Bir In vitro Batch-kültür modeli ınsan dışkı microbiota üzerinde girişimsel rejimlerin etkilerini tahmin etmek

Çeşitli insan hastalıklarında bağırsak mikrobiyomu ortaya çıkan rolü göz önüne alındığında, probiyotikler gibi çeşitli bağırsak mikrobiyom modülatörleri, prebiyotikler, diyetler ve ilaçlar bağırsak mikrobiyom ilişkili sağlık rahatsızlıkları iyileştirilmesinde yardımcı olabilir. Ancak hiçbir hızlı ve uygun fiyatlı tarama sistemi gibi bağırsak mikrobiyom modülatörleri etkilerini tahmin etmek için kullanılabilir, ama bu sistem belirli müdahaleler sonuçta ev sahibi sağlığını etkileyebilir bağırsak mikrobiyomu etkileyebilir nasıl tahmin etmek için yeterince basittir. Bu protokol, bağırsak mikrobiyom modülatörlerini ve bunların mikrobiyota ve ev sahibi sağlığı üzerindeki etkilerini araştıran laboratuvarlar için basit, uygun fiyatlı ve pratiktir.

Aseptik ve anaerobik koşulların bakımı bu deney için çok önemlidir. Ayrıca dışkı numunesi topunatıldıktan hemen sonra yeniden kullanılmalıdır. Aksi takdirde deney daha sonra planlanırsa, numune toplama sırasında ortam sıcaklığına ve havaya maruz kalmadan hemen eksi 80'de saklanmalıdır.

Aliquot hazırlama ve pipetleme sırasında taşıma doğruluğu, doğruluğu ve tekrarlanabilirliğini korumak için de önemlidir. Gündüz 12 saatten az sürer. Örneklere 24 saat içinde ihtiyaç duyarlarsa bir gecede bir kültür oluşturabiliriz.

Sonra, kısa zincirli yağ asitleri ve mikrobiyom tayini izledi. Bu süreç iki büyük uni öğrenci, Shokouh Ahmadi ve Rabina Mainali benim laboratuvar dan gösterilecek. Bir duman kaputu altında fermantasyon ortamı hazırlamak için, mıknatıs karışımı üzerinde bir reaktif şişede, mix çözeltisi A, çözelti B, iz mineral çözeltisi, suda çözünür vitamin çözeltisi, folat biotin çözeltisi, riboflavin solüsyonu, hemin çözeltisi, kısa zincirli yağ asidi karışımı ve rezazurin.

Sonra şişe maya özü, sodyum karbonat, sistein hidroklorür monohidrat ve triptivaka ekleyin. 296,1 mililitre distile su ekleyin, pH'ı normal bir hidroklorür veya sodyum hidroksit le ayarlayarak 7,0 civarında olduğundan emin olun. Kabı bir aseptik iş istasyonuna aktarın ve sterilizasyon için ortamı filtrelemek için 0,22 mikrometre de gözenek boyutunda bir vakum filtresi kullanın.

Bir litre anaerobik seyreltme çözeltisi hazırlamak için, iyonize suda beş gram sodyum klorür, iki gram glikoz ve 0,3 gram sistein hidroklorür monohidrat çözün. 121,1 santigrat derece 15 dakika kapağı ile reaktif şişe autoclave ve anaerobik oda içinde saklayın. Fermantasyon deneyi başlamadan önce, herhangi bir kalıntı oksijenin uzaklaştırılmasını sağlamak için fermantasyon deneyi için gerekli tüm malzemeleri, çözümleri ve araçları en az 48 saat boyunca anaerobik oda içinde saklayın.

Fermantasyon deneyinden en az 24 saat önce, 300 miligram inülin ağırlığında ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, bu da anaerobik odanın içine yerleştirilir. Tüpün içine 26 mililitre sterilfermantasyon ortamı ekleyin ve karıştırmak için girdap. Yaklaşık 24 saat boyunca lif hidrasyon sağlar.

Fermantasyon deneygünü, dışkı inoculum hazırlamak. İlk olarak, 50 mililitrelik konik bir tüp içinde taze dışkı örneği beş gram tartın. 50 mililitrelik son bir hacme ulaşmak için tüpe anaerobik seyreltme çözeltisi ekleyin.

Girdap 15 dakika, ya da tamamen homojenize olana kadar. Aşılanmış tüpleri anaerobik odanın içinde 37 derecede tutun ve lifleri ve inoculumu yeniden askıya almak için her saat başı hafifçe ters çevirin. Üç, altı, dokuz veya 24 saat sonra, fermente ortam uygun miktarda almak ve 14, 000 kez g dört derece santigrat 10 dakika için örnekleri santrifüj.

Hemen sıvı azot supernatant ve pelet dondurma, sonra snap donma sonra, kısa zincirli yağ asitleri analizi için supernatant saklamak ve mikrobiyom analizi için pelet, eksi 80 santigrat derece. Bu protokol belirli bir prebiyotik etkisini göstermek için kullanılır. Sağlıklı insan deneklerin dışkı, inulin ile tedavi sonrasında, dokuz saat boyunca nispeten istikrarlı pH gösterdi, 24 saat sonra önemli ölçüde düştü.

İnülin aşısı, inülin leziz dışkı örneğinde kısa zincirli yağ asitleri ve laktat düzeylerini önemli ölçüde artırmıştır. Ana koordinat analizi, inulin tedavi edilen ve tedavi edilmeyen numuneler arasında beta çeşitliliğinin ağırlıklı ve ağırlıksız UniFrac ölçülerine göre farklı mikrobiyota bileşimi gösterir. PD bütün ağaç, tür zenginliği, operasyonel taksonomik birimler, tür eşitliği, yanı sıra büyük phyla ve cins göreceli bolluk yoluyla filogenetik çeşitlilik karşı alfa çeşitliliği ve indeksler, tüm mevcut farklı bağırsak mikrobiyota imzaları inulin tedavi ve tedavi edilmemiş örnekler arasında.

16S dizilerinin lineer ayrımcı etki boyutu analizinden elde edilen taksonomik cladogram, farklı örnek grupları arasındaki farklı lıkta bol taksonayı temsil eder. Tüm adımları dikkatle izleyin. En önemli şey sıkı aseptik ve anaerobik koşulları korumaktır.

Supernatant ve deneyden liflerin fermantasyon sonucu kısa zincirli yağ asitleri düzeyi değişiklikleri tedavi etmek için kullanılabilir. Ayrıca, pelet bağırsak mikrobiyom bileşimi değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir. Kültür medyası yapımında kullanılan bazı kimyasallar potansiyel olarak tehlikelidir.

Lütfen MSDS sayfasını inceleyin ve buna göre önlem alın.