlanmış özel bir çözünme DNP kurulumunun özellikleri ve performansları tartışılmaktadır.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

Bu protokol, enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce RE'yi 2 aminobenzamid ile etiketleyerek ve ardından elde edilen oligosakkaritlerin kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak analiz edilmesiyle, heteroksilanların indirgeyici uç (RE) ve iç bölge glikosil dizi(ler)inin yapısal karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri açıklar.

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

31 P NMR, polifenollerin yapısal aydınlatıcısı için güçlü bir araçtır. Ligninler ve tanenlerdeki farklı hidroksi, fenolik ve karboksilik grupların ölçülmesini ve farklılaşmasını sağlayan bu hızlı, kolay, hassas, nicel ve son derece tekrarlanabilir analitik prosedür artık rutin bir analitik araç haline gelmiştir.

Lignins ve Tanenlerin Nicel 31P NMR Analizi

Bu makale, bitkilerin metabolik profillemesinde PSYCHE ve SAPPHIRE-PSYCHE'nin kullanımını sunmakta ve numune hazırlama ve optimal Pure Shift NMR spektrum kaydı için ayrıntılı prosedürleri içermektedir. Homonükleer ayrışma ile elde edilen çözünürlük kazancının, sistemin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına izin verdiği örnekler tartışılmaktadır.

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Öğrenin, bitki ve mantar örneklerini dinamik nükleer polarizasyon ile katı hal NMR analizi için nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, karmaşık karbonhidratların atomik çözünürlükte yapısal karakterizasyonunu sağlar.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Daha fazla video keşfet