Name: Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Keşfedin miR-143 ve miR-506'nın akciğer kanserinde hücre döngüsü ve anjiogenezi düzenleme yöntemlerini. Hücre transfeksiyonu, RNA izolasyonu ve qPCR teknikleriyle terapötik potansiyeli değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.

1. miR-143 ve miR-506 transfection
: Lateks eldiven, koruyucu gözlük ve bir laboratuvar kat açıklanan deneyler yaparken dikkatli olun. Gerektiğinde, Biyogüvenlik kabini, solunum yolları engelleme veya laminar hava akımı rahatsız olmadan kabine fan ile kullanın. Her zaman koruma cam pencere uygun yüksekliğe üretici tarafından açıklandığı gibi ayarlayın.
<ol><li>Tohum NSCLC A549 hücreleri bir T25 cm2 şişe/6/96 iyi plaka DMEM/F12K medya % 10 FBS ve % 1 penisilin-streptomisin (kültür medya) doku kültürü Hood ile desteklenmiş ve gecede %5 CO2 bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>MiR-143 ve/veya miR-506 taklit eder askıya alma veya karıştırmak transfecting maddesi ile siRNA (miR 2.4 µg transfecting Ajan 14 µL ile karışık; Tablo reçetesibakın) transfection medya ve 1,5 mL serum ve antibiyotik ücretsiz 500 µL içinde DMEM/F12K medya, bir son miRNA konsantrasyon 100 nM. miRNA tutar optimizasyonu farklı hücreleri ve konsantrasyonları gerektirebilir. Uygun bir yaklaşım ile artan konsantrasyonları miRNA (yani, 50-200 nM) ve faiz genlerin ifade downregülasyon değerlendirilmesi hücrelerinin transfection içerir.</li>
	<li>Şişesi/plaka kültür ortamını çıkarın ve bir kez 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>MiRNA/scramble-transfecting Ajan kompleksleri ekleyin ve 37 ° c 6 h %5 CO2 ile kuluçkaya (ebatı eklenen kuluçka birimi tanımlar).</li>
	<li>4 mL ile Kültür medya ortamı değiştirin ve hücreler 24 h ve/veya 48 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Transfected hücreleri her T25 cm2 şişeye tripsin-EDTA 1 mL ekleyerek trypsinization, hasat, 5-10 dk 37 ° C'de için kuluçkaya ve kültür hücreleri hasat için medya 3 mL ekleyin. Her şişe içeriğini ayrı, işaretli 15 mL tüp içine yerleştirin. Doku kültürü mahallede çalışıyorum.</li>
	<li>Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Not: ajitasyon tüp hücrelerinin kaybı neden olabilir dikkat olarak süpernatant kaldırma sırasında gereklidir.</li>
	<li>2 mL 1 x PBS ve 5 min için santrifüj 751 x g. Ekle
</li>
	<li>Adım 7 ve 8 bir kez medya ve süpernatant izlerini kaldırmak için yineleyin. Not: Bu aşamada örnek tüpler-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir.</li>
</ol>2. RNA çıkarma
<ol><li>Çalışma alanının % 70 izopropil alkol ve RNAse dekontaminasyon çözüm ile püskürtülerek temiz.</li>
	<li>RNA ayıklama uygun bir RNA kullanılarak gerçekleştirilmesi (bkz. Tablo reçetesi) kit.</li>
	<li>-80 ° C'den tüpler kaldırın ve çözülme izin. 300 µL lizis arabellek ve hücre zarının yukarı ve aşağı kırmaya pipet ekleyin.</li>
	<li>% 100 ultra-saf etanol eşit bir hacmi ekleyin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve sütun ayıran yer.</li>
	<li>11 ve 16 x g 30 s ve Kaldır akışı aracılığıyla arasındaki santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Tampon ve arabellek kaldırmak için santrifüj yıkama 400 µL ekleyin.</li>
	<li>Ben 75 µL DNA sindirim ile her örnek içinde tampon ve 15 min için kuluçkaya Dnaz 5 µL ekleyin.</li>
	<li>Örnek 400 µL RNA hazırlık arabelleği ile yıkayın.</li>
	<li>2 x RNA yıkama arabellek ile yıkayın.</li>
	<li>Nükleaz ücretsiz su sütunu için santrifüj, sonra toplamak RNA ekleyin.</li>
	<li>Toplam RNA konsantrasyon UV Spektrofotometre ile ölçmek.</li>
</ol>3. RT-qPCR
<ol><li>RT-qPCR önce cDNA sentez. RNA konsantrasyon miktar sonraki tepki cDNA PCR tüp içinde hazırlamak için 20 µL son hacmi 1 µg RNA'ın yerleştirin. Her zaman temiz bir bankta çalışır.</li>
	<li>Diğer gerekli tüm malzemeler Tablo 1' e eklenmiştir.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Malzemeler</td>
			<td>Miktar (µL) / örnekleme (20 µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 X cDNA Master mix</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rastgele hexamers</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RT artırıcı</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verso enzim karışımı</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnaz ve RNase ücretsiz su</td>
			<td>20 µL yapmak için RNA ekledikten sonra gerekli miktar</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: RNA örneklerinden cDNA sentezi için malzemeler. CDNA sentezi için bir örnek bir ana karışım hazırlamak için ilgili maddeler miktarda gerekli.
<ol start="3"><li>Aşağıdaki sıcaklık koşulları ile termal cycler kuluçkaya: 42 ° C 30 dakika; 2 min için 95 ° C; 4 ° C kadar örnekleri topluluğu.</li>
	<li>Hemen düzenli PCR veya qPCR kullanın veya cDNA-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Dnaz/RNase-Alerjik ile ileriye ve geriye doğru astar çözümleri su 10 µM hisse senedi astar çözümden bir konsantrasyon, hazır olun.</li>
	<li>Her gen, örnek sayısına göre tespit için ayrı ana karışımları hazırlayın. Her cDNA örnek (qPCR iyi) için tepki miktarı Tablo 2göre hazırlanır.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Malzemeler</td>
			<td>Miktar (µL) / örnekleme (20 µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SYBR master mix</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer - 10 mikron ileri</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer - 10 mikron ters</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnaz ve RNase ücretsiz su</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA örnek</td>
			<td>3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: malzemeler cDNA örneklerinden nicel gerçek zamanlı PCR. QPCR için bir örnek bir ana karışım hazırlamak için maddeler miktarı gerekli.
<ol start="7"><li>Her örnek kendi wells yerleştirin.</li>
	<li>96 iyi qPCR plaka için örnek düzeni tasarlayın. Her örnek ve analiz gen için reaksiyon triplicates ya da yapmak en azından içinde çoğaltır.</li>
	<li>Optik net yapışkanlı bir kapak ile 96 iyi plaka mühür.</li>
	<li>Hızlı-spin kalıbı her kuyunun ulaşmak tepki karışım izin verin.</li>
	<li>RT-qPCR göre aşağıdaki termal degrade çalıştırın: 1) 2 min için 50 ° C 2) 95 ° C için 2 dk 3) 95 ° C 15 s 4) okuma al 5) 1,5 dk 60 ° C 6) adım 3 için 39 kez tekrarlayın</li>
	<li>Aşağıdaki termal degrade yukarıda tek ürün amplifikasyon gösteren erime eğrisi belirlemek için devamı olarak çalıştırın. 7) 0.31 min için 65 ° C 8) +0.5 ° C/döngüsü 9) plaka okuma 10) 8 için 95 ° C ulaşan kadar 60 kez yineleyin 11) 72 ° C için 2 dk</li>
</ol>4. özel Jel Elektroforez tek gen amplifikasyon onaylamak için
<ol><li>% 1'özel jel 1 x TBE tampon hazırlayın.</li>
	<li>Son konsantrasyonu yaklaşık 0,2-0,5 ulaşmak kadar sıcak (~ 50 ° C) jel etidyum bromür (EtBr) eklemek µg/mL. EtBR DNA ile bağlar ve UV jel Imager içinde ışığı altında görüntülenmeyecektir sağlar.</li>
	<li>Sıcak Jel Elektroforez jel kutusu ile sağlanan bir jel tepsi dökmek. Sıkı bir şekilde üniforma wells için sağlanan tarak iliştirin.</li>
	<li>Geri kalanı için jel ve oda sıcaklığında (RT) soğumaya ~ 30 min için izin verir.</li>
	<li>Ne zaman jel katılaşmış, jel ve tepsi jel kutuya koyun.</li>
	<li>Jel kutusu ile 1 x TBE tampon dolduramazsınız jel tamamen kaplıdır.</li>
	<li>DNA PCR güçlendirme işleminden bir UV Spektrometre kullanılarak konsantrasyonu ölçmek.</li>
	<li>~ 15 al DNA ng küçük bir PCR tüp boya 5 µL ekleyip nükleaz ücretsiz su 15 µL toplam hacmi elde etmek için gerekli miktarda ekleyin.</li>
	<li>DNA merdiven ve örnekleri kuyu yükleyin.</li>
	<li>Yaklaşık % 75-%80 aşağı jel boya çizgidir kadar jel 100 V çalıştırın. Not: jel bir negatif pozitif giderlerini yayınladığından emin olun.</li>
	<li>Jel kaldırmak ve DNA görselleştirmek için jel Imager yerleştirin.</li>
</ol>5. Hücre döngüsü analizi
<ol><li>Tohum 5 x 105 hücreleri her bir T25 cm2 şişeye örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.</li>
	<li>24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar 15 mL steril tüpler için transfer ve onları düzgün etiket.</li>
	<li>751 x g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>Artık medya kaldırmak için 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>Resuspend ve pipetting tarafından buz gibi 1 x PBS 200 µL ekleyerek Pelet kesin.</li>
	<li>Hücreleri % 70 buz gibi etanol dropwise 2 mL tüp vortexing ederken yavaşça ekleyerek düzeltmek.</li>
	<li>Tüpler, RT 30 dk için kuluçkaya ve tüpler için 1 h 4 ° C'de yer.</li>
	<li>4 ° C ve 5 min için vasıl 751 x g santrifüj tüpleri çıkarın.</li>
	<li>Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>1 x PBS propidium iyodür (50 µg/mL) ve ribonükleaz bir (200 µg/mL) ile 500 µL Ekle</li>
	<li>RT, 30 dk için örnekleri ışıktan koruyarak kuluçkaya.</li>
	<li>Akış Sitometresi verileri elde etmek. İleri en üstte ve üst tarafı dağılım (FSC FSC SSC yoğunluğu arsa ve hücre kümeleri sol alt köşesinde enkaz hariç hücrelerinin ana nüfus seçmek için SSC) vs kullanın-FSC SSC yoğunluğu arsa sağ tarafında.</li>
	<li>Hücre döngüsü aşamasını uygun yazılım ile başına hücre popülasyonlarının tanımlanması için verileri analiz.</li>
</ol>6. Apoptosis tahlil
<ol><li>Tohum 5 x 105 hücreleri her bir T25 cm2 şişeye örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.</li>
	<li>24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar 15 mL steril tüpler için transfer ve onları düzgün etiket.</li>
	<li>Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>Artık medya kaldırmak için 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>10 x 1 x ile buz gibi dH2O. Annexin V bağlayıcı arabelleğe sulandırmak</li>
	<li>1 mL 1 x V Annexin bağlama arabellek her örnek tüp ekleyin ve hafifçe resuspend.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge tüp içinde yer 96 µL of hücre süspansiyon.</li>
	<li>Annexin V-FITC eşlenik 1 µL ve propidium iyodür (PI) 12.5 µL hücre süspansiyon içeren tüp ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon buz karanlıkta 10 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Annexin V bağlama arabellek x 250 µL buz gibi 1 sulandırmak için her örnek tüp ekleyin.</li>
	<li>Akış Sitometresi ile örnekleri hemen analiz edin.</li>
</ol>7. protein ifade antikor hücre döngüsü Mikroarray tarafından
<ol><li>Tohum 5 x 105 hücreleri her T25 cm2 şişeler içinde örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.</li>
	<li>24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar 15 mL tüpler için transfer ve onları buna göre etiket.</li>
	<li>Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş lizis arabelleği 150 µL ekleyin. Damlalıklı yukarı ve aşağı yavaşça hücre zarlarında bozmaya.</li>
	<li>Herhangi bir lizis arabellek etkilenmemesi için üreticinin solvent alışverişi sütunları kullanarak etiketleme arabellek ile lizis tampon yerine bir arabellek değişimi gerçekleştirmek.</li>
	<li>Toplam protein BCA tahlil ile ölçmek.</li>
	<li>70 µg protein örneği alıp 75 µL son hacmi elde etmek için etiketleme arabellek ekleyin.</li>
	<li>Dimethylformamide (DMF) 100 µL 1 mg biotin reaktif (biotin/DMF) ekleyin.</li>
	<li>Biotin/DMF 3 µL her protein örnek (biotinylated protein örnek) ekleyin ve RT. 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>Vortexing tarafından 35 µL dur reaktif ve karışımı ekleyin.</li>
	<li>RT, örnekleri 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Böylece onlar için 1S kullanmadan önce RT için sıcak Mikroarray slaytlar buzdolabından çıkarın.</li>
	<li>Non-spesifik bağlama için 45 dk RT. az için sürekli sallayarak ile bir petri içinde % 3 kuru süt çözümde (engelleme reaktif üreticisi tarafından sağlanan) ile slaytlar kuluçka tarafından engelleme gerçekleştirmek</li>
	<li>Slaytlar GKD2O su ile yıkamak (aksi belirtilmedikçe, çamaşır GKD2O ile yer alır).</li>
	<li>Çamaşır ~ 10 x tamamen engelleme çözüm slayt yüzeyler arasında kaldırmak için adımları yineleyin. Bu bir üniforma ve düşük arka plan elde etmek önemlidir.</li>
	<li>Slayt yüzeyler arasında aşırı su çıkarın ve kuru slayt izin olmadan sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Kaplin çözüm kaplin reaktif % 3 kuru süt çözülerek hazırlayın.</li>
	<li>6 mL kaplin çözüm ve önceden hazırlanmış biotinylated protein örnek tam miktarı 7.12 adımından ekleyin.</li>
	<li>Kaplin odasının bir iyi yer bir slayt satıcı tarafından sağlanan ve protein karışımı için kaplin ~ 6 mL ekleyin. Not: Slayt tamamen protein karışımı çözüm kaplin sular altında olun.</li>
	<li>Kaplin odası kapak ve RT 2 h ile bir orbital shaker sürekli ajitasyon için kuluçkaya.</li>
	<li>Slaytları bir Petri kabına aktarın ve arabellek yıkama x 1 30 mL ekleyin. Orbital Çalkalayıcı Petri kabına koyun, 10 dakikadır sallamak ve çözüm atın.</li>
	<li>Adımı yineleyin 7.24 2 x.</li>
	<li>7,17 ve 7.18 adımlarda açıklandığı gibi kapsamlı slaytlar GKD2O su ile durulama ve hemen kurutma önlemek için sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) 30 µL algılama arabelleği 30 mL ekleyin.</li>
	<li>Slayt bir Petri kabına yerleştirin ve algılama arabelleği Cy3-streptavidin içeren 30 mL ekleyin.</li>
	<li>Orbital shaker sürekli ışıktan korunan sallayarak ile 20 dk için kuluçkaya. Not: Bir floresan boya Cy-3'tür. Alüminyum folyo ile kapatın veya floresan yoğunluğu korumak için karanlık koşullar altında çalışır.</li>
	<li>7.24 7.26 adımlarını gerçekleştirin ve kuru hava yumuşak akışı kullanarak veya bir 50 mL konik tüp ve 5-10dk için 1300 x g , santrifüj slayt yerleştirmek slayt izin.</li>
	<li>Slaydı slayt tutucu ve alüminyum folyo ile kapatın yerleştirin.</li>
	<li>Uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında Mikroarray tarayıcıyla slayt tarama. Cy3 söz konusu olduğunda, uyarma dalga boyu zirve 570 ~ ~ 550 nm ve emisyon zirvesinde yer almaktadır nm.</li>
	<li>«««Analiz) ( Tablo malzemelerigörmek) veri için kullanılan yazılım.</li>
</ol>8. RNA sıralama
<ol><li>Tohum 5 x 105 hücreleri her T25 cm2 şişeler içinde örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.</li>
	<li>24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar 15 mL tüpler için transfer ve onları buna göre etiket.</li>
	<li>RNA Bölüm 2, 1-6 adımları göre ayıklayın.</li>
	<li>Konsantrasyon ile bir bioanalyzer yanı sıra RNA kalite kontrol edin. Bir RNA bütünlük (RIN) sekiz puan ve uygun çubuk grafikler RNA kalite onaylamak gerekli.</li>
	<li>Toplam RNA, RNA (Toplam RNA üzerinden mesajcı RNA) sıralama için ~ 2 µg örnek kullanın</li>
	<li>Yeni nesil Sekanslama11kullanılarak sırası.</li>
	<li>Kalite düzeltme çalıştırmak ve makine11sıralama RNA oluşturulan FASTQ dosyalarından başvuru genom ile eşleyin.</li>
	<li>FASTQ dosyaları ve ham okuma sayısı verileri talimatları takip Genebank için upload < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> Web sitesi. Not: önceki sonuçları için katılım numarası SRP133420 bakın.</li>
</ol>9. tüp oluşumu tahlil
<ol><li>MiRNA transfected insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) 36 h sonrası transfection, anjiogenik potansiyelinin 1, adım 1-5, HUVEC hücre A549 hücreler yerine kullanarak kısmında açıklandığı gibi değerlendirmek.</li>
	<li>37 ° C % 5 CO2ile 4 h için M199 açlık medya ile HUVECs açlıktan.</li>
	<li>Düşük büyüme faktörü membran matris kabarcık oluşumu ve polimerizasyon önlemek kademeli çözdürme izin-80 ° C ve mağaza bir gecede 4 ° C'de kaldırın.</li>
	<li>Yavaş yavaş ve dikkatli 96 iyi plaka wells kabarcık oluşumu kaçınarak düşük büyüme faktörü membran matrisinin 0,04 mL ile kat. Laminar akış başlık altında tüm yordamı gerçekleştirin.</li>
	<li>96 iyi plaka bitişik wells nem korumak ve sıcaklığı korumak için PBS 0.1 mL ile doldurulması.</li>
	<li>Böylece polimerizasyon membran ekstresinin elde 96 iyi plaka için en az 20 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Daha 1 h için kuluçkaya değil.</li>
	<li>Her gruptan transfected HUVECs trypsinize ve orta M199, 1 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon içinde resuspend.</li>
	<li>Her hücre süspansiyon 0.1 mL polimerli membran matris 96 iyi plaka içeren wells ekleyin.</li>
	<li>Hazırlık büyüme faktörlerinin yer alır iken % 5 CO2 37 ° C'de 96 iyi plaka kuluçkaya. Büyüme faktörleri hazırlanması da laminar akış başlık altında yer alır.</li>
	<li>Büyüme faktörü (VEGF) son istenen konsantrasyonu (2 ng/mL nihai toplama 4 ng/mL konsantrasyona) x 2 sulandırmak ve büyüme faktörü içeren M199 açlık orta üst kısmında M199 açlık orta hücreleri ile 0.1 mL 0.1 mL ekleyin. VEGF tedavi kuyular için 0,1 mL M199 açlık orta M199 açlık orta hücreleri ile 0.1 mL üstüne ekleyin.</li>
	<li>6 h %5 CO2ile 37 ° C'de 96 iyi plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka dönemi sonunda, her şey bir dijital kamera ile bağlı bir aydınlık alan mikroskop kullanarak 4 x büyütme ile görüntü elde.</li>
	<li>Yazılım bir "angiogenez analyzer" eklenti19ile donatılmış ile işlemi görüntüler. Üç parametre, düğüm sayısı, kavşaklar ve toplam Filiz uzunluğu, anjiogenez üzerinde miRNA tedavisinin etkileri karşılaştırmak için kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Schafer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veternary+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review.</a> Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle%2C+CDKs+and+cancer%3A+a+changing+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+CDK+inhibitor+dinaciclib+suppresses+neuroblastoma+growth+via+inhibiting+CDK2+and+CDK9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity.</a> Science Repository. 6, 29090(2016).</li>
<li>Brown, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK1+structures+reveal+conserved+and+unique+features+of+the+essential+cell+cycle+CDK%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK.</a> Nature Communications. 6, 6769(2015).</li>
<li>Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+dependent+kinase+%28CDK%29+inhibitors+as+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval%3A+Ribociclib+for+the+Treatment+of+Postmenopausal+Women+with+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Advanced+or+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+targeting+cyclin-dependent+kinases+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+Novartis%27s+CDK4%2F6+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).</li>
<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Palbociclib+in+Combination+with+Fulvestrant+for+the+Treatment+of+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).</li>
<li>Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipronged+activity+of+combinatorial+miR-143+and+miR-506+inhibits+Lung+Cancer+cell+cycle+progression+and+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro.</a> Science Repository. 8 (1), 10495(2018).</li>
<li>Inamura, K., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+In+Lung+Cancer%3A+Novel+Biomarkers+and+Potential+Tools+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).</li>
<li>Mizuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+expression+signature+of+small+cell+lung+cancer%3A+tumor+suppressors+of+miR-27a-5p+and+miR-34b-3p+and+their+targeted+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes.</a> Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).</li>
<li>Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+as+oncogenes+and+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNAs as oncogenes and tumor suppressors.</a> Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).</li>
<li>Peng, Y., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MicroRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">The role of MicroRNAs in human cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+recurrence+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer+using+computer+extracted+nuclear+features+from+digital+H%26E+images%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images.</a> Science Repository. 7 (1), 13543(2017).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiegel%2C+RL+%22Cancer+Statistics%2C+2017.+CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22">Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians</a>. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Saxon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p52+expression+enhances+lung+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">p52 expression enhances lung cancer progression.</a> Science Repository. 8 (1), 6078(2018).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+Analyzer+for+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ+User+and+Developer+Conference%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis Analyzer for ImageJ.</a> ImageJ User and Developer Conference. , (2012).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25(2010).</li>
<li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).</li>
<li>Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Anti-Angiogenic+Targets+for+Monoclonal+Antibody+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).</li>
<li>Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Novel+Methods+for+Modulating+Tumor+Blood+Vessels+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment.</a> Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).</li>
<li>Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and the cell cycle.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).</li>
<li>Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+highly+parallel+detection+and+quantitation+of+specific+proteins+and+antibodies+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions.</a> Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of protein microarrays.</a> Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Science Repository. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Yazarlar Louisiana State Üniversitesi'nde John Caskey yolu analizi RNA sıralama veri ve University of Texas Southwestern Tıp Merkezi, McDermott Merkezi sonraki nesil sıralama çekirdek için onun yardımını kabul etmek istiyorum RNA sıralama ve veri çözümlemesi gerçekleştirme. Bu araştırma üniversite eczacılık, Louisiana Üniversitesi Monroe başlangıç finansman ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) aracılığıyla Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi bilim hibe 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 tarafından desteklenmiştir.

miRNAs kanser tedavisi, ifade seviyelerinde bozukluk tanıma için hedeflenmiş tedaviler olarak çalışabilir hastalıklı normal dokuların vs. Bu çalışmada potansiyel olarak birden çok aşamaları sırasında hücre döngüsü ilerleme durdurmak miRNAs belirlemek amaçlanmıştır. MiR-143 ve miR-506 hücre döngüsü bu Kombinatorik miRNA tedavinin etkinliğini anlamayı amaçlayan sunulan iletişim kuralları ve kanser hücrelerinin durdurmak tespit edilmiştir.
Açıklanan yöntemleri miRNAs fonksiyonu üzerinde kapsamlı ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.

Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Hücre döngüsü DNA ve Hücre proliferasyonu ile Mitotik süreci1tekrarını izin birden çok düzenleyici olayların bir kombinasyonudur. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) düzenleyen ve hücre döngüsü2teşvik. Bunlar arasında Mitotik CDK (CDK1) ve Interphase CDKs (CDK2, CDK4 ve CDK6) hücre döngüsü ilerleme3' te bir rol var. Retinoblastom protein (Rb) CDK4/hücre döngüsü ilerleme4izin vermek için CDK6 tarafından karmaşık fosforile ve CDK1 etkinleştirme başarılı hücre bölünmesi5için esastır. Çok sayıda CDK inhibitörleri geliştirilen ve CDKs kanser tedavisinde hedefleme potansiyeli gösteren son birkaç on yıl içinde klinik deneylere değerlendirildi. Aslında, üç CDK inhibitörleri meme kanseri tedavisi için onaylanmış olan son zamanlarda6,7,8,9,10. Böylece, CDKs, ve özellikle, CDK1 ve CDK4/6, kanser hücre ilerleme düzenlenmesinde büyük ilgi.
miRNAs (miRs) küçük, kodlamayan RNA'ların ve tüm insan genlerinin11yaklaşık % 30'u düzenleyen gen ifadesinin çoğu düzenleyiciler vardır. Faaliyetlerini translasyonel baskı ya da haberci RNA (mRNA)12bozulma dayanır. Onların biyolojik önemi açıklayıcı, 5.000'den fazla miRNAs tespit edilmiştir ve bir tek miRNA molekül birden çok gen11,13düzenleyen. Daha da önemlisi, miRNA ifade hastalık durumları, kanser13de dahil olmak üzere ve farklı hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Aslında, miRNAs kadar oncogenic ile karakterize veya tümör bastırıcılarının, teşvik veya tümör gelişme ve ilerleme14,15bastırmak için yetenekli olmak. MiRNAs hastalıklı dokuları içinde göreli ifade hastalık ilerleme düzenleyen; Böylece, miRNAs eksojen teslimini terapötik bir potansiyele sahiptir.
Akciğer kanseri olduğu önde gelen neden kanser ile ilgili ölümlerin ve daha büyük daha tüm akciğer maligniteler % 60'ı küçük hücre akciğer kanserleri16,17, 5 yıllık sağkalım oranı az % 20 ile18. MiR-143-3 p ve miR-506-3 p kullanımı son zamanlarda akciğer kanseri hücreleri11hücre döngülerle hedefleme için değerlendirilmiştir. miR-143 ve miR-506 tamamlayıcılık CDK1 ve CDK4/CDK6 dizileri ve A549 hücreleri bu iki miRs etkilerini analiz edildi. Deneysel detayları sundu ve bu yazıda ele. Gen ifadesinin, hücre döngüsü ilerleme ve Apoptozis farklı deneysel tasarım ve transfection takip timepoints kullanarak değerlendirildi. Biz gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemleri ile birlikte Mikroarray analiz belirli bir gen ifade ölçmek için kullanılan ve yeni nesil RNA sıralama küresel gen bozukluk11belirlemek için kullanılmıştır. Genler binlerce tek bir deneysel analizi analiz edilebilir iken ikinci yöntemi ile yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik, her genin transkript göreli bolluk tanımlar. Ayrıca, apoptotik analiz miRNA tedavi nedeniyle yapıldı ve burada anlatılan. Biyoinformatik yolu analiz desteklenmiştir. Burada sunulan iletişim kuralları analiz tedavi için Kombinatorik miR-143, potansiyel ve miR-506 kullanılır.
Ana amacı bu iletişim kuralı, miRNAs hücrelerde, hücre döngüsü odaklanarak etkilerini belirlemektir. Çeşitli teknikler burada yayılma alanından gen ifade analizi öncesi çeviri (ayrıntı için qPCR kullanarak) ve yeni sunulan teknikleri gen Analizi Mikroarray çözümlemesi gibi protein düzeyinde için. Bu rapor araştırmacılar miRNAs ile çalışmak için yararlıdır umulmaktadır. Ayrıca, metodoloji Apoptozis hücre ve hücre döngüsünün akış sitometrik analizi için sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>-80 derece ve derece; C Dondurucu</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>CELLTREAT Scientific&nbsp;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Mikro Kuyu Plakaları&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>ATCC ve nbsp; CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938c</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Susturucu Negatif Kontrol No. 1 siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik Çözelti (100x)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062 &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Antikor Dizi Test Kiti, 2 Reaksiyon</td><td>Dolunay Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>Parlak alan mikroskobu&nbsp; &nbsp;</td><td>Mikroskoptik&nbsp;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>Parlak alan mikroskobu&nbsp; &nbsp;</td><td>New Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre Döngüsü Antikor Dizisi, 2 Slayt</td><td>Dolunay Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Mantığı+ Biyogüvenlik Cabinate</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD biyobilim</td><td>Adım 5.14; 6.13: Hücre döngüsü&nbsp; fazına göre popülasyon dağılımını hesaplamak ve analizi için popülasyon dağılımını hesaplamak için kullanılır. apoptozis&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Gerçek Zamanlı Sistem</td><td>BioRad</td><td>CFX96 Optik Modülü</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc Touch Görüntüleme Sistemi</td><td>BioRad</td><td>Chemidoc Dokunmatik Görüntüleme Sistemi</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi</td><td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kamera</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g / L Glikoz, Sodyum Pirüvat olmadan, L-Glutamin</td><td>VWR</td><td>ile VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Zymo Research</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)</td> <td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipet Pick-A-Pack Setleri</td><td>Eppendrof</td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Mutlak (200 Kanıt), Moleküler Biyoloji Sınıfı,&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Besin Karışımı (Kaighn's Mod.), L-glutamin, Corning</td><td>Corning</td><td>45000-354</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur Flowcytometer</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - Premium</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Basix Standart Çıtçıtlı Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Fisherbrand Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Forma Seri II su ceketi CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin Çözeltisi (5000 U/mL)</td><td>Hospira</td><td>NDC # 63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>Horixontal Elektroforez sistemi</td><td>Tezgah Üstü laboratuvar sistemi</td><td>BT102</td><td></td></tr>, <tr><td>miR-143-3p, miRNA,</td><td>ABM'yi</td> taklit <td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>, miR-506-3p, miRNA,</td><td></td><td></td> İnsan Rekombinant Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) MCH02824 <td></td>ABM</tr><tr><td>PHC9394'yi</td><td></td> taklit eder.<td> &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri (HUVEC)</td><td>Bireysel bağışçılar</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Yaratıcılık Yolu Analizi</td><td>Qiagen</td><td>Sonuçları: Biyoinformatik yol analizi</td><td></td>için kullanılır</tr><tr><td>Invitrogen UltraPure DNase / RNase İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>Lipofiktamin 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>Yükleme boyası 10X</td><td>koğuşun bilimi+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Orta M199 (Earle&prime ile; s tuzları, L-glutamin ve sodyum bikarbonat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Dijital Kamera</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity Yazılımı</td><td>Adım 5.15: Hücre döngüsü popülasyon dağılımlarının</td><td></td>analizi için alternatif yazılım</tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Power UP sybr green master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>Probidium İyodür</td><td>MP Biochemicals LLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HT Mikrodizi tarayıcı</td><td>Perkin elmer</td><td>ASCNPHRG. 543 nm'de uyarma lazer dalga boyu kullandık.</td><td></td></tr><tr><td>q PCR optik yapışkan kapak</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı RNA Kitleri</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından Ribonükleaz</td><td>A Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>Adım 7.33: Mikrodizi analiz yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube Santrifüj Tüpleri 15ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube Santrifüj Tüpleri 50ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tampon, 20x sıvı</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü ve nbsp; santrifüj matchine</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü mikro santrifüj matchine</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific BioLite Hücre Kültürü ile İşlenmiş Şişeler</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce BCA Protein Testi</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA Tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Thermo-Fast 96 Kuyulu Tam Etekli Plakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Verso cDNA sentez Kiti (100 çalışma)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Düşük Aralıklı DNA Merdiveni</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>VWR standart katı kapılı laboratuvar buzdolabı</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombinatorik mirna düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Akciğer kanseri (LC) kanser bağlı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. Diğer kanser hücrelerinin, LC hücreleri temel karakteristik düzensiz yayılması ve hücre bölünmesi benzer. Hücre döngüsü ilerleme durdurma tarafından yayılması inhibisyonu LC dahil olmak üzere kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım gibi gösterilmiştir.
miRNA therapeutics önemli çoğu gen düzenleyiciler ortaya çıkan ve giderek kanser tedavisinde kullanılmak incelendiği. Son çalışmada, iki miRNAs, miR-143 ve miR-506, hücre döngüsü ilerleme düzenlemek için kullanılan. A549 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücreleri transfected, gen ifade değişikliklerini analiz edildi ve apoptotik etkinliği nedeniyle tedavi sonunda analiz edildi. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) downregülasyon algılandı (yani, CDK1, CDK4 ve CDK6), ve hücre döngüsü G1/S ve G2/M faz geçişleri durdurdu. Yolu analiz yaklaşım çok yönlü aktivitesiyle endows tedavinin potansiyel anjiogenik faaliyet göstermiştir. Burada açıklanan angiogenez inhibisyonu tarafından miRNA aktiviteyle ilgili hücre döngüsü inhibisyon, Apoptozis indüksiyon ve endotel hücreleri tedavisinin etkileri tanımlamak için kullanılan yöntemleri vardır. Burada sunulan yöntemleri gelecekteki araştırma miRNA therapeutics ve karşılık gelen etkinliğini destekleyecek ve temsilcisi veri deneysel analizleri sırasında diğer araştırmacılar rehberlik edecek umulmaktadır.

RT-qPCR ve Jel Elektroforez kullanarak gen ifade analizi
RT-qPCR kullanarak farklı gen ifade analizi önemli downregülasyon hedeflenen genlerin CDK1, CDK4 ve CDK6 gösterdi. CDK1 ve CDK4/6 sırasıyla G2/M ve G1/S geçişleri için etkili olduğu gösterilmiştir. Gerçekleştirilen analiz bireysel miRs ve Kombinatorik miR aktivite arasında doğrudan karşılaştırma izin. Scramble siRNA yordamdan gelen herhangi bir müdahale de...

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Bu yöntem, in vitro akciğer kanseri hücrelerinde iki mikroRNA aktivitesini belirlemek için gerekli laboratuvar teknikleri anlamak ve gerçekleştirmek yardımcı olacaktır. Akciğer kanseri dünya çapında kansere bağlı ölüm önde gelen nedenidir. Burada, temel laboratuvar metodolojilerinden gen ekspresyonu analizi ve antikor protein mikroRNA'sı gibi daha karmaşık protokollere kadar uzanan ve özellikle mikroRNA'nın eylemlerinin etkisini tanımlamak için kullanılan teknikler salıyoruz.Aşağıdaki yöntemler bize iki mikroRNA, microRNA 143 ve microRNA 506 etkisi ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olacaktır, akciğer kanseri hücrelerinde hücre döngüsünü düzenleyen. Hücre transfeksiyonu, RNA ekstraksiyonu, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve mikroRNA analizi gibi farklı laboratuvar tekniklerini saklı atıyoruz. Sunumumuzun bu analizlerin başarıyla tamamlanmasına katkıda bulunacağını umuyoruz.İlk olarak, qPCR veya mikro dizi analizi kullanarak gen ekspresyonu gerçekleştirmek için, RNA ve protein ekstraksiyonu için yeterli uygun bir şişe kültürlü hücreleri koltuk. Sonra medya ile bir gecede kuluçka 10 yüzde FBS ve yüzde 1 penisilin streptomisin ile takviye. Ertesi gün, her biri 100 nanomolar konsantrasyonda ortamda mikroRNA 143 ve mikroRNA 506'yı seyrelterek mikroRNA örneğini transfeksiyon için hazırlayın.Kuvözdeki şişeyi çıkarın ve ortamı çıkarın. 1x PBS ile yıkayın. İşlenmemiş tüm denetimler yalnızca hücreleri olan eksik ortam içerir.Hücreleri transfeksiyon media ile altı saat kuluçkaya yatırın. Altı saat sonra, ortamı çıkarın ve dört mililitre taze, eksiksiz ortamla değiştirin. 24 saat ve 48 saat sonra trypsinizasyon ile hücreleri hasat.Daha sonra, her tüpte 1x PBS ile iki kez yıkayın ve supernatant çıkarın. Daha sonra RNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek için, eksi 80 santigrat derece hücreleri dondurmak. RNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatları doğrultusunda bir RNA kiti kullanılarak gerçekleştirildi.İlk olarak, eksi 80 santigrat derece tüpleri çıkarın ve çözülmeye izin verin. Hücre zarını kırmak için 300 mikrolitre lysis tampon ve pipet ekleyin. Yüzde 100 ultra saf etanol eşit hacim ekleyin.Sonra iyice karıştırın ve ayrı sütunda yerleştirin. Santrifüj ve akış-through kaldırın. Tampon kaldırmak için yıkama ve tampon ve santrifüj 400 mikrolitre ekleyin.Her numunede 75 mikrolitre VNA sindirim tamponu ile 5 mikrolitre DNAse 1 ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra numuneyi 400 mikrolitreRNA hazırlık tamponu ile yıkayın. Daha sonra, RNA yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.Şimdi, sütuna çekirdeksiz su ekleyin, santrifüj ve sonra RNA toplamak. RNA konsantrasyonu ölçün. Bu aşamada, RNA dizilimi için iki mikrogram RNA örneği gönderilebilir.Termocycler kullanarak, metin bölümünde açıklanan protokole göre cDNA hazırlayın. 10 mikromolar konsantrasyonuna DNAse RNAse içermeyen su ile ileri ve geri astar çözeltileri hazırlayın. Her genin örnek sayısına göre tespit edilmesi için bir ana karışım hazırlayın.Her cDNA örneği için reaksiyon miktarı metinde açıklanan tabloya göre yapılır. Her örneği kendi kuyularına yerleştirin. QPCR için, örnekleri takip etmek için 96 iyi plaka düzenine sahip bir Excel belgesi hazırlamak her zaman iyidir.Her örnek ve analiz gen için, üçlemeler, ya da en azından yinelenen ler kendi reaksiyon gerçekleştirmek. Plastik plakayı şeffaf, optik berrak plastik mühürleyici ile kapatın. Bu yanlış sinyal üretebilir gibi, parmakları ile ince, plastik tabaka dokunmaktan kaçının.Hızlı bir şekilde kendi kuyuların altına tüm reaktifler karıştırmak için plaka spin. Ardından, örnek plakayı nicel, gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanarak çalıştırın. QPCR makinesi tarafından oluşturulan CT değerlerini alın ve bağıl gen ekspresyonu için analiz edin.Bu videonun önceki bölümünde açıklandığı gibi hücreleri transfect. Ayrı her örnekten hasat hücreleri, tripsinizasyon için 15 mililitre steril tüpler. Daha sonra hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın, 751G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.Bir pipet aracılığıyla 200 mikrolitre buz gibi 1x PBS ekleyerek paleti yeniden askıya alın ve kırın. Hücreleri düzeltmek için tüpü nazikçe girdap larken, yüzde 70 buz gibi etanol, tüp için damla akıllıca iki mililitre ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve bir saat boyunca dört derece ye yerleyin.Tüpleri dört santigrat dereceden ve santrifüjden çıkarın. 2ml buz gibi PBS ve girdap ekleyin ve sonra santrifüj ile supernatant kaldırın. Her numuneye sırasıyla, her numunede, konsantrasyonu 50 ve 200 mikrogram olan propidium iyodür ve ribonükle azas a içeren 1x PBS'nin 500 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Numuneleri ışıktan koruyarak uygun tüplere aktarın ve akış sitometresi üzerinde çalıştırın. Bu deney, mikroRNA tedavisi ile değiştirilen tüm hücre döngüsü yolu proteinlerinin ekspresyonunu belirlemektir. Transfeksiyon bölümünde açıklanan prosedüre göre protein örnekleri toplayın ve BCA testi ile ölçün.Oda sıcaklığına getirmek ve nemi gidermek için denemeden bir saat önce slaytları eksi dört santigrat dereceden çıkarın. 70 mikrogram protein örneği alın ve üreticinin talimatlarına göre örnek slaytlar hazırlayın, bu da metin bölümünde adım adım açıklanmıştır. Burada dikkat etmek için, ultra saf deiyonize su ile slaytlar düzgün yıkama başka önemli bir adımdır, Bu slaytların arka plan azaltmaya yardımcı olacaktır gibi.Ayrıca, bu denemede örnek slaytları son adıma kadar kurutmamak çok önemlidir. Son olarak, mikro dizi makinesini kullanarak slaydı tarayıp verileri analiz edin. CDK1, CDK4 ve CDK6 gen ekspresyonunu belirlemek için mikroRNA ile tedavi edilen örneklerin qPCR analizi yapıldı.Bu genler normal ve kanser hücrelerinin hücre döngüsünü düzenleyen, ve tümör ilerlemesini inhibe etmek için bir araç olarak hedeflenmiştir. Veriler mikroRNA 143 ve 506 ile tedavi nedeniyle bu genlerin downregulatory etkisini göstermiştir. Akış sitometrisinden elde edilen hücre döngüsü dağılım verileri G0 ve G1 fazında bir popülasyon artışı ve mikroRNA 143 ve 506'nın kombinatoryal tedavisinin etkisiyle S fazında popülasyon azaldığını göstermiştir.Hücre döngüsünün spesifik mikro dizi analizinde yaklaşık 60 genin protein ekspresyonu değişiklikleri tespit edildi. Temsil edilen ısı haritası, CDK2, Helen 1 ve 3, RE2F1 gibi hücre döngüsünün ilerlemesi ve çoğalması için gerekli olan birden fazla genin protein düzeyinde ki regülasyonu göstermiştir. Buna karşılık, proteinler yaygın olarak yetiştirilen inhibitör etkisi ile tanınan upregulated edildi.Sonuçlar yarı-nicel olmasına ve daha fazla analiz gerektirmese de, mikro dizi analizi yolun aktivitesine hızlı bir genel bakış sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerdeki mikroRNA aktivitesinin tanımlanmasında size yardımcı olacak temel ve karmaşık laboratuvar deneylerini gerçekleştirebileceğinize inanıyoruz.

analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Bu video, miRNA transfekte edilmiş akciğer kanseri hücrelerinden RNA ekstraksiyon protokolünü açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre döngüsünü ve anjiyogenezi durdurmada kombinatoryal bir miRNA tedavi aktivitesini tanımlamak için kullanılabilir.

RNA Ekstraksiyon Testi: miRNA Transfekte Edilmiş Akciğer Kanseri Hücrelerinden RNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

miRNA veya mikroRNA, hücre döngüsü ilerlemesinin temel düzenleyicileridir. Bu video, miRNA'nın hücre döngüsü regülasyonu üzerindeki etkisini incelemek için miRNA ile transfekte edilen akciğer kanseri hücrelerinin akış sitometrisi tabanlı hücre döngüsü analizini açıklar. Hücre döngüsü ilerlemesini durdurarak proliferasyonun inhibisyonu, kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım olma potansiyeli göstermiştir.

Hücre Döngüsü Analizi: miRNA ile Transfekte Edilmiş Akciğer Kanseri Hücrelerinin Hücre Döngüsü Düzenlemesini İncelemek İçin Bir Yaklaşım

Bu videoda, spesifik gen ekspresyonunu ölçmek için antikor mikrodizisi kullanarak miRNA transfekte edilmiş akciğer kanseri hücrelerindeki protein ekspresyonunu inceleme tekniği açıklanmaktadır. Özellikli protokolde, hücre döngüsünü ve anjiyogenezi durdurmada kombinatoryal bir miRNA tedavisinin aktivitesinin tanımlanması için antikor mikrodizisi gerçekleştiriyoruz.

Antikor mikrodizisi: miRNA ile tedavi edilen akciğer kanseri hücrelerinin protein ekspresyonunu incelemek için bir teknik

Bu video, ortotopik fare modellerinde tümör büyümesine karşı terapötik ajanlar olarak miRNA inhibitörlerinin in vivo olarak verilmesini göstermektedir. Sentetik miRNA inhibitörlerinin veya antagomiR'lerin intratümöral uygulaması, bunların endojen miRNA'ları bağlamasına ve inhibe etmesine izin verir, böylece mRNA upregülasyonuna ve tümör büyümesinin baskılanmasına neden olur.

miRNA İnhibitörleri ile İntratümöral Tedavinin Modellenmesi: Murin Modelinde miRNA İnhibitörlerinin Tümör Büyümesi Üzerine Etkisini Analiz Etmek İçin Bir Yöntem

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Keşfedin miR-143 ve miR-506'nın akciğer kanserinde hücre döngüsü ve anjiogenezi düzenleme yöntemlerini. Hücre transfeksiyonu, RNA izolasyonu ve qPCR teknikleriyle terapötik potansiyeli değerlendirin.

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Daha fazla video keşfet