Name: Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Keşfedin, kırmızı pancar yapraklarında geçici dönüşümle tip 1 diyabet için oral aşı adayı üretimini. Bu bitki bazlı yöntem, rekombinant protein elde ederek ağız yoluyla tolerans indüksiyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser ortak projesi "Bitkilerin kullanımı bir otoimmün diyabet yenilebilir aşısı (eDIVA) üretimi için" tarafından desteklenmiştir (Proje kodu: 891854) çağrı 2014 çerçevesinde Verona Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.

1. kırmızı pancar, ıspanak ekimi
<ol><li>Kırmızı pancar büyümek (B. vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (S. oleracea cv Industria) 150 µE ışık şiddeti, %65 bağıl nem, 12 h açık/koyu döngüsü 23/21 ° C, sırasıyla kullanarak bitkilerde büyüme odası.</li>
	<li>Tohum çimlenme sonra haftada bir 1 g/L çözüm ticari gübre (Malzemeler tablo) ile bitkileri döller. Beş haftalık ıspanak ve altı haftalık kırmızı pancar bitkiler için agroinfiltration kullanın.</li>
</ol>2. geçici ifade deconstructed bitki virüs tabanlı teknoloji aracılığıyla
<ol><li>Bitki ifade vektörel çizimler inşaatı<ol>
<li>-5' modülü (pICH20111), yukarıda açıklanan1,2,7olarak hazırlanan 3' modülleri (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut ve pICH7410.eGFP) ve integrase modülü (pICH14011) - vektörel çizimler tanıtmak Agrobacterium tumefaciens GV3101 zorlanma içinde standart teknikler kullanma. 28 ° C'de 2 gün boyunca 50 μg/mL Rifampisin ve uygun vektör özgü antibiyotik (50 μg/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011 ve pICH7410.eGFP), pICH31070 için 50 μg/mL sefaloridin içeren LB ortamdaki büyümek</li>
		<li>Kolonilerin koloni her vektör için aşağıdaki belirli primerler kullanılarak PCR tarafından ekran: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' ve 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' modüller pICH31070.GAD65mut ve pICH31070.∆87G65mut, bir tavlama sıcaklığı 55 ° c ile ve bir uzama süresi 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' ve 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' için bir tavlama sıcaklığı 53 ° c ve bir uzama süresi 30 ile üçüncü 3' modülü pICH7410.eGFP, s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' ve 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' bir tavlama sıcaklığı 53 ° c ve bir uzama süresi 20 s ve 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 ile 5' modül için ' ve 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' integrase modülü ile 57 ° C tavlama sıcaklığını ve bir uzama süresi 45 s.</li>
		<li>Toplam hacmi 20 μL aşağıdaki belirli tepki döngüsü kullanılarak PCR reaksiyonu gerçekleştirmek: 95 ° C'de 5 dk ilk denatürasyon 30 35 döngüleri s 95 ° c, 30 s tavlama sıcaklığı ve uzama adım 72 ° c (tavlama sıcaklığı ve uzama süresi bir Re her astar çift için belirli) ve son uzama adım 7 dk 72 ° C'de</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırınga agroinfiltration<ol>
<li>Üç A. tumefaciens transformants 50 ml LB orta içeren 50 μg/mL Rifampisin ve aşağıdaki uygun vektör özgü antibiyotik aşılamak: pICH20111 ile dönüştürülmüş A. tumefaciens için 50 μg/mL carbenicillin pICH14011 veya pICH7410.eGFP veya pICH31070 ile dönüştürülmüş A. tumefaciens için 50 μg/mL sefaloridin. Gecede 28 ° C'de sallayarak büyümek</li>
		<li>Santrifüjü 4500 x g 20 dk için de tarafından gece bakteriyel kültürlerde cips ve infiltrasyon arabellek 10 mM 4-morpholineethanesulfonic asit (MES; pH 5.5) içeren 100 mL (veya ilk bakteriyel kültürünün iki birim) içinde resuspend ve 10 mM MgSO4OD dikkate almadan,600. Süspansiyonlar, oda sıcaklığında (RT) 3 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Bakteriyel süspansiyonlar bir üç modül, GAD65mut, ∆87GAD65mut veya eGFP 3' modülü, 5' modülü ile ve integrase modülü içeren eşit miktarda karıştırın. Süspansiyon karışımı kırmızı pancar, ıspanak yaprakları şırınga infiltrasyonu için kullanın.</li>
		<li>5 mL süspansiyon bir şırınga iğne olmadan yerleştirin. Yaprağın alt karşı şırınga ıspanak ve kırmızı pancar bitkiler için bastırın ve bu arada diğer taraftaki yaprak yumuşak basıncın uygulayın.</li>
		<li>Her bitki için apex başlayarak ilk üç tamamen genişletilmiş yaprakları sızmak. Yaprak kök agroinfiltrated yapraklarda bir kağıt etiketle etiketleyin. Bitkiler büyüme odası standart koşullar altında dönmek. Not: Sağlık ve güvenlik nedeniyle, infiltrasyon işlemi sırasında göz koruması ve eldiven giymek.</li>
		<li>4 14 gün sonrası enfeksiyon (dpi) ve bunları sıvı azot içinde dondurmak için toplamak agroinfiltrated bırakır. Mağaza bitki doku-80 ° C'de</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vakum agroinfiltration<ol>
<li>Ayrı ayrı üç A. tumefaciens transformants 50 ml 50 μg/mL Rifampisin ve uygun vektör özel içeren LB orta gecede 28 ° C'de sallayarak antibiyotik büyümek</li>
		<li>Santrifüjü 4500 x g 20 dakika süreyle, pelet gecede bakteri kültürleri infiltrasyon arabelleği 0.35 bir OD600 1 L Pelet Resuspend ve RT, süspansiyonlar 3 h için kuluçkaya.</li>
		<li>% 0,01 v/v deterjan (polysorbate 20) her süspansiyon için ekleyin. Bakteriyel süspansiyonlar bir üç modül, GAD65mut, ∆87GAD65mut veya eGFP 3' modülü, 5' modülü ile ve integrase modülü içeren eşit miktarda karıştırın.</li>
		<li>Bir bitki Ekle (altı haftalık kırmızı pancar bitki, bkz: 1) tutucu. Sahibi ters çevir ve infiltrasyon banyo infiltrasyon süspansiyon yapraklarda daldırın için (2 L) içeren bir ölçek üzerine yerleştirin. Not: Bütün yaprakları tamamen bakteriyel süspansiyon daldırma olun. Gerekirse ilave infiltrasyon süspansiyon ilavesi ile düzeyini yükseltmek.</li>
		<li>Batık bitki infiltrasyon banyo infiltrasyon odasına aktarmak ve kapatın. Vakum pompası açmak ve infiltrasyon odası vakum emme valfi açın.</li>
		<li>Bir kez 90 mbar basınç infiltrasyon odasında azalttı, vakum 3 dk. yayın için 45 için vakum tutmak s. İnfiltrasyon odası atmosferik basınç için döndü sonra odası açmak ve bakteriyel banyodan infiltre bitki kaldırın.</li>
		<li>Bitkiler büyüme odası standart koşullar altında dönmek.</li>
		<li>Agroinfiltrated yaprak maksimum ifade dpi'de rekombinant protein bağlı olarak toplamak ve onları sıvı azot içinde dondurma. Mağaza bitki doku-80 ° C'de</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rekombinant protein ifade analizi
<ol><li>Toplam çözünür protein (TSP) çıkarma<ol>
<li>Şırınga eziyet veya vakum adım 2.2.6 ve 2.3.8, sıvı azot harç ve havaneli kullanarak ince toz için toplanan, kırmızı pancar, ıspanak yaprakları sızmış. Toz 15 mL plastik tüpler içine aktarın ve malzeme-80 ° C'de depolayın</li>
		<li>Ayıklama arabelleği (50 mM sodyum fosfat pH 8.0, 20 mM sodyum metabisulphite) 900 µL 300 mg yaprak tozu ekleyin. Not: Bitki doku ağırlığı (mg) arabellek birimine (µL) arasında seçili oranı 1: 3'tür.</li>
		<li>1 dk. için vortexing tarafından karışımı homojenize sonra 30.000 x g 4 ° C'de 40 min için de santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant temiz bir tüp toplamak ve-80 ° C'de saklayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bitki eGFP görselleştirme ve miktar<ol>
<li>Yapraklarda üç teknik çoğaltır, 96-şey tabağa ifade eGFP elde edilen her tatlı KAŞIĞI özü 100 µL yükleyin.</li>
		<li>Bir floresan okuyucu olarak 96-şey plaka koymak ve ölçüm başlar. EGFP floresan algılama için gerekli ayarla 485/535 nm filtre kullanın.</li>
		<li>Mutlak miktar için aynı plaka bir kalibrasyon eğrisi yükleme farklı miktarlar hazırlamak (62.5, 125, 500, 750 ve 1000 ng), saf bir eGFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bicinchoninic asit (BCA) tahlil için çay KAŞIĞI miktar<ol>
<li>50 parça (Tablo reçetesi) Reaktif A Reaktif B (Tablo malzemeler), 1 kısım ile karıştırın. Taze BCA çalışma çözüm yeterli hacim denetlesinler için örnekleri ve Kalibrasyon standartları için hazır olun. Not: 1,9 mL BCA çalışma çözüm her örnek için gerekli birimdir. 9 standartları (boş bir de dahil olmak üzere) ile standart prosedür, BCA çalışma çözüm 17,1 mL gereklidir.</li>
		<li>Her standart (boş bir de dahil olmak üzere) ve çay KAŞIĞI özler etiketli bir tüp içine 0.1 mL pipet. Not: Kalibrasyon standartları olarak sığır serum albümin yeni bir set (BSA) standartları tercihen aynı Dilüent örnekleri, su gibi olarak kullanarak 10-1000 μg/mL aralığında hazırlamak. Boş kalibrasyon standart ve numune hazırlama için kullanılan seyreltici 0.1 mL oluşur.</li>
		<li>1,9 mL BCA çalışma çözeltisi ekleyip iyice karıştırın. Tüplerin kapak ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Tüpler dik ölçmek 562 Absorbans serin nm 10 dakika içinde tüm örnekleri. Not: RT bile, renk geliştirme devam ediyor. Tüm tüpler Absorbans ölçümleri 10 dk içinde yapılırsa önemli hata tanıtılacaktır.</li>
		<li>562 nm Absorbans değeri boş okuma standartları ve çay KAŞIĞI özleri gelen çıkarma.</li>
		<li>Her standart onun konsantrasyon üzerinde okuma arsa boş düzeltilmiş 562 nm. Her tatlı KAŞIĞI özü protein konsantrasyonu belirlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coomassie jel Gecchele vd.8daha önce açıklandığı gibi boyama gerçekleştirmek.</li>
	<li>Western blot analizi<ol>
<li>Daha önce Gecchele vd.8' de açıklandığı gibi Batı leke çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
		<li>Proteinler elektroforetik Boşanmadan sonra onları standart yöntemlerle nitroselüloz membran aktarın. Engelleme çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) pH %7,4 4 süt karıştırarak hazırlayın. Membran ile 10 mL 1 h için RT, çözüm engelleme engellemek.</li>
		<li>Tavşan birincil antikor 1:10,000 anti-GAD65/67 ve anti-LHCB2 ve 1:20,000 anti-eGFP 5 ml %0,1 deterjan ile engelleme çözüm için hazır olun. Gecede 4 ° C'de veya sabit ajitasyon ile RT 4 h için hazırlanan birincil antikor çözümleri ile membran kuluçkaya.</li>
		<li>Birincil antikor atın ve 5 min için 3 kez membran % 0,1 deterjan içeren engelleme çözüm ile yıkayın.</li>
		<li>Hazırlamak horseradish peroksidaz (HRP)-% 0.1 deterjan çözüm engelleme 1:10,000, eşlenik Anti-tavşan antikor. Membran ile sürekli ajitasyon RT, 1,5 saat için kuluçkaya.</li>
		<li>İkincil antikor atın ve membran PBS-T (% 0,1 deterjan ile desteklenmiş PBS) ile her 5 min için 5 kere yıkayın.</li>
		<li>Membran üreticinin yönergelerini izleyerek bir piyasada bulunan luminol Çözümle kuluçkaya. Kemiluminesan görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bitki malzeme işleme
<ol><li>Hasat vakum agroinfiltrated ∆87GAD65mut ifade kırmızı pancar ifade tepe (11 dpi) bırakır ve onları sıvı azot içinde dondurma.</li>
	<li>72 h-50 ° C ve 0,04 mbar için dondurulmuş yaprakları lyophilize. Onları-80 ° C'de depolayın</li>
	<li>Yapraklarını ince toz için eziyet ve nem dışlamak için silis jeli ile kapalı bir kapta RT saklayın.</li>
</ol>5. mide sindirim simülasyon ve hücre bütünlük analizi
<ol><li>Mide sindirim simülasyon<ol>
<li>Öğütülmüş kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg tartmak ve PBS (pH 7,4) 6 mL resuspend.</li>
		<li>Örnek pH 2 6 M HCl ile ayarlayın.</li>
		<li>4 mg/mL pepsin domuz Gastrik mukoza 10 mm HCl bir son pepsin konsantrasyonu 1 mg/mL veya 1:20 toplam çözünen proteinler için bir oranı elde etmek için ekleyin. 120 dk 37 ° C'de örnek sallamak.</li>
		<li>Örnekleri ile pepsin devre dışı bırakabilirsiniz için 1 M NaOH pH 8 için ayarlayın.</li>
		<li>750 µL aliquots 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de her örneğinin santrifüj kapasitesi Ayrı ayrı süpernatant toplamak ve Pelet arabellek yükleme bir süpernatant hacmindeki resuspend (1.5 M Tris HCl, pH 6.8, % 3 SDS, % 15 gliserol ve % 4 2-mercaptoethanol). Not: Sağlık ve güvenlik nedeniyle, eldiven ve numune hazırlama için duman başlık altında çalışmak.</li>
		<li>Süpernatant ve resuspended Pelet western blot analizi8tarafından analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre bütünlük analizi<ol>
<li>Öğütülmüş kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg iki örnek hazırlamak ve PBS (pH 7,4) 6 ml her ikisi de resuspend.</li>
		<li>Bir örnek yalnızca için 2 ile 6 M HCl. sallamak her iki örnekleri için 120 dk 37 ° C'de pH değeri ayarlayın.</li>
		<li>750 µL aliquots 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de her örneğinin santrifüj kapasitesi Ayrı ayrı süpernatant toplamak ve Pelet arabellek yükleme bir süpernatant hacmindeki resuspend.</li>
		<li>Süpernatant ve resuspended pelet tarafından western blot analizi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bioburden tahlil
<ol><li>Kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg tartın. 8 mL steril PBS (pH 7,4) ve 1 dk. için girdap toz resuspend.</li>
	<li>Antibiyotik veya (i) 50 µg/mL Rifampisin, (ii) 50 µg/mL, Rifampisin ve carbenicillin her, (iii) 50 µg/mL her sefaloridin ve Rifampisin veya (iv) 50 µg/mL her Rifampisin, carbenicillin ve sefaloridin içeren olmadan LB orta hazırlayın.</li>
	<li>Plaka her kurutulmuş yaprak homogenate birinde 5 seçmeli LB medya 1 mL.</li>
	<li>Tüm plakaları 28 ° C'de 3 gün kuluçkaya</li>
	<li>Her plaka üzerinde yetiştirilen Agrobacterium koloniler sayılır.</li>
	<li>Hesaplamak ve bakteriyel şarj kalıntısı koloni oluşturan birimler (CFU) sayı olarak kurutulmuş yaprak homogenate (CFU/mL) mL tanımlayın.</li>
</ol>7. metaboliti çıkarma
<ol><li>Birincil metaboliti çıkarma<ol>
<li>-80 ° C depolanan 30 mg tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 2 mL plastik tüp içinde.</li>
		<li>Soğuk 70/30 (v/v) metanol/kloroform ve girdap 750 µL 2 h için-20 ° C'de 30 s. Incubate ekleyin. Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.</li>
		<li>Soğuk su ve 10 dk. toplamak için 17,900 x g 4 ° C'de, santrifüj ve transfer 600 µL üst hydroalcoholic faz yeni 2 mL tüp içine ekleyin. Alt chloroformic faz ve Interphase atmak.</li>
		<li>Örnekleri çözücüler buharlaşır için bir vakum yoğunlaştırıcı 3 h için koymak.</li>
		<li>Adım 7.1.4 300 µL 50/50 (v/v) Asetonitril/su elde Pelet dağıtılması ve örnekleri 3 dk için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Çözümler 0,2 mikron membran filtreleri ile geçmek ve bir şeffaf sabit 300 µL Ekle cam tüpler içine koydu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İkincil metaboliti çıkarma<ol>
<li>300 mg-80 ° c depolanan tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 15 mL plastik tüp içinde.</li>
		<li>3 mL metanol, 30 için girdap ekleyin s ve 40 kHz 15dk için solüsyon içeren temizleyicide. Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.</li>
		<li>4500 x g 10 dk 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi ve supernatants yeni 15 mL tüpler içine aktarın.</li>
		<li>Seyreltik 100 µL 1:3 (v/v) su ile ayıklamak ve çözüm 0,2 mikron membran filtreden geçmek.</li>
		<li>Çözüm bir saydam sabit 300 µL Ekle cam tüp koymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Polar lipit çıkarma<ol>
<li>-80 ° c depolanan 200 mg tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 15 mL plastik tüp içinde.</li>
		<li>Su 200 µL ve sonra 2 mL metanol ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kalmasını sağlayın. Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.</li>
		<li>Girdap 30 s ve 40 kHz 15dk için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>4500 x g 25 dk. toplamak için 4 ° C'de, örnekleri ve transfer kloroform Faz 2 mL tüpler içine santrifüj kapasitesi. Üst hydroalcoholic faz ve Interphase atmak.</li>
		<li>Örnekleri çözücü buharlaşır için bir vakum yoğunlaştırıcı 3 h için koymak.</li>
		<li>Adım 7.3.5 600 µL metanol ile elde edilen Pelet geçiyoruz.</li>
		<li>Seyreltik 100 µL 1:5 (v/v) metanol ile ayıklamak ve çözüm 0,2 mikron membran filtreden geçmek.</li>
		<li>Çözüm bir saydam sabit 300 µL Ekle cam tüp koymak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi analiz ve veri işleme
<ol><li>LC-MS sistemi tedarikçi tarafından tavsiye edilen şekilde ayarlarsınız. Not: Bir sütunla C18 Muhafız (75 x 2.1 mm, parçacık boyutu 5 µm) önünde bir C18 sütun (150 x 2.1 mm, parçacık boyutu 3 µm) Sekonder metabolitler ve Kutup lipidler analizi için donatılmış HPLC ile birleştiğinde bir Otomatik Örnekleyici LC bölüm oluşur , oysa bir sütunla HILIC görevlisi (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) önünde HILIC bir sütun (150 x 2.1 mm, parçacık Boyut 2,7 µm). MS electrospray iyonlaşma (ESI) ya da bir atmosfer basıncı kimyasal iyonizasyon (APCI) kaynakları ile sağlanan bir iyon kapanı Kütle Spektrometre var.</li>
	<li>Uygun çözücüler HPLC degradeler için hazırlayın. Birincil metaboliti analizi için 20 mM amonyum formiat çözelti A olarak kullanın; % 95 Asetonitril, %5 su artı 10 mM amonyum formiat çözücü b olarak İkincil metaboliti analiz için su + %0,05 formik asit (A) ve Asetonitril + %0,05 formik asit (B) kullanın. Polar lipit analiz için su ile %0,05 formik asit (A) ve % 100 Asetonitril (B) kullanın. Not: Maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir.</li>
	<li>Metaboliti elüsyon için Tablo 1 ' de rapor degradeler kullanın. Akış oranı, 0.2 mL/dak enjekte 10 µL Sekonder metabolitler ve Kutup lipidler, her örneğinin ise küme için birincil metabolitleri 5 µL enjekte et.</li>
	<li>Kalite kontrol (QC) örnek eşit deneysel her koşul temsilcisi karışımı için farklı örnekleri bölümlerini karıştırarak hazırlayın. QC örnek enstrüman etkinliğini izlemek için deneme sırasında analiz. Özellikle, bir QC örnek analiz her 10 örnek toplu iş sonra ekleyin.</li>
	<li>Enstrüman tahrik etkilerinden korunmak için örnekleri rastgele.</li>
	<li>9 analizleri sonra temizleme yöntemi ve boş bir analiz bir sütun eklemek hemen sonra. Not: en güçlü çözücü yüksek bir yüzdesini, bir isocratic elüsyon ile iki çözücüler arasında yavaş bir degrade uygulayın. Boş bir saf metanol bir enjeksiyon oluşur: tutma zaman tekrarlanabilirlik aşağıdaki analizi geliştirmek için su (50/50, v/v).</li>
	<li>Tablo 2' de listelenen parametreleri kullanarak diğer pozitif ve negatif iyonlaşma modlarında kitle spectra almaya gerecini ayarlama. Not: Diğer parametreler belirli platform üzerinde bağlıdır.</li>
	<li>Sonraki veri işleme Dal Santo vd.9' da açıklandığı gibi gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+The+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li>
<li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li>
<li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases%3A+Where+are+we%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).</li>
<li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li>
<li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pediatric+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li>
<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li>
<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
<li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li>
<li>Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015).</li>
<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li>
<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada otoimmün şeker hastalığı için bir aday sözlü aşı tasarımı için ön analizler gösterdi. Bu deneme için hedef proteini insan 65 kDa Glutamat dekarboksilaz, hangi üretim ve işlevselliği kolayca ortaya ve ölçülebilir12olduğunu mutasyona uğramış biçimiydi. Onun ifade farklı Yenilebilir bitki dokularında vektörel çizimler tarafından5, hangi rekombinant protein üretim çok kısa bir süre içinde yüksek düzeyde aracılık aracılı. Kırmızı pancar eGFP ifadede yenilebilir ana ...

Bitki moleküler biyoloji devriminden bu yana 1980'li yıllarda, bitki tabanlı sistemler Biyofarmasötikler üretimi için alternatif mikrobiyal ve memeli hücreleri1üzerinde esaslı geleneksel sistem olarak kabul edilebilir. Bitkiler geleneksel platformlar, çeşitli avantajlar ölçeklenebilirlik, maliyet-etkililik ve en alakalı2güvenlik ile görüntüler. Rekombinant ürün dönüştürülmüş bitki dokudan saflaştırılmış ve sonra yönetilen, ya parenterally ya da sözlü olarak ve ayrıca, dönüştürülmüş Yenilebilir bitki doğrudan oral teslimat için kullanılabilir. Sözlü rota aynı anda Mukozal ve sistemik bağışıklık teşvik ve iğneler ve uzman sağlık personeli için gereksinimini ortadan kaldırır. Ayrıca, oral teslimat normalde rekombinant protein3Toplam üretim maliyetinin % 80'i hesapları karmaşık aşağı akım işleme ortadan kaldırır. Bütün bu avantajları tasarruf üretim, malzeme ve ilaç dünya nüfusunun çoğu için uygun hale her doz maliyetlerini azaltarak emek doğru tercüme edilebilir.
Çeşitli stratejiler, hem istikrarlı dönüşümü ve geçici ifade, bitkilerde rekombinant proteinlerin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar arasında yüksek verimli deconstructed bitki virüs temel ifade sistemi (örneğin, magnICON) rekombinant proteinlerin yüksek verim nispeten kısa zaman çizelgelerine4üzerinde önde gelen üstün performans sağlar. Geçici ifade Nicotiana benthamiana bitkilerde bitki virüs temel ifade sistemi kullanarak pek çok örnek, altın standart üretim ev sahibi olmak raporlanır. Ancak, bu model bitki alkoloidler ve yaprakları içinde birikmiş olan diğer toksik metabolitleri nedeniyle yenilebilir bir tür olarak kabul edilmez.
Bu çalışmada, biz iki Yenilebilir bitki sistemi, kırmızı pancar arasında karşılaştırma tarif (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (Spinacea oleracea cv Industria), 65 kDa izoformu glutamik asit iki aday türde bir ifade için bitki virüs tabanlı tarafından yürütülen dekarboksilaz (GAD65),5Vektörler. GAD65 tip 1 diyabet (T1D) ilişkili bir büyük autoantigen ve bu şu anda önlemek veya T1D tolerans6inducing tarafından gecikme insan klinik çalışmalarda soruşturma altında. GAD65 üretim tesislerinde kapsamlı modeli bitki türleri içinde tütün ve i. benthamiana4,5,6,7çalışılmıştır. Burada, biz doğrudan sözlü teslim için demek dokularda molekül üretimi için Yenilebilir bitki türlerinin nasıl kullanılacağını açıklar. --Dan teknik görüş, okudu ve bitki agroinfiltration için sistemi ve Yenilebilir bitki platformu GAD65 üretim için farklı parametreler değerlendirilerek seçilen: rekombinant protein ifade seviyeleri, bitki mikrobiyal şarj kalıntısı doku'sözlü dır, GAD65 mide sindirim için direnç ve vahşi türü ile dönüştürülmüş bitkilerin bioequivalence demek istedim.

<table><tbody><tr><td>0.2-&mu; m Minisart RC4 membran filtreler</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Toksik; Gliserol, SDS ve Tris-HCl ile yükleme tamponu yapmak için% 4</td></tr><tr><td>4-Morfolineetansülfonik asit (MES)</td> <td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>Korozif</td></tr><tr><td>Asetonitril LC-MS sınıfı</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Asetosiringon</td><td>Sigma</td><td>D134406 Maya özütü</td>, NaCl ve Tripton ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için DMSO Agar Bakteriyolojik Sınıf Aplikit A0949'da <td>0.1 M stok &ndash</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>; 15 g / L</td></tr><tr><td>Amonyum format</td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP antikoru</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD 65/67 antikoru</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LHCB2 antikoru</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Mavi R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18</td><td>Kolon Zarafeti</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &mu; m) Kolon</td></tr><tr><td>C18 Koruma Kolonu Grace</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 &mu; m) Muhafız&nbsp; Sütun</td></tr><tr><td>CalMag Yetiştirici</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>Gübre</td></tr><tr><td>Karbenisilin disodyum</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Kemilüminesans görüntüleme sistemi</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Dokunmatik Görüntüleme Sistemi</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Deterjan</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td>Polisorbat 20</td></tr><tr><td>Floresan okuyucu</td><td>Perkin-Elmer</td><td>&nbsp; 1420-011</td><td>VICTOR Çok Etiketli Sayaç</td></tr><tr><td>Formik asit LC-MS sınıfı</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Tris-HCl, SDS ve 2&ndash ile yükleme tamponu yapmak için% 15; merkaptoetanol</td></tr><tr><td>GoTaq G2 polimeraz</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Aşındırıcı</td></tr><tr><td>HILIC Kolonu</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; parçacık boyutu 2,7 &mu; m) Sütun</td></tr><tr><td>HILIC Koruma Sütunu</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Görüş HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 &mu; m) Muhafız&nbsp; Sütun</td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge anti-tavşan antikoru</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Çok fazla dondurmayın / çözmeyin</td></tr><tr>,<td>HPLC Otomatik Örnekleyici</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>System Gold 508 Otomatik Numune Alma Cihazı</td></tr><tr><td>HPLC Sistemi</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>System Gold 128 Solvent Modülü HPLC</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>NaCl, Na2HPO4 ve KH2PO4 yapmak için</td></tr><tr><td>2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2.4 g/L, NaCl ile NaCl, Na2HPO4 ve KCl ile PBS</td></tr><tr><td>Yükleme Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminol çözeltisi</td><td>Ge Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>ECL Prime Western Blotting System ticari kitini kullanarak çözeltiyi hazırlayın</td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>Kütle Spektometresi</td><td>Bruker Daltonik</td><td>&nbsp; -</td><td>Bruker Esquire 6000; kütle spektrometresi bir ESI kaynağı ile donatılmıştı ve analizör bir iyon tuzağıydı</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Süt engelleme solüsyonu</td><td>Ristora</td><td>&nbsp; &nbsp; PBS Na</td><td></td></tr><tr><td>2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907'de</td> -%3 <td>Sodyum Fosfat tamponu yapmak için NaH2PO4</td></tr> ile kullanın <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>PBS yapmak için KCl, Na2HPO4 ve KH2PO4 ile 80 g/L; Maya özü ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için 10 g / L, Tripton ve Agar Bakteriyolojik Sınıf</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp; Sodyum Fosfat tamponu yapmak için Na2HPO4 ile kullanın; PBS NaOH yapmak için 14,4 g / L</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselülaz membran</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Domuz mide mukozasından Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz substratı ECL</td><td>GE Sağlık</td><td>RPN2235</td><td>Işığa duyarlı malzeme</td></tr><tr><td>Pompa Vakum Pres</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>BCA çalışma çözeltisini hazırlamak için bu reaktifin 50 parçasını 1 parça reaktif B ile kullanın</td></tr><tr><td>Reaktif B</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>BCA çalışma solüsyonunu hazırlamak için bu reaktifin 1 kısmını 50 parça reaktif A ile kullanın</td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td> DMSO SDS (Sodyum dodesil sülfat) Sigma L3771'de <td>toksik &ndash; 25 mg / mL stok</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Yanıcı, toksik, aşındırıcı-% 10 stok; Tris-HCl, Gliserol ve 2&ndash ile yükleme tamponu yapmak için% 3; merkaptoetanol</td></tr><tr><td>Sodyum metabisülfit</td><td>Sigma</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator sistemi</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&reg; 2200 MH; frekans 40 khz</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Terumo</td> <td>& nbsp; &nbsp; -</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf sabit 300-&mikro; L cam tüpleri yerleştirin</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tris-HCl tamponu yapmak için pH'ı 1N HCl ile ayarlayın, SDS, Gliserol ve 2&ndash ile yükleme tamponu yapmak için 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) kullanın; merkaptoetanol</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>10 g / L, Maya özütü, NaCl ve Agar ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için Bakteriyolojik Sınıf</td></tr><tr><td>Vakum yoğunlaştırıcı</td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Speed-vac Sistem</td></tr><tr><td>Suyu LC-MS sınıfı</td><td>Sigma</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td>Tripton, NaCl ve Agar Bakteriyolojik Sınıf ile LB ortamı (NaOH ile pH 7.5) yapmak için 5 g / L</td></tr></tbody></table>

kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Bitki moleküler tarım bitkiler ilgi molekülleri üretmek için kullanılır. Bu açıdan, bitkiler hem Biyoreaktörler olarak üretim ve nihai ürünün sonraki arıtma ve kapaklı proteinlerin doğrudan oral teslimat için Yenilebilir bitki türü kullanılırken kullanılabilir. Bu çalışmada, Yenilebilir bitki sistemleri ile vakum infiltrasyon teslim deconstructed bitki virüs tabanlı rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak tip 1 diyabet (T1D) karşı bir aday sözlü aşı geliştirilmesi mevcut. Sonuçlarımız kırmızı pancar T1D aşı olarak umut verici bir aday olarak kabul T1D, ilişkili bir insan türetilmiş autoantigen geçici bir ifade için uygun bir ev sahibi olduğunu gösteriyor. Autoantigen üreten yaprakları iyice mide sindirim için onların direnci, bakteriyel şarj kalıntısı varlığı ve ikincil metabolik profilleri, işlem üretim potansiyelini kullanmak için genel bir bakış vermek için karakterize bitkilerin kapaklı bir protein doğrudan oral teslimat için. Bizim analiz neredeyse tam bir kapsülleme strateji bitki kaynaklı GAD aşı üretiminde gerekli olduğunu düşündüren bir simüle mide sindirim takip dondurularak aday sözlü aşı düşüşü gösterdi.

Bu çalışmada, Yenilebilir bitki dokularında sözlü bir aşı geliştirilmesi için iş akışı gösterilmektedir. Bu eser bir yenilebilir ana bitki türü bir hedef proteinin ifade ve potansiyel sözlü aşı karakterizasyonu odaklanmıştır.
İlk adım rekombinant proteinler Yenilebilir bitki sistemlerinde üretmek için bitki virüs temel ifade teknoloji uygunluğunun değerlendirilmesi söz konusu. Bu amaç için ilk eGFP bir modeli protein kullandığım...

Burada, bir sözlü aşı adayı karşı tip 1 diyabet bir yenilebilir bitki üretmek için bir protokol mevcut.

Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Bitkilerde rekombinant protein üretimi için farklı stratejiler arasında, deconstructed bitki tabanlı VERS ifadesi üstün performans sağlar, göreceli bir kısa zaman dilimi içinde yüksek verim yol. Bir oral aşı üretimi için bu teknolojinin çoğaltılması yakın gelecekte konvansiyonel aşılar için bir alternatif olmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Lyophilized kırmızı pancar geçici olarak dönüştürülmüş yaprakları tip bir diyabet önleme oral tolerans indüksiyon için uygun fotoğraf antijenleri bir miktar birikir.Bu deneysel protokol, rekombinant protein birikiminin tek tek değerlendirilmesine göre birçok farklı yenilebilir türe genişletilebilir. Prosedürü gösteren Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo ve Roberta Zampieri olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi bir büyüme odasında kırmızı pancar ve ıspanak bitkileri büyümek.Tohum çimlenme sonra, litre başına bir gram konsantrasyonda ticari olarak kullanılabilir gübre bir çözüm ile haftada iki kez bitkileri döllemek. Tarımsal filtrasyon için, beş haftalık ıspanak ve altı haftalık kırmızı pancar bitkileri kullanın. Bitki ekspresyonu vektörlerini yaptıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi mililitre başına 50 mikrogram ve vektöre özgü antibiyotikler içeren 50 mililitre LB ortamına ait üç A.tumefaciens transformantını aşılamak.28 santigrat derece bir gecede sallayarak büyüyün. Ertesi gün, 20 dakika boyunca 4500 kez G santrifüj ederek bakteri kültürleri pelet. 10 milimolar MES ve 10 milimolar magnezyum sülfat içeren 100 mililitre infiltrasyon tamponunda peleti yeniden askıya alın.Süspansiyonları oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın. Burada gösterilen modüllerden birini içeren bakteriyel süspansiyonun eşit hacmini beş asal modül ve integrase modülüile karıştırın. İğnesiz bir şırınga kullanarak, süspansiyon karışımı beş mililitre çıkarmak.Şırınganın ucunu bitki yaprağının alt tarafına bastırırken yaprağın diğer tarafına hafifçe karşı basınç uygulayın. Her bitki için, tepe başlayarak, ilk üç tamamen genişletilmiş yaprakları, sızın. Tarıma sızmış yaprakları yaprak sapındaki kağıt etiketiyle etiketleyin.Daha sonra standart koşullar altında büyüme odasına bitkiler dönün. Enfeksiyon sonrası 4 ila 14 gün içinde, tarıma sızmış yaprakları toplayın ve sıvı nitrojenle dondurun. Bu bitki dokusunu eksi 80 derecede saklayın.İlk olarak, ayrı ayrı mililitre başına 50 mikrolitre konsantrasyonda rifampisin içeren LB orta 50 mililitre üç A.tumefaciens transformantlar büyümek, ve uygun vektöre özgü antibiyotikler 28 santigrat derece gecede sallayarak. Ertesi gün, 20 dakika boyunca 4500 kez G santrifüj ederek bakteri kültürleri pelet. Peletin 1 litrelik infiltrasyon tamponundan 0,35'lik bir OD600'e geri uzaklaştırın ve süspansiyonları oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra her süspansiyona deterjanın %0,01'ini ekleyin. Burada gösterilen modüllerden birini içeren bakteriyel süspansiyonun eşit hacmini beş asal modül ve integrase modülüile karıştırın. Tutucuiçine bir altı haftalık kırmızı pancar bitkisi yerleştirin.Tutucuyu ters çevirin ve sızma süspansiyon yaprakları batırmak için bir sızma banyosu iki litre içeren bir kabın üstüne yerleştirin. Bundan sonra, batık bitki ile infiltrasyon banyo susızma odasına aktarın ve kapatın. Vakum pompasını açın ve sızma odasındaki vakum alım valfini açın.Odadaki basınç 90 milibara düştükten sonra vakumu üç dakika koruyun. Sonra vakum 45 saniye bırakın. Oda atmosfer basıncına geri döndüğünde, odayı açın ve sızan bitkiyi bakteri banyosundan çıkarın.Bitkiyi büyüme odasına geri getirin. Maksimum ifade gününde, sızmış yaprakları hasat ve daha önce açıklandığı gibi sıvı nitrojen onları dondurmak. İlk olarak, vakum agroinfiltrated delta hasat 87 GAD65mut ifade zirvesinde kırmızı pancar yaprakları ifade, ve sıvı azot onları dondurmak.Donmuş yaprakları eksi 50 santigrat derecede ve 0.04 milibar'da 72 saat boyunca lyophilize edin. Sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunda, ince bir toz yaprakları eziyet ve nem hariç silika jel ile kapalı bir kapta oda sıcaklığında saklamak.Mide sindirim simülasyonu için, ince zemin dondurma kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 miligram tartmak ve PBS altı mililitre resuspend. Örnek pH'ı ikiye ayarlamak için altı azı kaşığı hidroklorik asit kullanın. Domuz mide mukozasından mililitre pepsin başına dört miligram ekleyin, ve 10 milimolar hidroklorik asit, mililitre başına bir miligram son pepsin konsantrasyonu elde etmek için.Örneği 37 derecede 120 dakika sallayın. Daha sonra, numune pH'ını sekize ayarlamak ve pepsin'i inaktive etmek için sodyum hidroksit kullanın. Her numunenin 750 mikrolitre aliquot'ünü mikrosantrifüj tüplere aktarın ve 20, 000 kez G ve 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca aliquotları santrifüj edin.Her supernatant'ı ayrı ayrı toplayın ve her peleti bir süpernatant yükleme arabelleği hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra batı leke analizi ile hem supernatant hem de resuspended pelet analiz edin. Hücre bütünlüğü analizi için, ince zemin dondurulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 miligram iki örnek hazırlamak ve PBS altı mililitre hem de resuspend.Bir numunenin pH'ını ikiye ayarlamak için altı azı kaşığı hidroklorik asit kullanın. Her iki numuneyi de 37 derecede 120 dakika sallayın. Sonra microcentrifuge tüpler için her örnek 750 mikrolitre aliquot.20, 000 kez G ve 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj. Her supernatant'ı ayrı ayrı toplayın ve her peleti bir süpernatant yükleme arabelleği hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra batı leke analizi ile hem supernatant hem de resuspended pelet analiz edin.İlk olarak, ince zemin dondurulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 miligram tartın ve steril PBS sekiz mililitre yeniden askıya. Bir dakikalığına girdap. Hazırlanan beş seçici LB medyadan birinde, dondurulmuş kurutulmuş yaprağın bir mililitresini homojen olarak yerleştirin.Plakaları 28 derecede üç gün kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her plaka üzerinde yetiştirilen agrobacterium kolonileri saymak ve dondurulmuş kurutulmuş yaprak homojen mililitre başına koloni oluşturan birimlerin sayısı olarak artık bakteri yükü hesaplamak. Bu çalışmada yenilebilir bitki dokusunda oral aşı geliştirilmiştir.Kırmızı pancar ve ıspanak bitkileri el ile EGFP rekombinant ekspresyon vektörleri taşıyan A.tumefaciens süspansiyonlar ile tarıma sızmış ve floresan protein ekspresyonu Batı leke analizi ile görselleştirilmiş ve UV ışığı altında ölçülür. Kırmızı pancar sistemi daha yüksek bir EGFP ekspresyonu ile karakterizedir, dokuz gün sonrası enfeksiyon taze yaprak ağırlığı gram başına yaklaşık 544 mikrogram ulaşan, ıspanak sadece 11 gün sonrası taze yaprak ağırlığı gram başına yaklaşık 113,4 mikrogram maksimum seviyeye ulaştı. Bu nedenle, kırmızı pancar sonraki tüm deneyler için ifade ana bilgisayar olarak seçilir.Bitkiler daha sonra vakum bir A.tumefaciens süspansiyon ile sızmış. Agroinfiltrasyon yapraklarından TSP ekstraksiyonundan sonra, numuneler Batı lekeleri ile analiz edilir ve rekombinant protein densitometri analizi ile nispeten ölçülür. Son olarak, potansiyel bir oral aşı gelişimi için parametreler değerlendirilir.Burada görüldüğü gibi, hedef proteinliyofilizizasyon işleminden sonra stabil olarak görülmektedir. Mide sindirimi, dondurma da kurutulmuş maddeye domuz mide enzimi pepsin ekleyerek simüle edilir, ya mililitre başına bir miligram nihai konsantrasyon, ya da bir-20 oranı, TSP. Her iki sindirim tedavi koşulları rekombinant protein bozulmasıile sonuçlanır.Pepsin sindirimi nden sonra pelet örneklerinde belirli bir sinyalin bulunmaması, dondurulduktan-kuruduktan sonra bitki hücrelerinin bütünlüğünü kaybettiğini ve bunun da hedef protein yıkımına yol açtığını göstermektedir. Bu prosedür, vakum infiltrasyonu açısından bitki türlerine ve zaman ders analiziaçısından hedef rekombinant proteine dikkatle uyarlanmalıdır. Gösterme prosedürü aynı zamanda aşı ve antikorlar gibi oral doğum için tasarlanmış biyofarmasötik üretimi için de kullanılabilir.

transient-expression-red-beet-biopharmaceutical-candidate-vaccine-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Biz adacık antigen spesifik primer CD4 + T-hücrelerinin adoptif transfer yoluyla, iki hafta içinde farenin tip 1 diyabet (tip 1 diyabetin) ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Keşfedin, kırmızı pancar yapraklarında geçici dönüşümle tip 1 diyabet için oral aşı adayı üretimini. Bu bitki bazlı yöntem, rekombinant protein elde ederek ağız yoluyla tolerans indüksiyonu sağlar.

Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için

Daha fazla video keşfet