Name: İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Keşfedin insan perivasküler yağ dokusundan çok potansiyelli öncü hücrelerin izolasyonu ve kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle karşılaştırılması. Bu yöntem kardiyovasküler hastalıklarda rejeneratif tıp uygulamaları için kritik içgörüler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tedarik klinik doku ve histopatoloji ve Histomorfometri (1P20GM121301, L. Liaw PI desteklenen) özünde Maine Tıp Merkezi araştırma ile yardım için Maine Tıp Merkezi araştırma navigasyon yardım kabul Enstitüsü kesit ve boyama için. Bu eser NIH tarafından desteklenen R01 HL141149 vermek (L. Liaw).

Bu çalışma içinde insan doku kullanımı değerlendirilir ve kurumsal inceleme kurulu, Maine Tıp Merkezi tarafından onaylanmış ve tüm personel deneme önce uygun eğitim aldı.
1. hazırlıkları
<ol><li>Ayrılma tampon yapmak 50 mg başlamaktan tarafından hayvan-alerjik collagenase/dispase karışım ben çözüm 1 mL nanopure H2O. hazırla 1 mg/mL çalışma çözeltisi ile yüksek glikoz % 1 w/v-BSA Sulandırılan collagenase içeren DMEM 49 mL ekleyerek / dispase çözüm. 5 mL çalışma aliquots-20 ° C ve kullanmak için bir su banyosu önceden kullanarak 37 ° c sıcak saklayın.</li>
	<li>HBSS için 49 mL 1 mL (son konsantrasyonu 200 adet/mL penisilin, 200 adet/mL streptomisin ve 0,5 µg/mL fungizone) 100 x antibiyotik/antimycotic çözüm ekleyerek antibiyotik çözüm alın ve buza saklayın.</li>
	<li>Jelatin çözüm (% 0,2 w/v) 200 mg jelatin nanopure H2O. otoklav 20 dk üçün 100 ml sığır deriden çözülerek hazırlamak ve 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>500 mL PVAT büyüme ortamının hazırlamak: yüksek glikoz DMEM/F12 glutamin takviyesi, sodyum pyruvate ve sodyum bikarbonat, %10 FBS ve 100 µg/mL antimikrobiyal ajan ile (bkz: Malzemeler tablo).</li>
	<li>50 mL Adipojenik indüksiyon ortam hazırlamak: 40,8 mL yüksek glikoz 7.5 mL PVAT büyüme medya, 100 (son toplama 100 adet/mL penisilin, 100 adet/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL fungizone) antibiyotik/antimycotic çözüm, x 500 µL ile takıma DMEM, 0,5 mM IBMX (500 mM stok 0.1 M NaOH), 1 µM deksametazon (etanol hisse senedi 1 mM), 5 µM rosiglitazone (DMSO hisse senedi 5 mM), 33 µM biotin (DMSO hisse senedi 66 mM), 100 nM insülin (200 µM hisse senedi % 0,1 Asetik asit) ve 20 µM pantotenik asit (100 mM hisse senedi H2 O).</li>
	<li>Denetim indüksiyon Medya 50 mL Adipojenik lineage için hazırlamak: 40,8 mL yüksek glikoz DMEM 7.5 mL PVAT büyüme medya ve kalem-strep (100 x hisse senedi) 500 µL ile desteklenmiştir.</li>
	<li>50 mL Adipojenik bakım ortam hazırlamak: 41,5 mL yüksek glikoz DMEM takıma 7.5 mL PVAT büyüme ortamdan adım 1.3, 500 µL kalem-strep (100 x hisse senedi), 1 µM deksametazon (alkol hisse senedi 1 mM), 33 µM biotin (66 mM DMSO içinde hisse senedi), 100 nM insülin (200 µM stok %0,1 ac ETIC asit) ve 20 µM pantotenik asit (H2O hisse senedi 100 mM).</li>
	<li>Büyüme ortamının 500 mL hazırlamak için Osteojenik ve chondrogenic soy: % 10 ile desteklenmiş yüksek glikoz αMEM FBS, 1 x glutamine ek (bkz. Tablo reçetesi) ve 5 mL kalem-strep (100 x hisse senedi).</li>
	<li>İndüksiyon Medya 50 mL Osteojenik lineage için hazırlamak: 10 nM deksametazon ve 10 mM β-gliserofosfat ile kemik iliği MSC büyüme ortamının 50 mL.</li>
	<li>İndüksiyon Medya 50 mL chondrogenic lineage için hazırlamak: 100 nM deksametazon, 50 µg/mL sodyum askorbat-2-fosfat ve 10 ng/mL TGFβ1 ile kemik iliği MSC büyüme ortamının 50 mL. Osteojenik ve chondrogenic koşulları için Bazal kemik iliği MSC büyüme medya indüksiyon medya olarak görev yapacak.</li>
</ol>2. iletişim kuralı 1: Kültür insan PVAT hücrelerden Stromal vasküler kesir
Not: PVAT imzalat Hastalarda Koroner arter bypass greft yordamlar geçiren artan aort greft anastomoz yapmama sitesinden rezeke. Aort PVAT bir 15 mL konik içeren 10 mL buz soğuk yüksek glikoz DMEM F12 yerleştirilir ve laboratuvar rezeksiyon 2 h içinde ameliyathane aktarılır. Aort PVAT yan yol yordam sırasında atılan dokudur ve insan olmayan konularda araştırma Maine Tıp Merkezi'nın iç inceleme Kurulu tarafından kabul edilmiş.
<ol><li>Bu insan PVAT (yaklaşık 3 x 1 x 0.5 cm3) ~ 500 mg parçası için iletişim kuralıdır. Taze insan PVAT DMEM bir 50 mL konik tüp antibiyotik 25 mL solüsyon içeren aktarın. 4 ° C'de 20 dk için sallanan ile kuluçkaya PVAT antibiyotik çözüm olsa da, bir aliquot ayrılma arabelleği 37 ° C'de erimek</li>
	<li>Çözeltinin 100 x antibiyotik/antimycotic 50 µL 5 mL ayrılma arabelleğe eklemek ve 0,22 µm şırınga filtre sterilize. 1 mL jelatin çözeltisi için 24-şey plaka de 1 ekleyin. Bir laminar akış başlık, steril forseps ve makas PVAT antibiyotik çözüm için steril Petri kabına aktarmak için kullanın. Önceden ısıtılmış ayrılma arabellek 1 mL için doku ekleyin ve ince bir bulamaç (no adet ~ 2 x 2 mm2' den daha büyük) içine tüm doku kıyma steril forseps ve diseksiyon makası kullanarak.</li>
	<li>1 mL Bulamaç 4 mL ayrılma arabelleğe aktarmak ve 1 h için bir Önceden ısıtılmış 37 ° C orbital shaker-200 devirde kendi tarafında tüp kuluçkaya. 1 h sonra hiçbir görünür doku parçaları mevcut olacak ve çözüm bulutlu hücre süspansiyon görünür.</li>
	<li>50 mL konik tüp ayarla 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla çözüm filtre. Süzgeç mümkün olduğunca çok sayıda hücre yakalamak için bir ek 10 mL antibiyotik çözüm ile yıkayın. Süzgeç sıkmak değil.</li>
	<li>300 x g sallanan bir kova santrifüj, 12 dk için hücreleri cips. Not: Santrifüjü sonra tüp adipositler, bir interfaz ve bir Pelet yağlı bir üst tabaka ayrılacaktır. Pelet stromal vasküler kesir endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, kan hücreleri ve progenitör hücreler içeren olduğunu.</li>
	<li>Pelet, HBSS ve santrifüj 300 x gde 5 min için 10 ml resuspend. Toplam HBSS içinde 2 yıkama için bu adımı yineleyin. Son yıkama sonra kırmızı kan hücreleri parçalayıcı değil. Çeşitli ticari olarak kullanılabilir arabellek ve kuluçka süreleri ile tekrarlanan denemelerden progenitör hücre bağlanma ve canlılığı işaretli indirimleri açmıştır.</li>
	<li>24-şey plaka jelatin Aspire edin. Yavaşça de 1 x ilişkisiz jelatin kaldırmak için HBSS ile yıkayın.</li>
	<li>Büyüme medya ve tohum jelatin kaplı üzerine 1 ml stromal vasküler kesir Pelet olduğu gibi kırmızı kan hücreleri ile resuspend de. İnsan FGF2 (% 0,01 BSA w/v ile desteklenmiş PBS resuspended) 25 ng/mL kültür ortamında son bir konsantrasyon ekleyin. %5 CO237 ° C'de 24 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, Kaldır büyüme medya ve yıkama kuyuları ile kırmızı kan hücreleri ve ölü hücreleri kaldırmak için HBSS 5 x. 1 mL 25 ng/mL ile FGF2 takıma taze büyüme ortamının ekleyin.</li>
	<li>Medya her 48 h, 25 ng/mL ile ek olarak emin değiştirmek taze FGF2 her zaman.</li>
	<li>
Hücreleri genellikle 7-10 gün sonra explant % 100 izdiham ulaşmak; sonra geçiş hücreleri:
	<ol>
<li>Büyüme medya ve yıkama monolayer 2 Aspire x 1 ml HBSS. Tüm HBSS kuyulardan Aspire edin ve hücre ayrılma çözümü birkaç damla ekleyin.</li>
		<li>Dokunun ve plaka birkaç kez girdap ve % 5 CO2 hücreleri kaldırmak 5-7 dk 37 ° C'de kuluçkaya. ~ 1 mL taze kültür ortamının müstakil hücrelere ekleme ve bir 24-şey plaka, içeren her 500 µL büyüme medya ve 25 2 kuyu için 500 µL dağıtmak ng FGF2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceki adımda gösterildiği gibi insan PVAT elde edilen hücreleri genişletmeye devam ediyoruz. Her geçiş 1:2 bölme büyük olmalıdır. Hücreleri 5 – 7 kez farklılaşma deneyleri için tahsis etme önce pasajlı.</li>
</ol>3. Protokolü 2: Kültür insan kemik iliği MSC kolonileri
Not: İnsan kemik iliği MSC açıklanan8 olarak izole ve erken geçiş hisse senetleri donmuş olarak depolanan sıvı N2' medya (% 70 FBS % 20 Bazal DMEM ve % 10 DMSO) ~ 100.000 hücre/mL, dondur.
<ol><li>Hızla MSC büyüme ortamının 3 mL içeren 6-şey kültür plaka bir de kemik iliği MSC 37 ° C su banyosu ve plaka sıvı N2 şişe çözülme ve gecede 37 ° C ve %5 CO2kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, MSC kültür medya Aspire edin ve hücreleri 3 yıkama x 2 ml HBSS. % 100 izdiham, büyüme medya Aspire edin ve hücreleri 3 yıkama x 2 ml HBSS. 500 µL/iyi hücre dekolmanı çözümü ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2 5 dk. tüm hücreler sağlamak için plaka yerinden dokunun için kuluçkaya ve 2 mL MSC büyüme ortamı içeren bir 6-şey plaka 2 kuyu içindekilere eşit olarak dağıtabilmenizi.</li>
	<li>İnsan kemik iliği ve PVAT elde edilen MSC paralel yaklaşık 5-7 pasajlar için veya test etmek için yeterli miktarda elde kadar genişletin.</li>
</ol>4. Protokolü 3: Plaka ve Adipojenik ve Osteojenik, ve Chondrogenic soy
<ol><li>Plaka uygun sayıda kemik iliği ve PVAT elde edilen hücre başına 12-şey plaka ve uygun deneysel her koşul için çoğaltır. Adipojenik ve Osteojenik koşulları, ~ 200, 000-225.000 hücreler/iyi, chondrogenic koşulları için 150.000-175.000 hücreler/iyi ihtiyaç vardır ihtiyaç vardır. Not: N en az koştu 3 Çoğalt kuyular için denetim = ve toplam 2 bağımsız çalışan için koşullar her deneysel lineage için indüklenen (N = 6 çoğaltır toplam).</li>
	<li>PVAT progenitör hücre nüfus ve hücre dekolmanı çözümü ve kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 de 5 dk. havuzu nüfus ayrı 15 mL konik tüpleri içine kullanan insan kemik iliği MSC kesimin hücrelerden ilişkilendirmelerini kaldırın. Spin aşağı flakon 500 x g hücreleri cips için 7 dakika için de. 1 mL PBS resuspend ve bir hemasitometre cep numarasını tahmin etmek için kullanın.</li>
	<li>12-iyi yemekler hücrelerde 4.1 adımda gösterildiği gibi plaka. Sigara kaynaklı durum daha önceki bir zaman noktasına kültür indüklenen durumunun devam aksatmadan sabit olabilir böylece ayrı yemekleri indüklenen ve sigara kaynaklı Adipojenik ve Osteojenik ve koşullar için sağlar.</li>
	<li>Adipojenik ve Osteojenik indüksiyon medya 1,5 mL indüklenen koşul her şey için ekleyin. Adipojenik ve Osteojenik indüksiyon medya 1,5 mL sigara kaynaklı koşul her şey için ekleyin. Adipojenik ve Osteojenik indüklenen ve sigara kaynaklı hücre popülasyonlarının 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka başlar.</li>
	<li>Spin aşağı kalan hacmi insan PVAT progenitor hücreler ve insan kemik iliği MSCs 500 x gde 7 dk için.</li>
	<li>Kalan kemik iliği ve PVAT elde edilen hücre topakları 100.000 hücreler/10 µL (106 hücre/mL) yoğunluğu elde etmek için resuspend için gerekli birim belirlemek. Granül MSC büyüme medya chondrogenic lineage indüksiyon için hesaplanan hacmi resuspend. Yavaşça hücreleri homojen bir dağılım sağlamak için bir damlalıklı kullanarak yukarı ve aşağı hareket.</li>
	<li>10 µL damlacık konsantre hücre çözümün bir micromass 100.000 hücre oluşturmak için her şey ortasına pipette. 1 mL steril H2O buharlaşma önlemek için bitişik kuyuda yerleştirin. Micromass izin vermek için 37 ° C ve % 5 CO2 2 h micromass kültürler kuluçkaya toplamak için.</li>
	<li>2 saat sonra dikkatli bir şekilde 10 ng/mL ile çivili chondrogenic farklılaşma medya ekleyin her indüklenen-koşul Wells insan TGFβ1. Dikkatle indüksiyon medya (kemik iliği MSC büyüme medya) 1,5 mL sigara kaynaklı koşulu wells için ekleyin. Böylece sigara kaynaklı durum-ebilmek saptanmak daha önceki bir zaman noktasına ayrı 12-şey levhalar için indüklenen ve sigara kaynaklı koşullar kullanıyorsunuz.</li>
</ol>5. Protokolü 4: Kültür Adipojenik, Osteojenik ve 14 gün boyunca Chondrogenic soy
<ol><li>Medya 2 günde yenileme 37 ° C ve % 5 CO2, 4 gün için tüm üç soy indüklenen ve sigara kaynaklı şartlarına kültür. 4 günde bakım medyaya tahlil geri kalanı için indüksiyon medyadan indüklenen Adipojenik lineage koşulu değiştirin.</li>
	<li>Sigara kaynaklı koşulların tümü % 10 formalin 12 h. formalin atmayın için fix ve yıkama tüm sabit PBS formalin bütün izlerini kaldırmak için 2 x kuyuları. Tabak PBS içinde işleme kadar 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>14 gün medya her 2 gün yenileniyor, indüklenen şartları toplam kültür. Taze TGFβ1 10 ng/mL son konsantrasyonu chondrogenic indüksiyon medya her yenileme ile ekleyin. Adipojenik lineage Adipojenik bakım medya ve Osteojenik lineage indüksiyon medya, 2 günde bir yenileme kültür devam ediyor. 14 gün 12 saat için tüm bağlı koşullar boyama için % 10 formalin fix.</li>
	<li>Gırç veya micromass bağlı chondrogenic durumda katıştırma için bir kaset içine dökün. Micromass giderek yoğun alkol hamamlar % 70, sonra %80, % 95'i, iki kez ve iki kez daha mutlak alkol başlayarak 5 min için bir dizi kurutmak. Bir dealcoholization Ajan kaset yerleştirin ve sonra nihayet parafin kesit ve boyama için kaset embed.</li>
</ol>6. iletişim kuralı 5: Adipojenik koşulu ile petrol boyama kırmızı O
<ol><li>Yağ kırmızı O hisse senedi çözüm petrol kırmızı O 350 mg 100 ml % 100 isopropanol çözülerek hazırlayın. 2s için 0.2 µm filtreden bir heyecan bar ve vakum ile karıştırın. Hisse senedi çözüm içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında için 1 yıl muhafaza edilebilir.</li>
	<li>Yağ kırmızı O hisse senedi çözüm 2 parça diH20 (örneğin 60 mL stok çözeltisi 40 mL diH20) 3 parça karıştırılarak çözüm çalışma hazırlamak. Son petrol kırmızı O çalışma çözüm 2.1 mg/mL bölgedir.</li>
	<li>Tüm sıvı kuyulardan kaldırın. Her şey 2 x % 60 isopropanol, Bütün su kuyuları taraftan tamamen kaldırmak emin ile yıkayın. % 60 isopropanol Aspire edin ve hızlı bir şekilde alt kapsayacak şekilde wells duvarları dokunmadan petrol kırmızı O çalışma çözüm ekleyin. Bu kuyuları kuru değil bu yüzden bu adımı hızlı yapılması önemlidir.</li>
	<li>Yağ kırmızı O eklendikten sonra hafif sallanan ile oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>Tüm yağ kırmızı O kaldırmak ve hemen distile H2O. yıkama ile distile H2O ilişkisiz petrol kırmızı O. kaldırmak başlamak 10 m için ekleyin 10 dk sonra yağ kırmızı O Aspire edin ve 3 çamaşır yordamı yineleyin x.</li>
	<li>Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra PBS ekleme ve hücreleri görüntü. PBS hücrelerde 4 ° C'de lekeli mağaza</li>
</ol>7. Protokolü 6: Osteojenik koşulu Alizarin Red ile boyama
<ol><li>Tüm sıvı her kuyudan çıkarın. Her şey (iyi bir 12-şey tabak başı 1,5 mL) % 2 Alizarin Red leke çözüm uygun miktarda ekleyin ve kadar çözüm tamamen kuyunun kapsar plaka yan yana hafifçe eğimli.</li>
	<li>15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Alizarin Red kuyulardan kaldırın. Yavaşça her şey dört kez distile H2ile kalsiyum kristalleri çıkarmak değil dikkat çekici O, durulayın. Kurumasını sağlar.</li>
</ol>8. protokol 7: Chondrogenic koşulu ile Masson'ın Trichrome boyama
<ol><li>
Distile su Deparaffinize ve hidrat bölümleri slaytlar 30 dk. 60 ° C kuru fırında pişirin.
	<ol>
<li>Suyla temasa için koyun slaytlar içinde alkol konsantrasyonu aşağıdaki gibi azalan 5 dk incubations ardından dealcoholization ajanlar ile üç 5 dk incubations: iki (mutlak etanol) % 100, % 95 alkol ikişer, ikişer % 80, 2'de % 70 ve nihayet iki inç distile Bouin'ın sabitleştirici hazır iken H2O. slaytlar H2O kalabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin'ın sabitleştirici (ortaya) plastik mikrodalga coplin kavanoz içinde yer 40 mL. Yüksek sıcaklığı 55 ° C'ye getirmek için mikrodalga Slayt 20 dk için ısıtmalı çözüm yerleştirin; üstünde belgili tanımlık sayaç izin stand kaplı. Musluk suyu 10 dk ya da tüm sarı renk kaybolana kadar çalışan yıkayın.</li>
	<li>10 dk. yıkama Weigert'ın Hematoksilen bölümlerde musluk suyu 10 min için çalışan leke.</li>
	<li>Beibrich'ın scarlet asit fuchsin çözüm için 10 dk. yıkama 3 x 10 dk musluk suyundaki bölümlerde leke. Phosphotungstic/phosphomolybdic asit solüsyonu 10 dk içinde Mordan slaytlar. Durulama değil.</li>
	<li>Slaytlar doğrudan anilin mavi çözüm için 10 dk. durulama musluk suyundaki iki kısa dips ile yerleştirin.</li>
	<li>Slaytlar için 3-5 dk. yıkama 1 dk. yer % 95 etanol 1 dk. Dehydrate musluk suyundaki % 1 Asetik asit çözüm adım 5.4 ve mount sentetik reçine ile gösterildiği gibi yerleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+biology+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li>
<li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis%3A+identifying+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li>
<li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease%3A+a+review+of+current+research+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li>
<li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adipose+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li>
<li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+shades+of+white%3A+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li>
<li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes%3A+To+What+Extent+Are+They+Related%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li>
<li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitia+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li>
<li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Ecancermedicalscience%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822(2018).</li>
<li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+and+Hemotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li>
<li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li>
<li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li>
<li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Using+human+adipose-derived+stem%2Fstromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li>
<li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adipose progenitör hücrelerin farklı depoları fenotip ve farklılaşma potansiyeli9' büyük ölçüde değişmektedir. PVAT türetilmiş ataları üç farklı soy aşağı eşzamanlı indüksiyon bir tek hasta donörden kültür, Adipojenik ve Osteojenik ve chondrogenic, izin verir Bu romanın pluripotent kapasitesi iyi kontrollü bir soruşturma için nüfus progenitör hücre. Bu raporda açıklanan metodoloji insan PVAT progenitör hücre farklılaşması kapasite sınamak ve PVAT patolojiler ve vasküler sesi düzenlenmesinde onları...

Yağ dokusu çok güçlü Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) içine ayırt yeteneğine sahip zengin bir kaynağıdır Osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic soy1. Olgun adiposit hipertrofisi ve adiposit için ikamet MSC de novo farklılaşma yoluyla bu doku genişler. Perivasküler Yağ dokusundan (PVAT) kan damarlarının çevreleyen ve vasküler işlevi2,3düzenler. Obezite kaynaklı PVAT genişleme kardiyovasküler patolojileri exacerbates. MSC multipotent potansiyel insan deri altı yağ depoları dan olmuştur iken de okudu4,5, hiçbir çalışmaları explanted ve insan PVAT kaynaklı progenitör hücre, muhtemelen nedeniyle ayırt etme kapasitesi değerlendirilen tedarik invasiveness. Böylece, bu çalışmanın amacı explant ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda insan aort PVAT progenitör hücre yaymak için ve onların eğilimi için Osteojenik ayırt etmek için chondrogenic ve Adipojenik soy test etmek için bir yöntem sağlamaktır. Bizim PVAT anastomoz aort obez Hastalarda Koroner arter bypass greft cerrahisi uygulanan artan üzerinde bypass greft sitesinden kaynağıdır. Taze izole PVAT enzimatik ayrışmış ve stromal vasküler kesir izole ve tüp, ilk kez insan PVAT kaynaklı progenitör hücre farklılaşması kapasitesini test etmek olanaklı kılar yayılır.
Birincil kültürlü insan PVAT stromal vasküler kesir kullanarak, kök/progenitor hücreler Adipojenik ve Osteojenik, veya chondrogenic soy doğru ayırt etmek için tasarlanmış üç deneyleri test ettik. Onların multipotency değil test edildi, ancak önceki çalışmamızda bir nüfus CD73 +, CD105 + ve sağlam adiposit6', ayırt edebilir PDGFRa + (CD140a) hücreleri tespit edilmiştir. PVAT doğrudan damar sesi ve inflamasyon7düzenlemektedir. PVAT vasküler işlevi özel etkisi ve PVAT genişleme sırasında obezite mekanizmaları anlamaya başlamak için bu roman hücre popülasyonu ayırt etme potansiyelini test için mantığı olduğunu. Bu metodoloji yağ dokusu türetilmiş progenitör hücrelerin işlevlerini anlayışımızı geliştirir ve tanımlamak ve benzerlik ve farklılıkları progenitör hücre farklı doku kaynaklardan karşılaştırın sağlar. Biz izole edip farklı soy doğru MSC differentiating için kurulan ve doğrulanmış yaklaşımlar üzerine inşa ve yordamlar insan PVAT kaynaklı progenitör hücre canlılığı en üst düzeye çıkarmak için en iyi duruma getirme. Bu teknikler kök ve progenitör hücre araştırma ve yağ dokusu geliştirme alanlarında geniş uygulamalar var.

<table><tbody><tr><td>Hayvansız kollajenaz/dispas karışımı I &nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>Alcian Mavisi</td><td>YenigelenTedarik</td><td>1003A</td><td>%1 Sulu çözelti pH 2.5</td></tr><tr><td>Alizarin Kırmızı</td><td>Amresco</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>alfa-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr><tr><td>Anilin</td><td>Mavisi YenigelenTedarik</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik/antimikotik</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Beibrich'in kırmızı asit fuchsin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-gliserofosfat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrich Scarlet</td><td>EKI</td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bouin'in sabitleyici</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A Sığır</td><td></td></tr><tr><td> serum albümin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Hücre ayırma çözeltisi</td><td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Bell süzgeci (70 mm)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L glikoz, L-glut ve piruvat</td></tr><tr><td>DMEM/F12 orta</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>yüksek glikoz, glutamaks, sodyum bikarbina</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin, sığır derisi</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>glutamin takviyesi</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin çözeltisi</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Yağ kırmızısı O</td><td>Millipore-Sigma</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenik asit</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin çözeltisi</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfotungstik/fosfoibdik asit çözeltisi</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P4006-100G/221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Kültür ortamı için antimikrobiyal reaktif.</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Weigert hematoksilen</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan aort perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Yağ dokusu çok güçlü Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) içine ayırt yeteneğine sahip zengin bir kaynağıdır Osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic soy. Progenitör hücrelerinin Adipojenik farklılaşma sürüş yağ dokusu genişleme ve fonksiyon bozukluğu obezite yanıt büyük bir mekanizmadır. Perivasküler Yağ dokusundan (PVAT) anlayış değişiklikler böylece metabolizma hastalığında klinik olarak ilgili. Ancak, önceki çalışmalar çoğunlukla fare ve diğer hayvan gerçekleştirilen olmuştur modelleri. Bu protokol insan torasik PVAT örnekleri koroner arter bypass greft cerrahisi uygulanan hastalardan toplanan kullanır. Yağ dokusu artan aort üzerinden toplanan ve stromal vasküler kesir explantation için kullanılır. Daha önce insan PVAT lipid içeren ayırt etmek için kapasiteli yağ progenitör hücrelerinin varlığı teyit adiposit. Bu çalışmada, daha fazla stromal vasküler kesir hücre farklılaşma potansiyeli muhtemelen çok güçlü progenitör hücre içeren analiz ettik. Biz PVAT kaynaklı hücrelere farklılaşma Adipojenik ve Osteojenik ve chondrogenic soy içine insan kemik iliği MSC göre. Farklılaşma 14 gün belirli lekeleri kullanılan adiposit (yağ kırmızı O), lipid birikimi tespit etmek için kireç yataklarında Osteojenik hücreleri (Alizarin Red), veya glikozaminoglikan ve kollajen chondrogenic hücrelerinde (Masson'ın Trichrome). Adipojenik ve chondrogenic potansiyel, PVAT kaynaklı hücreler kemik iliği MSC verimli bir şekilde tüm üç soy farklılaşmış, vardı ama sağlam Osteojenik potansiyelini yoktu.

İnsan PVAT üzerinden stromal vasküler kesir yalıtım
Şekil 1A bir şematik nerede artan aort örten PVAT elde edildi anatomik bölgenin gösterir. Biz daha önce koroner arter bypass bu örnekler türetilmiş6edildi aşılama geçiren hasta nüfus nitelendirdi. Şekil 1B ameliyat elde edilen insan PVAT bir örneği gösterilir. <strong class="xfi...

Bu iletişim kuralının amacı insan Perivasküler Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücre birden çok hücre soy ayırt etmek yeteneği test etmektir. Farklılaşma Mezenkimal Kök hücre adipocyte, osteocyte ve kondrosit soy ayırt etmek için bilinen insan kemik iliği elde için karşılaştırıldı.

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Perivasküler yağ dokusu kan damarlarını çevreler ve kardiyovasküler fizyolojiyi düzenler. Bu protokol, vasküler mikroortamda insan yağlayıcı atalarının işlevi ile ilgili anahtar soruları cevaplamak için kullanılır. Yağ ata hücreleri anatomik konumlarına göre değişir.Multipotent atapopülasyonunun kardiyovasküler hastalığı olan hastalardan perivasküler yağ dokusundan başarıyla elde edilebilmektedir. Prosedürü gösteren Spencer Scott, benim laboratuvarımdan bir tıp öğrencisi olacak. Metin protokolünde açıklandığı gibi ameliyathaneden 500 miligramlık bir Insan Perivasküler Yağ Dokusu veya PVAT parçası alın.Taze insan PVAT'ını DMEM'den 25 mililitre antibiyotik solüsyonu içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 4 santigrat derecede 20 dakika sallayarak kuluçka. PVAT antibiyotik çözeltisi iken, 37 santigrat derece de dissociation tampon bir aliquot çözülme.Beş mililitre dissosyasyon tamponuna 50 mikrolitre 100x antibiyotik/antimikotik solüsyon ekleyin ve 0,22 mikron şırınga filtresi kullanarak sterilize edin. 24 kuyulu bir plakanın bir kuyuya bir mililitre jelatin çözeltisi ekleyin. Bir laminar akış kaputunda, pvat'ı antibiyotik çözeltisinden steril petri kabına aktarmak için steril forseps ler ve makaslar kullanın.Dokuya önceden ısıtılmış dissociation tampon bir mililitre ekleyin. Steril forceps ve diseksiyonu makasları kullanarak tüm dokuyu bir bulamaç içine ince ince doğrama. Bir mililitrelik bulamacı dört mililitre lik dissosilasyon tamponuna aktarın.Bir saat boyunca 200 rpm önceden ısıtılmış 37 santigrat derece orbital shaker kendi tarafında tüp kuluçka. Bir saat sonra görünür doku parçaları bulunmamalı ve çözelti bulutlu bir hücre süspansiyonu olarak görünmelidir. 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine ayarlanmış 70 mikron hücreli süzgeçten çözeltiyi filtreleyin.Mümkün olduğunca çok hücre yakalamak için ek bir 10 mililitre antibiyotik çözeltisi ile süzgeç durulayın. Süzgeci sıkmayın. Şimdi bir sallanan kova santrifüj içinde 300 kez g 12 dakika boyunca hücreleri pelet.Santrifüjden sonra tüp, adipositlerin yağlı bir üst tabakası, bir interfaz ve bir pelet olarak ayrılacaktır. Pelet endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, kan hücreleri ve ata hücreleri içeren stromal vasküler fraksiyonudur. Peleti 10 mililitre HBSS ve santrifüjde 300 kez 5 dakika süreyle yeniden askıya alın.HBSS'de toplam iki yıkama için bu adımı tekrarlayın. Şimdi jelatini 24 kuyulu bir tabaktan aspire edin. Bağlanmamış jelatini çıkarmak için kuyuyu HBSS ile bir kez hafifçe yıkayın.Büyüme orta bir mililitre bozulmamış kırmızı kan hücreleri ile stromal vasküler fraksiyonpelet resuspend ve jelatin kaplı iyi üzerine tohum. Sonra kültür orta mililitre başına 25 nanogram son konsantrasyona insan FGF2 ekleyin. %5 CO2 ile 37 santigrat derecede 24 saat kuluçka.Hücreleri 24 saat büyüttükten sonra, büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri HBSS ile beş kez yıkayın. Bu yıkama adımı kırmızı kan hücreleri ve ölü hücreleri kaldırır. Sonra her iyi için mililitre FGF2 başına 25 nanogram ile desteklenen taze büyüme medya bir mililitre ekleyin.Her 48 saatte bir, her seferinde mililitre taze FGF2 başına 25 nanogram ile takviye emin olmak için medya değiştirin. Geçiş hücreleri %100'e ulaştıktan sonra ekstrandan 7 ila 10 gün sonra biraraya ulaşırlar. Bunu yapmak için, büyüme ortamı aspire ve bir mililitre HBSS ile iki kez monolayer yıkayın.Kuyulardan tüm HBSS aspire ve hücre bölünmesi çözeltisi birkaç damla ekleyin. Dokunun ve plaka birkaç kez girdap ve hücreleri kaldırmak için 5% CO2 ile 37 santigrat derecede kuluçka. Sonra müstakil hücrelere taze kültür orta yaklaşık bir mililitre ekleyin.Müstakil hücrelerin 500 mikrolitresini, her biri 500 mikrolitre büyüme ortamı ve 25 nanogram FGF2 içeren 24 kuyuluk iki kuyuya dağıtın. Ayrıca, kültür insan kemik iliği Mezenkimal Kök Hücreler veya MSC kolonileri olarak metin protokolünde açıklandığı gibi. 12 kuyuluk bir plakanın kuyubaşına uygun sayıda kemik iliği ve PVAT'tan türetilmiş hücre plakası koyun.Adipojenik ve osteojenik durumlar için, plaka yaklaşık 200, 000 için 225, iyi başına 000 hücreleri. Kondrojenik koşullar için ise, plaka 150, 000-175, 000 iyi başına hücreler. Daha sonra hücreleri hem insan PVAT progenitor hücre popülasyonundan hem de insan kemik iliği MSC popülasyonundan hücre ayırma solüsyonu ekleyerek ayırın.Ayırma çözeltisindeki hücreleri 37 santigrat derece ve %5 CO2'de beş dakika kuluçkaya yatırın. Popülasyonları ayrı 15 mililitrelik konik şişelere çekin. Hücreleri peletlemek için şişeleri 500 kez g'de yedi dakika boyunca aşağı çevirin.Sonra PBS bir mililitre hücreleri resuspend ve hücre numarasını tahmin etmek için bir hemositometre kullanın. Hücreleri daha önce olduğu gibi 12-iyi tabaklarda tabaklayın. İndüklenen ve indüklenen olmayan adipojenik ve osteojenik durumlar için ayrı yemekler sağlayın.Ve indüklenen durumun her kuyuya 1.5 mililitre adipojenik ve osteojenik iletim ortamı ekleyin. Daha sonra indüklenen olmayan durumun her kuyuya 1,5 mililitre adipojenik ve osteojenik non-indüksiyon ortamı ekleyin. Adipojenik ve osteojenik indüklenen ve indüklenen hücre popülasyonlarının kuluçkaya 37 santigrat derece ve %5 CO2'de başlamasına başlanması.İnsan PVAT progenitor hücrelerinin ve insan kemik iliği MSC'lerinin kalan hacmini 500 kez g'de yedi dakika boyunca aşağı doğru çevirin. 10 mikrolitrede 100,000 hücre yoğunluğu elde etmek için kalan kemik iliği ve PVAT kaynaklı hücre peletlerini yeniden askıya almak için gereken hacmi belirleyin. Daha sonra kondrojenik soy indüksiyonu için MSC büyüme ortamının hesaplanan hacmindeki peletleri yeniden askıya alın.Homojen bir dağılım sağlamak için pipet kullanarak hücrelerin hacmini yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Şimdi pipet 100, 000 hücreden oluşan bir mikro kütle oluşturmak için her kuyunun merkezine konsantre hücre çözeltisinin 10 mikrolitrelik damlacık. Buharlaşmayı önlemek için bitişik kuyuya bir mililitre steril su yerleştirin.Mikro kütlenin biraraya gelip toplamasına izin vermek için mikro kütle kültürlerini 37 santigrat derece ve %5 CO2'de iki saat kuluçkaya yatırın. İki saat sonra, dikkatle indüklenen durum kuyularının her birine mililitre insan TGF-beta-bir başına 10 nanogram ile çivili kondrojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Şimdi dikkatle indüklenen olmayan durum kuyuları için indüksiyon olmayan medya 1,5 mililitre ekleyin.Metin protokolünde açıklandığı gibi numuneyi susuz leştirmek, gömmek ve lekelemek için indüklenen kondrojenik durumdaki mikro kütleyi bir kasete kazıyın veya dökün. Adipojenik farklılaşma çalışmaları insan kemik iliği kaynaklı MSC ve PVAT kaynaklı progenitor hücrelere paralel olarak yapılmıştır. Non-indüklenen durumda, hiçbir lipid birikimi belirgindir.Bu, nötr lipidlerin Yağ Kırmızı O.'su ile boyanmasının ardından gösterilen indüklenen durumun aksine, insan aortPvat türetilmiş hücrelerdeki farklılaşma derecesi daha sağlam iken, her iki insan hücre kaynağı da adipojenik soy için ayırt etme yeteneğini sergilemiştir. Osteojenik farklılaşma protokolü insan kemik iliği kaynaklı MSC'ler ve PVAT kaynaklı hücreler için kullanılmıştır. Indüklenen olmayan hücreler Alizarin Kırmızı ile leke vermedi.Osteojenik farklılaşma protokolünden sonra, insan MSC'leri Alizarin Kırmızısı ile boyanmış kalsifiye nodüller geliştirirken, insan aort PVAT hücreleri gelişmemiştir. Hem insan kemik iliği MSC'lerinden hem de insan PVAT'ından elde edilen hücreler, mikro kütlede bol kollajen birikimi ile kondrojenik farklılaşmanın karakteristik özellikleridir. Mikro kütle insan kemik iliği MSCs oluşur ve aort PVAT türetilmiş hücreler de Alcian Mavi boyama ile belirtildiği gibi glikozaminoglikanların bol birikimi gösterdi.Morfolojik olarak, lakunabenzer yapılar kollajen birikimi ile çevrili boşluklarda oturan hücrelerle tespit edildi. Enzimatik ayrışma öncesinde perivasküler yağ dokusunu ince doğramak ve her soy farklılaşması tahsini için uygun hücre yoğunluklarının kaplanması için önemlidir. Bu prosedürü takiben, perifvasküler yağ ve kemik iliği kaynaklarından farklılaştırılmış ataların soya özgü belirteçlerini karakterize etmek için batı leke ve akış sitometrisi ile birlikte kantitatif PCR kullanılmalıdır.Bu teknikle, obezite sırasında perivasküler yağ dokusu genişlemesi ve disfonksiyonu düzenleyen mekanizmaları ve progenitor hücrelerinin vasküler fonksiyon ve kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkilerini anlamaya başlayabiliriz.

differentiation-capacity-human-aortic-perivascular-adipose-progenitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC'ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile...

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Olgun adipositler, homojen bir fibroblast benzeri hücre popülasyonuna yol açan farklılaşma yoluyla bol miktarda kök hücre kaynağını temsil edebilir. Kollajenaz sindirimi, olgun adipositleri insan yağından izole etmek için kullanılır. Protokolümüzün amacı, insan olgun adipositlerinden multipotent, farklılaşmış yağ hücreleri elde etmektir.

Tavan Kültürlerde Olgun adipositlerinde ve dediferansiyonunu ile İnsan adipoz Kök Hücre Üretimi

Bu protokol, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin (pADSC) deri altı yağ dokularından izolasyonunu ve çoklu potansiyelin incelenmesini tanımlar. Multipotent pADSC, adiposit farklılaşma süreçlerini tanımlamak ve rejeneratif çalışmalar için mezodermal mezenşimin çoklu hücre soylarına veya ektoderm ve endodermin diğer soylarına transdiferansiyonu incelemek için kullanılır.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Wnt-1 Cre+/-periaortik yağ dokusundan elde edilen adipoz türetilmiş kök hücrelerin (NCADSCs) izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için bir protokol salıyoruz. Rosa26RFP/+ fareler. NCADSCs in vitro adipogenez veya lipogenez modelleme için ADSCs kolay erişilebilir bir kaynak olabilir.

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) saf bir adiposit popülasyonunun üretilmesine izin verir. Retinoik asit, iPSC'leri adiposit üretmek için kullanılan mezenkimal kök hücrelere (MSC'ler) ayırmak için kullanılır. Daha sonra, saf adipositler elde etmek için Nil kırmızısı boyamaya dayalı bir sıralama yaklaşımı kullanılır.

Adipositle İlişkili Bozuklukları İncelemek için İnsan iPSC'lerinin Saf Bir Adiposit Popülasyonuna Sağlam Farklılaşması

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Keşfedin insan perivasküler yağ dokusundan çok potansiyelli öncü hücrelerin izolasyonu ve kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle karşılaştırılması. Bu yöntem kardiyovasküler hastalıklarda rejeneratif tıp uygulamaları için kritik içgörüler sunar.

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Daha fazla video keşfet