Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem
28 Eylül 2019
Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.
Otomatik seri bölüm elektron mikroskobu teknikleri. Biyolojik üç boyutlu modeller görüntü işleme üretimine yol açan boru hattında hız sınırlayıcı adım. Protokolümüz, sadece birkaç gün içinde görüntü hacimlerinin daha yoğun bir şekilde oluşturulması nı sağlamak için adım adım bir kılavuz sağlar.
Üç boyutlu modeller kullanarak nicel ölçümler için bir yaklaşım ile birlikte. Bu teknikle, dokuların beyin dışındaki 3Boyutlu yapısı, bazı hastalıklara özgü yapısal bozuklukları belirlemek ve tanı stratejisini geliştirmek için potansiyel olarak analiz edilebilir. Segmentasyon sıkıcı bir adımdır.
Kötü bir bölümleme düzeltmeyi ve tüm işlemi yeniden başlatmak zorunda kalmamak için mümkün olduğunca doğru hale getirmek için zaman ayırın. Yazılımın tasarımı bazen çok kullanıcı dostu değil. Bu nedenle, segmentasyon üzerinde başlangıç çalışması görmek önemlidir.
Yığın içeren mikroskoptan yerel dosyayı sürükleyip bırakarak veya tüm görüntü yığınını içeren klasörü yazılım penceresine sürükleyerek ve bırakarak görüntü yığınını açın yığın açıldıktan sonra, voxels boyutunun meta verilerden okunduktan emin olmak için görüntü, özellikler gidin. Görüntüye tıklayarak resmi 8-bit'e dönüştürün, yazın ve 8-bit'i seçin. Orijinal yığın farklı fayans olarak elde edilirse, TrakEM2 içinde dikiş uygulayın.
Yeni, TrakEM2 kullanarak yeni bir TrakEM2 projesi oluşturun TrakEM2 gömülü fonksiyonlar gerekirse ilgi segment yapıları segment. TrakEM2'nin yapışkanında, şablon penceresinin altındaki 'click'click'on'under'on ve yeni alt alan listesi ekle'Sürükley ve klasörüne bir şey bırak' seçeneğini belirleyin, proje nesnelerinin altında ve bir şey orada görünür. Sürükle ve bırak, alan listesi şablonundan bir şey'in altında bulunan proje nesneleri'Görüntü yığını viewport', imleç ile Z-space'i seçin.
Alan listesi benzersiz kimlik numarasıyla birlikte görünür. Üstteki fırça aracını seçin ve fareyi kullanarak bir yapıyı tüm Z yığınının üzerinde sitosol doldurarak parçalara ayırın. Oyma için tohum olarak Ilastik kullanılacak segmentli kitle, ihracat.
Bunu yapmak için, Z-uzay listesindeki alan listesi nesnesine veya görünüm bağlantı noktasındaki maskeye sağ tıklayın ve export'area list'as labels T-I-F'yi seçin. Daha fazla yeniden yapılandırma için gereken çözünürlüğe bağlı olarak, aşağı örnekleme yaparak görüntü yığınının piksel boyutunu küçültün. Segmentasyon ve yeniden yapılandırma için kullanılacak yazılımın bellek gereksinimlerini göz önünde bulundurun.
Ilastik, X-Y'de beş yüz piksele kadar yığın işler. Nesneleri hala tanınabilir görünen ve böylece segmente edilebilir minimum boyutu dikkate alın. Image'adjust size'Kontrastı artırmak ve segmentasyona yardımcı olmak için, membranları daha canlı hale getirmek için keskinleşmemiş maske filtresi uygulanabilir.
Process'filters'unsharp mass'Insharp mass'In imaj yığınını segmentasyon yazılımında daha fazla işlem için tek bir görüntü olarak aktar', file'save as'image sequence' kullanarak ve TIFF'formatını seçin. Ana Ilastik gooey olarak, oyma modülü seçin. Yeni ekle'yi kullanarak görüntü yığınını yükleyin ve dizi 'Tüm dizin seç' dizisinden tek bir 3D/4D birim ekleyin ve tek dosya olarak kaydedilen görüntü yığınını içeren klasörü seçin'Resimleri yükleme seçeneklerinin bulunduğu yeni pencerenin altında, Z'yi seçtiğinizden emin olun.
Aşağıdaki adımlar için, tüm işlemler ve düğmeler ana yazılım yapışkanının sol tarafında bulunabilir. Ön işleme sekmesialtında, önceden denetlenen standart seçenekleri kullanın. Parlak çizgilerin zengin filtrelerini kullanın ve filtre ölçeğini 1.600'de tutun.
Bu çevre daha sonra değiştirilebilir. Ön işlem tamamlandıktan sonra, etiketleme modülünün açılır menüsündeki bir sonraki sayfayı seçin. Varsayılan olarak bir nesne ve bir arka plan vardır.
Üzerine tıklayarak nesne tohumseçin ve ilgi yapısının üstüne bir çizgi çizin. Ardından, arka plan tohumünü seçin ve yeniden oluşturulacak nesnenin dışına bir veya birden fazla çizgi çizin. Şimdi, segment'e tıklayın ve bekleyin.
Bilgisayarın gücüne ve yığının boyutuna bağlı olarak, segmentasyon birkaç saniye ile saat arasında sürebilir. Bu yapıldıktan sonra, segmentasyonu vurgulayan yarı saydam bir maske, parçalı yapının üzerinde görünmelidir. Segmentasyonu denetlemek için yığında ilerleyin.
Segmentasyon, ilgi yapısını takip etmez veya ondan dökülür doğru olmayabilir. Dökülen segmentasyon üzerine bir arka plan tohumu yerleştirerek herhangi bir dökülme düzeltin. Ve ilgi nesnesinin yeniden oluşturulmayan kesiminin üzerine bir nesne tohumu ekleyin.
Ilastik ile segmentasyonun doğru görsel düzeltmesi sıkıcı olabilir, ancak dışa aktarılan nesnelerin yapıtları içermediğinden emin olmak önemlidir. Segmentasyon hala doğru değilse, kabul edilen belirsiz sınıflandırılmış piksel miktarını artıracak veya azaltacak bias'parametresi ile değiştirmeye çalışın. Bu değeri varsayılan olarak 0,95 olduğunu.
Segmentasyon çok tutucu ise herhangi bir dökülme veya artış sınırlamak için azaltın. Başka bir olasılık önişleme'yi tıklatmak ve filtrenin boyutunu değiştirmektir. Değeri artırmak tuz ve biber gürültü benzeri etkileri en aza indirecektir, ama aynı zamanda membranlar daha bulanık ve daha küçük ayrıntıları tespit etmek zor hale getirecek.
Bu dökülmeyi sınırlayabilir. İstenilen tüm nesneler bölümlendirildiği sürece gerektiği kadar yineleme. Bir nesne tamamlandıktan sonra, segment'e gidin ve geçerli nesneyi kaydet'' yeni bir nesnenin segmentasyonunu başlatmak için iki yeni tohum görünür'' düğmesine tıklayın.
Soyut yüzey önlemleri hemen O-B-J dosyaları olarak dışa aktarıntıkla tüm kafesler 'To trakEM2 içinde 3D el ile segmente modelleri görselleştirmek için, sağ tıklama alan listesi, sonra 3D'A daha yüksek değer göster seçin daha düşük çözünürlüklü örgü oluşturacaktır. Son olarak, wavefront O-B-J'by olarak 3D mesh dışa aktarın menü dosyası'export yüzeyler'WaveFront'Sonra metin protokolü açıklandığı gibi nöro morflama araç kiti yükledikten sonra, açık blender. Aynı anda birden fazla nesne almak için sahne nin altındaki nesneleri'nin altındaki netler menüsüne tıklayarak nöro morph toplu alma kullanarak nesneleri alma.
Etkinleştirmeye, yeniden örgü ve düzgün gölgeleme kullandığınızdan emin olun. Dış astardan ilgi çekici nesneyi seçin ve değiştiricinin menüsü altında yeniden kafes işlevinin Octree Derinliğini değiştirin. Vertices sayısını en aza indirmek ve çözünürlük ve doğru morfoloji ayrıntıları kaybetmemek için yinelemeli çalışın.
Octree Derinliği değiştirirken, ana yapışkan üzerinde mesh buna göre değişecektir. Tamamlandıktan sonra, işlemi sonuçlandırmak için uygula'ya tıklayın. Sol paneldeki nöro morf menüsüne gidin ve görüntü yığınını yüklemek için görüntü superimposition araç görüntü yığını etkileşimlerini kullanın.
X, Y ve Z için görüntü yığınının fiziksel boyutunu girdiğimden emin olun ve kaynak Z.X ve Y'ye tıklayarak yığının yolunu seçin ortogonal düzlemlerdir. Bunlar isteğe bağlıdır ve yalnızca kullanıcı geçerli yolu eklerse yüklenir. Ardından, üzerine sağ tıklayarak görünüm bağlantı noktasında bir kafes seçin.
Sekmeye basarak düzenleme moduna girin, faresağ tıklatarak bir veya daha fazla tepe noktası seçin ve son olarak tepe noktasındaki göster resmine tıklayın. Mikrograflı bir veya daha fazla kesilmiş düzlem kafesin üzerine yerleştirilmiş görünür. Üzerine sağ tıklayarak kesilen düzlemi seçin.
Ardından Y denetimine basın ve fare kaydırma özelliğini kullanarak 3B modelüzerinde kaydırın. Bu da düzeltme yöntemi olarak kullanılabilir. Burada gösterilen segmentasyon ve rekonstrüksiyon TrakEM2 ve Ilastik kullanılarak.
TrakEM2 yapışkanı, el ile kırmızı yla bölümlere ayrılmıştır. Dışa aktarılan maske daha sonra yarı otomatik segmentasyon için giriş olarak kullanılabilir. Ilastik'ten, maskeler manuel prova için TrakEM2'ye daha fazla ihraç edilebilir.
Maskeler yeniden yapılandırılan yapıları ortaya çıkarmak için 3D üçgen meshes olarak ihraç edilebilir. Bu örnekte, dört nöron, astrosit, mikroglia ve perisit bu süreç kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Özelleştirilmiş araçlar kullanılarak yeniden oluşturulmuş morfolojilerin 3Boyutlu analizi gösterilmiştir.
Burada elektron mikroskobu veri seti tarama odaklanmış bir iyon ışını bir isotropic görüntü hacmidir. Bu verilerin yoğun bir yeniden yapılanma akson, astrositik süreç ve dendritler ortaya koymaktadır. Bu mikrograf, sinapslar ve astrositik glikojen granüller gibi niceliksel hedeflerin örneklerini göstermektedir.
Mikrograftaki maske glikojen granüllerin sinapsların etrafındaki dağılımını gösteriyor. Burada glikojen kaynaklı laktat emilim modeli veya GLAM'Here grafik görselleştirme giriş ve çıkış grafik bir grafik illüstrasyon gösterilmektedir, bir kullanıcı odaklanmış bir iyon ışını tarama elektron mikroskobu veri setinden yoğun rekonstrüksiyon üzerinde çalışırken bir sanal gerçeklik veya V-R kulaklık giyen gösterilir. Nöritlerin bir alt kümesinden, sürükleyici bir V-R sahnesi görülebilir.
Yeşil lazer GLAM'ın zirvesini gösteriyor. dışa aktarılan 3B nesnelerin doğru boyutunu belirlediği ve ölçümlerinin gerçek boyutunu yansıttığını belirlediği için birincil öneme sahiptir. Seri kesit görüntüleme, görüntüleme segmentasyonu ve 3D konstrüksiyon kavramı oldukça eskidir.
Teknik ivmekeşfetmek anatomi ders kitapları nın gözden colectomies gelişmelere yol açıyor. Elektron mikroskobunda beyin araştırmaları için yöntem geliştirilmiş olmasına rağmen, herhangi bir ve mikroskopi tekniği ne olursa olsun veri üreten tekniklerle genelleştirilebilmekte, her türlü 3Boyutlu görüntüleme tekniği bu görüntüleme segmentasyon ve yapım tekniklerinden yararlanabilir. C-T taramaları ve M-R-I dahil.
Genel Bakış
Bu çalışma, 3D'de tüm hücre morfolojilerini yeniden yapılandırmak için büyük elektron mikroskobu veri setlerini segmente etmek üzere tasarlanmış bir yöntem sunmaktadır. Özelleştirilmiş yazılım, görselleştirmeyi geliştirmek ve tıkanma sorunlarını gidermek için sanal gerçekliği kullanarak niteliksel ve niceliksel analiz sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektron Mikroskobu
- 3D Yeniden Yapılandırma
Arka Plan
- Otomatik seri kesit elektron mikroskobu teknikleri kullanılmaktadır.
- Yöntem, biyolojik 3D model oluşturma için gereken süreyi kısaltmayı amaçlamaktadır.
- Segmentasyon kritiktir, çünkü yanlışlıklar kapsamlı bir yeniden çalışma gerektirebilir.
- Özelleştirilmiş yazılımın kullanımı analiz yeteneklerini artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Yoğun görüntü hacmi yeniden yapılandırması için basitleştirilmiş bir protokol geliştirmek.
- 3D'de niteliksel ve niceliksel değerlendirmelere izin vermek.
- Hastalıkla ilgili bozuklukları tespit etmek için çeşitli dokuların 3D yapılarını analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, hacimsel veri setleri oluşturmak için elektron mikroskobu kullanır.
- Yöntemler, farklı yazılım araçlarını kullanarak büyük görüntü yığınlarında hücresel yapıların doğru segmentasyonuna odaklanır.
- Görüntü işleme adımları, görüntü yığınının hazırlanmasını, segmentasyonu ve 3D görselleştirme için nesnelerin dışa aktarılmasını içerir.
- Kritik adımlar arasında vozel boyutu doğruluğunu sağlamak, filtreler uygulamak ve segmentasyonların manuel denetimi bulunmaktadır.
Ana Sonuçlar
- Otomatik yöntem başarılı bir şekilde büyük veri setlerinden doğru 3D modelleri yeniden yapılandırır.
- Segmentasyon yöntemleri, karmaşık yapıları ele almada sağlamlık göstermiştir.
- Görsel denetim, yeniden yapılandırılan nesnelerin güvenilirliğini sağlamak için esastır.
- Yaklaşım, çeşitli dokulardaki yapısal bozuklukların teşhisinde potansiyel uygulamalara sahiptir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, büyük ölçekli elektron mikroskobu verilerini doğru bir şekilde segmente etmek için temel bir metodoloji sağlamaktadır.
- Belirtilen yöntem, karmaşık biyolojik yapıların analizinde verimliliği artırarak teşhis stratejilerini iyileştirebilir.
- Çıkarımlar, sağlık ve hastalık bağlamlarında doku yapısı hakkındaki anlayışımızı geliştirmeyi içerir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of cellular ultrastructure enables mechanistic de-risking in target validation by resolving ambiguities in morphology-function relationships. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative structural readouts that inform hypothesis testing and pathway clarification. Integration of virtual reality analysis enhances reproducibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed visualization of glial and neuronal ultrastructure.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by clarifying complex morphologies that may be misinterpreted in 2D.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by identifying structural impairments indicative of disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating dense, accurate 3D models of tissue architecture.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative measurements derived from reconstructed structures.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by enabling reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through analysis of structural impairments in axons, dendrites, and astrocytic processes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking 3D morphology to functional hypotheses like the glycogen-derived lactate absorption model (GLAM).
- Strategic Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling visualization of synaptic targets and glycogen granule distribution for biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through quantitative 3D structural analysis.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing ultrastructural patterns unresolved in 2D imaging.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative outputs such as synapse and glycogen granule quantification.
- Analytics: Highlights measurements and readouts that help teams compare conditions, including structural impairments typical of certain diseases.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment via visualization of disease-related structural changes in neural and glial cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across microscopy techniques including CT and MRI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in glial and neuronal morphology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D model generation from electron microscopy datasets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative 3D morphology analysis.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy, image segmentation, and 3D visualization software such as TrakEM2, Ilastik, and Blender.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include high-resolution EM imaging systems and computational resources for processing large image stacks.
- Cross-team standardization requirements for segmentation protocols and proofreading to ensure consistency across users and sites.
- Adaptation considerations across model systems, as the method can be generalized to any microscopy technique generating 3D data.
- Practical limitations include the tedious nature of segmentation and the need for accurate voxel size calibration to avoid measurement artifacts.
