Name: Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin, kanser hücreleri gibi yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması için güvenilir bir yöntem. Bu protokol, kılcal elektroforez-kütle spektrometresi ile metabolomik analiz için optimize edilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onların yardımı için Shonai bölgesel Sanayi Promosyon Merkezi tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Yamagata Prefecture ve Tsuruoka City araştırma fonları tarafından, Ulusal Kanser Merkezi araştırma ve Geliştirme Fonu [Grant numarası 28-A-9] tarafından ve Japonya Derneği tarafından bilim tanıtımı için desteklenmektedir (JSPS) KAKENHı [Grant numarası 17K07189] için HM.

1. gün hücre kültürü 1
Not: metabolit ekstraksiyon için her örnek, orta ama tam olarak (yaklaşık 2 – 5 milyon hücre içeren) tek bir 100 mm doku kültürü çanak hazırlanmalıdır. Tahlil için gerekli yemek sayısını hesaplayın ve buna göre hazırlayın.
<ol><li>Kültür HCC827 ve PC-9 hücreleri 5% CO2 at 37 ° c rpmi-1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile tamamlayıcı.</li>
	<li>100 mm Kültür yemeklerinden hücre kültürü medyasını aspirate.</li>
	<li>Kalsiyum ve magnezyum olmadan 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi kullanarak her bir çanak üzerinde yıkayın hücreleri. PBS çözeltisi tamamen çanak yüzeyini kapsar, böylece yavaşça her çanak kaya.</li>
	<li>Kültür yemeklerinden yıkama tamponunu aspirate.</li>
	<li>Sıcak 0,25% Trypsin-EDTA çözeltisi 37 °C ' ye ve 5 mL serolojik pipet ile 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Yavaşça her yemek böylece tripsin tamamen çanak yüzeyini kapsar kaya.</li>
	<li>37 °C ' de kültür yemeklerine yaklaşık 5 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Yemek başına ön ısıtılmış tam büyüme orta 4 mL ekleyin. Birkaç kez hafifçe pipetleme tarafından orta hücreler resuspend.</li>
	<li>Her bir hücre süspansiyonunu ayrı bir 15 mL Konik Tüpe aktarın ve 800 × g 'de Santrifüjlü 5 dk.</li>
	<li>2 ml önceden ısıtılmış komple büyüme orta her hücre Pelet resuspend.</li>
	<li>Otomatik hücre sayacı ve 0,4% tripan mavi çözüm kullanarak hücrelerin toplam sayısını ve yüzde canlılığı belirleyin.<ol>
<li>10 μL hücreli süspansiyon ve 10 μL 0,4% tripan mavi çözeltisi karıştırın.</li>
		<li>10 μL örnekteki hücre sayma bölmesi kaydırağı içinde kapiller eylem yükleyin.</li>
		<li>Oda slaytı otomatik hücre sayacına yerleştirin. İletilen ışık otomatik olarak aydınlatır ve cihaz otomatik olarak hücreye odaklanır.</li>
		<li>Görüntüyü yakalamak ve sonuçları görüntülemek için Capture düğmesine basın.</li>
		<li>Gerekirse, istenilen hücre konsantrasyonunu elde etmek için daha fazla büyüme ortamı ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mm hücreli kültür çanak başına yaklaşık 1 – 2.5 milyon hücre tohum. Not: CE-MS analizine göre belirlenen metabolit konsantrasyonları, uygun hücrelerin sayısına göre normalleştirilir. Hücre sayımı amacıyla, her grup için en az bir ekstra seribaşı kültür çanak hazırlamak gerekir.</li>
	<li>37 °C ' de 18 saat için% 5 CO2 ' de kültür yemeklerini kulbe etmek.</li>
</ol>2. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>L-metionine sülfona karaciğerde dönüştürülür ve d-Camphor-10-sülfonik asit 1000-Ultra Apure su dahil olmak üzere ticari bir iç standart çözüm seyreltilen. Not: 80 ' den az numune için, sadece 50 μL iç standart çözüm 1 ve 45 ml Ultra saf su için bir 50 ml hacimsel Flask, sonra çözüm kadar 50 ml Ultra saf su ile getirmek.</li>
	<li>0,05 g/ml mannitol çözeltisi yıkama tamponu olarak ultra saf suda hazırlayın. Not: 30 ' dan az numune için 500 ml 'lik Ultra Saf suyla 25 gr mannitol çözülür. 100 mm Kültür çanak başına yaklaşık 15 mL yıkama tamponu gereklidir, bu nedenle numune sayısına göre yeterli miktarda yıkama tamponu hazırlayın.</li>
</ol>3. santrifüj filtre üniteleri ön yıkama
<ol><li>Pipet 250 her santrifüj filtre ünitesinin filtre bardağı içine ultra saf su μL ( malzeme tablosunabakın). Not: örnek başına Iki filtre birimi gereklidir.</li>
	<li>Filtre birimlerini sıkıca kapa ve 9.100 × g 'de 4 °c ' de 5 dakika santrifüjün.</li>
	<li>Her süzgecin hacmini kontrol edin — ilk kısa Spin sırasında önemli filtrat birikirse, filtre ünitesi arızalı olabilir. Bu durumda, filtre birimini atın ve bunun yerine yeni bir filtre ünitesi kullanın.</li>
	<li>Filtre ünitelerinin kapakları sıkıca kapatın ve 9.100 × g 'de 30 dakika boyunca 4 °c ' de tekrar santrifüjün.</li>
	<li>Filtre bardakları herhangi bir ultra saf su kalır emin olun; Her bir toplama tüpünde süzülmüş ultra saf suyu bir pipet ile çıkarın ve atın. Not: filtreye zarar verebilmek için bir filtre bardağın içinde kalan suyu pipet ile kaldırmaya çalışmayın.</li>
	<li>Filtre bardakları toplama tüplerine değiştirin. Not: santrifüj filtre ünitelerini bir saat içinde kullanın, çünkü filtreler kurutulduktan sonra hasar görebilir.</li>
</ol>4. gün hücre kültürü 2
<ol><li>
100 mm Kültür yemeklerini kuluçlatıcından çıkarın. Not: önerilen hücre kültürü süresi 18 h 'dir.</li>
	<li>Her 100 mm Kültür çanak hücre kültürü orta aspirate.</li>
	<li>Hücre katmanını rahatsız değil bakım alarak, her çanak için bileşiklerin veya ilaçların uygun konsantrasyonları içeren hücre kültürü orta 10 mL ekleyin. Not: Gösterim amacıyla, bu deneyde PBS 'de (250 μM son konsantrasyon) çözülmüş 10 μL 250 mM diamid ekledik.</li>
	<li>37 ° c 'de kültür yemeklerini diamid veya PBS 'de kontrol olarak 30 dakika süreyle kulyın.</li>
	<li>Her 100 mm Kültür çanak hücre kültürü orta aspirate.</li>
	<li>Her bir yemeğin kenarına hafifçe 2 mL% 5 mannitol çözeltisi ekleyerek hücreleri yıkayın, hücre tabakasını rahatsız etmek için değil, daha sonra biraz çanak eğim özen. Not: PBS veya tuz çözeltisi CE-MS tabanlı metabolomik analizlerle müdahale eder ve ölçüm sonuçlarını olumsuz yönde etkiler ve böylece yıkama tamponu olarak kullanılmamalıdır. </li>
	<li>Her kültür çanak yıkama tamponu aspirate, sonra hafifçe çanak başına yıkama tampon 10 mL ekleyerek ve biraz çanak eğerek hücreleri tekrar yıkayın.</li>
	<li>Tamamen her kültür çanak kenarından yıkama tampon Aspire. Not: hücreleri Aspire değil dikkat ederken, mümkün olduğunca çok yıkama tampon Aspire. Kalan mannitol CE-MS analizine engel olabilir; hücrelerin aspirasyonu hücre sayısını azaltır ve böylece veri normalleştirme bir hata kaynağı haline gelir.</li>
</ol>5. kültürlü hücrelerden metabolitlerin çıkarılması
<ol><li>Kültür çanak başına 99,7% metanol 800 μL ekleyin. Yavaşça tüm yüzeyi kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak kaya. Yemekleri oda sıcaklığında 30 s için bırakın.</li>
	<li>Pipetin ucunu metanol içine daldırarak ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, tabak başına seyreltilmiş iç standart çözeltinin 550 μL değerini yavaşça ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça tüm yüzeyi kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak kaya.</li>
	<li>Yemekleri oda sıcaklığında 30 s için bırakın.</li>
</ol>6. hücre ekstraktlarının ultrafiltrasyonu
<ol><li>Her kültür yemeğinden çıkarılan solüsyonu ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>5 dk için 4 °C ' de 2.300 × g 'de tüpleri santrifüjün.</li>
	<li>Her bir süpernatant 350 μL 'yi örnek başına iki santrifüj filtre birimine aktarın. Not: her kültür çanak, toplam 700 μL ayıklanan çözüm iki filtre tüpleri (350 μL/tüp) aktarılır.</li>
	<li>Filtre tüplerini yaklaşık 2 saat için 9.100 × g olarak 4 °c ' de Santrifüjden ayırana kadar hiçbir sıvı süzgeç bardakları içinde kalmaz.</li>
	<li>Filtre bardakları çıkarın ve sıkıca toplama tüpleri kapakları kapatın.</li>
</ol>7. örnek buharlaşma
<ol><li>Bir santrifüj Buharlaştırıcı hazırlayın-genellikle, bu bir evaporatör oluşur, bir soğuk tuzak, ve bir vakum pompası.</li>
	<li>Toplama tüplerini santrifüj evaporatörün içine yerleştirin. Not: tüplerin kapaklarının açık olmasını bırakın.</li>
	<li>Ayıklanan numune solüsyonları, vakum koşullarında oda sıcaklığında Buharlık yapın. Not: rotasyonlar ve basınç sayısı için tipik konfigürasyonlar 1.500 rpm ve 1.000 PA, sırasıyla, ve genellikle yaklaşık alır 3 tamamen örnekleri Buharlık saat.</li>
	<li>Hiçbir sıvı toplama tüpleri içinde kalır ve sıkıca tüpler kapakları kapatın onaylayın.</li>
	<li>Toplama tüplerini Ultra düşük sıcaklıkta (− 80 °c) derin dondurucu ile metabolomik analizine kadar saklayın.</li>
</ol>8. CE-MS tarafından metabolomic Analizi
<ol><li>CE-MS analizinden hemen önce 50 μL ultra saf su içinde filtrat yeniden resuspend.</li>
	<li>Daha önce12,13 kapiller elektroforez sistemi ve izokrat pompa, CE-MS adaptörü ve CE-ESI-MS püskürtücü ile donatılmış uçuş zaman kitle Spektrometre sistemi kullanılarak açıklanan yöntemlerle CE-MS analizi gerçekleştirin. Not: her iki sistemde de sistem satıcılarının yazılımı tarafından kontrol edilebilir ve erimiş silika kapiller (50 μm iç çapı × 80 cm toplam uzunluğu) ile bağlanır.<ol>
<li>Enstrümanlar ve numune şişeleri ayarlayın, kapiller bir kapiller kaseti ile hazırlamak, kılıf sıvıları ve uygun Elektroforez tamponları anyon veya kstasyon analiz moduna bağlı olarak doldurmak ve sonra gerilimler uygulanır. Not: enstrümantasyon ve analitik koşullar,12,13başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.</li>
		<li>Yazılımı açın ve veri alma yöntemleri ve örnek bilgileri içeren bir çalışma listesi hazırlayın.</li>
		<li>Bir test çalışması başlatın ve sinyal yoğunluğu ve iç standartların tepe şekli ve diğer standart bileşiklerin tepe çözünürlüğü gibi verileri kontrol edin.</li>
		<li>Gerekirse analitik koşulların ince ayarını yapın.</li>
		<li>Örnek çözümleri 3 s için 50 mbar 'a ve 30 kV 'lik bir gerilime enjekte edilir. Not: CE-MS ya pozitif ya da negatif iyon modunda yürütülmüştür. M/z 50 – 1000 kitle aralığını taramak için Spektrometre ayarlayın. Kapiller voltajı 4 kV olarak ayarlandı; Azot Gazı debisi (ısıtıcı sıcaklığı 300 °C). Pozitif mod için, fragmentor, Skimmer ve OCT RFV voltaj sırasıyla 75, 50 ve 125 V olarak ayarlandı. Negatif iyon modu için fragmentor, Skimmer ve OCT RFV gerilimi sırasıyla 100, 50 ve 200 V olarak ayarlandı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spektrum verilerini analiz edin.<ol>
<li>M/z, tepe alanı ve göç SÜRESI (MT) dahil olmak üzere en yüksek bilgileri elde etmek için otomatik entegrasyon yazılımını kullanarak kitle spektrum verilerinden zirveleri ayıklayın. Not: Yöntem, başka bir yerde14ayrıntılı olarak açıklanmıştır.</li>
		<li>İzotopomerler, yaklaştırmak iyonlarına karşılık gelen sinyal zirveleri ve bilinen metabolitlerin diğer ürün iyonlarının dışlama.</li>
		<li>M/z değerlerine ve MTS 'ye göre hmt metaboliti veritabanından gelen bilgilerle kalan zirveler ek açıklama ekleyin.</li>
		<li>Açıklama eklenmiş zirvelerin alanlarını iç standart düzeylere ve örnek başına hücre sayılarının normalleştirin.</li>
		<li>Her metabolit için hazırlanan standart eğrileri kullanarak kültürlü hücrelerde (pmol/106 hücreli) her metabolitin konsantrasyonunu değerlendir.</li>
		<li>Sonraki istatistiksel analizler ve biyolojik Yorumlar için nicelik metabolitin konsantrasyonlarını kullanın14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
<li>Miles, K. A., Williams, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+revisited%3A+imaging+tumour+blood+flow+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Imaging%22%5BJournal%5D)">Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism.</a> Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+the+metabolic+switch+in+cancers+by+oncogenes+and+tumor+suppressor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes.</a> Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+regulates+global+metabolic+pathways+in+EGFR-mutated+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+the+Phosphatidylinositol+3-Kinase+%28PI3K%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+%28mTOR%29+Axis+Is+Responsible+for+Aerobic+Glycolysis+mediated+by+Glucose+Transporter+in+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29-mutated+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Characterization+of+Antifolate+Responsiveness+and+Non-responsiveness+in+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, CE-MS tabanlı metabolomik analiz için kültürlü kanser hücrelerinden metabolitleri hazırlamak için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojisi tarif ediyoruz. Ölçülen metabolit konsantrasyonları uygun hücrelerin sayısına normalleştirilmiş çünkü bu protokolün en kritik noktalarından biri, kanser hücrelerinin doğru hazırlanması. Hücre numarasının doğru tahmini için, metabolomik analiz için metabolitlerin çıkarılması ile paralel olarak uygun hücrelerin sayısını saymak için deneysel grup başına en az bir ek kültür çanak hazırlamak gereklidir. Buna ek olarak, hücrelerin aynı sayıda çoğaltır için her çanak ve sayma için çanak tohumluk olmalıdır; gelecekte, bu, aynı yemeğin hem uygun hücreleri sayma hem de metabolitleri ayıklanması için kullanılmasını sağlayan hızlı ve stressiz (örn. tripsin içermeyen) hücre sayımı protokolüyle desteklenir. Hücreler yemeklerin yüzeyinden ayırmayın böylece bakım yıkanabilir sırasında alınmalıdır. Ciddi sitotoksisite testleri ve hücre yapışmasını azaltan diğer deneyler, yıkama prosedürü sırasında olası hücre kaybına bağlı olarak bu ekstraksiyon protokolü için uygun olmayabilir.
CE-MS tabanlı metabolomik analiz için kültürlü hücrelerden metabolitleri ayıklamak için yıkama tamponu olarak% 5 mannitol çözeltisi kullanmak önemlidir, çünkü PBS gibi tuz bazlı tamponlar, metabolomik analizlere müdahale ve ölçümü olumsuz yönde etkiler.
İki ya da üç yemek tek bir örnek olarak her çanak ve daha sonra örnekleri havuzu metabolitleri ayıklayarak kombine edilebilir; Ancak, birden fazla yemekleri birleştirerek genellikle çıkarılan metabolit çözeltisi içinde kalan mannitol artar. Bu da CE-MS tarafından metabolomik analizine engel olabilir. bu nedenle, tek bir örnek olarak birden fazla yemek veya kuyu kullanmayın tavsiye edilir.
CE-MS kullanarak bu metabolomik analiz yöntemi 50 ve 1000 da arasında moleküler ağırlıkları ile şarj molekülleri kapsamlı ölçümü için geliştirilmiştir; Bu nedenle, bu protokol sulu, düşük moleküler ağırlık bileşiklerinin çıkarılması için optimize edilmiştir. Bu nedenle, bu protokol lipid veya proteinler ve nüklik asitler gibi makromoleküller gibi hidrofobik metabolitleri ayıklamak için uygun değildir. Kapsamlı lipid analizleri veya kültürlü hücre numunelerinin lipidomicleri için artan bir talep olduğundan, hem hidrofilik hem de hidrophobic metabolitlerin eşzamanlı olarak çıkarılması için kolay ve etkili bir protokolün geliştirilmesi gereklidir.
Metabolit ekstraksiyon ilk adım-mannitol ile orta ve yıkama hücreleri aspirating-hücrelerin metabolik profilinde değişiklikleri en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Mannitol ile yıkandıktan sonra metanol ile hücrelerin tedavisi, proteinlerin denilmesine ve böylece enzimlerin daha fazla metabolik reaksiyonu katalizleymesini önlemektedir. Ancak, metanol tedavisinden sonra bile, redoks reaksiyonları, bazı dearboksilasyon süreçleri ve tiyol bağlantıları gibi enzimatik olmayan kimyasal reaksiyonlar olabilir. Bu nedenle, bu protokol ile ölçülen bu reaksiyonlarda yer alan tüm metabolitlerin konsantrasyonları dikkatle yorumlanmalıdır. Genom veya transcriptome aksine, metabolome kimyasal özellikleri çok çeşitli moleküller oluşur; Bu nedenle, hiçbir tek protokol herhangi bir kayıp veya rahatsızlık olmadan tüm metabolitleri ayıklamak olabilir. Bu tür son derece reaktif metabolitlerin daha doğru ölçümleri için, özellikle kesitler ve derivatizasyonlar gerektiren belirli metabolitler gruplarını ayıklamak için tasarlanmış bir protokol, danışılmalıdır. Ancak burada sunulan protokol, CE-MS tarafından metabolomik analiz için kültürlü hücre örneklerinden sulu metabolitlerin basit ve hızlı bir şekilde çıkarılması açıklanmaktadır. Bu yazıda biz nasıl CE-MS ayrıntılı olarak mevcut el yazması odak farklı, ancak, CE-MS kurmak için ayrıntılı adımları açıklayan ayrı bir özel makale gerektirebilir ayarlamak için tarif olamazdı.

Otto Warburg kanser hücrelerinin glikoz kadar almak ve yeterli oksijen varlığında lakdamak üretmek için mayalanmaya alışılmadık yeteneği elde gözlenen-bir fenomen Warburg etkisi veya aerobik glikoliz olarak adlandırılan1,2. Mitokondriyal solunum kusurları kanser hücrelerinde aerobik glikoliz için temel temel olarak spekülasyon3. Gerçekten de, Warburg etkisi fluorodeoxyglukoz (FDG)-pozitron emisyon tomografi (PET), klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan tümör görüntüleme temeli4,5. Aerobik glikoliz yüksek bir oran kanserin önemli bir özelliği olarak kabul edilir ve son zamanlarda biri olarak kabul edilmiştir "kanser damgalar," D. Hanahan ve B. Weinberg6tarafından açıklandığı gibi. Onkogenler ve tümör bastırıcı genlerde somatik mutasyonlar — HRAS/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, isocitrate dehidrogenaz (idh) ve Fumarik hidataz (FH) gibi )-Warburg etkisi7bir sonucu olduğuna inanılan, kanser hücrelerinde belirli metabolik değişikliklere bağlı olmuştur.
Metabolomik analiz sadece kanser hücrelerinde metabolik düzenlemeyi anlamak için değil, aynı zamanda erken evre kanser biyomarkerleri ve kemoterapi tepkisi tahmini tanımlamak için umut verici bir yaklaşımdır. Antikanser bileşikleri ile hassas veya dayanıklı kanser hücrelerinin tedavisi takiben, metabolik tepkiler Takibi kanser hastalarında spesifik antikanser tedavisinin etkinliğini tahmin etmek için metabolik biyomarkerlerin tanımlanması kolaylaştırır8 ,9,10,11. Bu yazıda, diamid ile tedavi edilen bir EGFR mutasyonu ile akciğer adenokarsinomdan elde edilen kanser hücresi hatları-metabolomik analiz için modeller olarak oksidatif strese neden oldu. Bu analitik yöntemin, kapiller Elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS) kullanarak avantajı, kütle aralığı m/z 50-100012,13ile şarj edilen metabolitlerin kapsamlı ölçüsüdür. Bu makalenin amacı, özellikle CE-MS tarafından kültürlü kanser hücreleri ve sonraki metabolomik analiz, sulu metabolitlerin hazırlanması için acemiler ayrıntılı bir step görsel protokol sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Kontes II otomatik hücre sayacı</td></tr><tr><td>Otomatik entegrasyon yazılımı</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>sürüm B.02.00</td></tr><tr><td>CE sistemi</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 7100 CE sistemi</td><td></td></tr><tr><td>CE/MS adaptör kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Püskürtücü kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayma odası sürgüsü</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Kontes hücre sayma odası kızakları</td></tr><tr><td>Santrifüj filtre cihazı, 5 kDa</td><td>İnsan Metabolom Teknolojileri</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Konik steril polipropilen tüp, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Konik steril polipropilen tüp, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar striptiz, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D (-) -Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Katyon analizi için elektroforez tamponu</td><td>İnsan Metabolom Teknolojileri</td><td>H3301-1001</td><td></td></tr><tr><td>Anyon analizi için</td><td>elektroforez tamponu</td><td>İnsan Metabolom Teknolojileri</td><td>H3302-1021</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu, 1000 & mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu, 20 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu, 200 &mu; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Sigortalı silika kılcal</td><td>Polymicro Teknolojileri</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; M Kimlik ve Süreler; 80 cm toplam uzunluk</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Dahili standart çözüm</td><td>İnsan Metabolom Teknolojileri</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>İzokratik pompa</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Serisi İzokratik Pompa</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, LC/MS sınıfı</td></tr><tr><td>Mikrotüp, 1.5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>İşletim Yazılımı</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>sürüm B.03.01 CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Steril doku kültürü kabı, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Uçuş süresi kütle spektrometresi</td><td>Agilent Teknolojiler</td><td>Agilent G1969A Uçuş Süresi LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi, %0.4</td> <td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td>Merck</td><td>Milli-Q su</td><td>18.2 M & Omega; &#183; cm saf su</td></tr><tr><td>Hacimsel şişe, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

kılcal elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomik analiz sadece normal hücrelere kıyasla kanser hücrelerinde spesifik metabolik düzenleme anlamak değil, aynı zamanda erken evre kanser tespiti ve kemoterapi tepkisi tahmini için biyomarkerleri belirlemek için umut verici bir omik yaklaşımı kanser hastaları. Metabolomik analiz için üniforma örneklerinin hazırlanması, ele alınması gereken önemli bir konudur. Burada, kapiller Elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS) kullanarak metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitleri ayıklamak için kolay ve güvenilir bir protokol sunuyoruz. Kültürlü hücrelerden sulu metabolitleri kültür ve yıkama hücreleri tarafından analiz edilir, metanol ile hücreleri tedavi, metabolitleri ayıklanması, ve CE-MS analizi için spin sütunları ile proteinleri ve makromolekülleri kaldırma. Diamid ile tedavi akciğer kanseri hücre hatları kullanarak temsili sonuçlar, bir oksidatif reaktif, oksidatif stres altında hücrelerin açıkça gözlemlenebilir metabolik kayması göstermektedir. Bu makale özellikle öğrenciler ve araştırmacılar metabolomikler araştırma dahil için değerli olacaktır, kim CE-MS tarafından analiz için hücre hatlarından metabolitleri hasat için yeni.

Kanser hücrelerinde metabolit konsantrasyonları (pmol/106 hücreler) uygun hücrelerin sayısına normalleştirilmiş olduğundan, koşullar arasında geçerli hücrelerin sayısında varyasyonu en aza indirmek için deneysel koşullar bakım ile ayarlanması gerekir. Örneğin, diamid tedavisi nispeten yüksek bir konsantrasyonda (250 μm) ama kısa bir süre için tüm hücrelerin mümkün olduğunca eşit büyüymesine izin vermek, böylece analiz uygulanabilir hücrelerin sayısını eşitleme oldu. Bu deneysel koşullarda, HCC827 ve PC-9 hücreleri eşit olarak büyüdü 3 h (Şekil 1). Diamide işlenmiş hücrelerin CE-MS analizi ile karşılaştırıldığında PBS-tedavi (kontrol) hücreleri ortaya 175 ve 150 diferansiyel metabolitleri HCC827 ve PC-9 hücrelerinde, sırasıyla. Bunlar arasında, pentoz fosfat yolu (PPP) ve üst glikoliz içinde birkaç ara iki hücre hatlarında diamid tedavi koşullarda önemli ölçüde daha yüksek, birkaç tricarboksilik asit (TCA) döngüsü ara tedavi daha düşük iken (Şekil 2 ve Şekil 3).
PPP, redoks homeostazı bakım ve yağlı asit biyosentezi15için kullanılan azaltılmış nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADPH) şeklinde azalan eşdeğerleri üretir. Diamid tedavi takipte, Glukonik asit düzeyi-oksitlenmiş glikoz-12 kat HCC827 hücre ve PC-9 hücrelerde 10 kat arttı; benzer şekilde, diamid tedavisini takiben, glikoz 6-fosfat (G6P)-fosforile glikoz ve ilk hexokinase-katalizlenmiş glikoliz ürünü-Ayrıca 6,3-ve 3,5-fold HCC827 ve PC-9 hücrelerinde, sırasıyla (Şekil 4) artmıştır. Buna ek olarak, diamid tedavisinden sonra, 6-fosfoglukonat (6PG)-PPP 'de ilk ara seviyeleri-HCC827 hücrelerinde 89-Fold ve PBS kontrollerinde görülen seviyelere kıyasla PC-9 hücrelerinde 231-kat artar (Şekil 4). Bunun aksine, fruktoz 6-fosfat (F6P) ve fruktoz 1, 6-bisfosfat (F1, 6p) gibi diğer glikolitik ara maddelerin seviyeleri diamid deneysel durumda değişmez (Şekil 4). Toplam nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADP+) seviyeleri diamid tedavi ve PBS kontrol koşulları arasında neredeyse eşdeğerdir (Şekil 4), GLIKOZ esas olarak PPP üzerinden katabolize olduğunu düşündürmektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> Şekil 1. Diamid tedavi üzerine değişmeden hücre numaraları. 250 μm diamid hücre büyüme tepkiler tripan mavi boyama kullanılarak ölçülmüştür. 1 veya 3 saat için PBS (mavi) veya diamid (kırmızı; 250 μm) Ile tedavi edilen (A) HCC827 ve (B) PC-9 hücrelerinin hücre numaraları gösterilir. Veriler ortalama ± SD (n = 6) olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> Şekil 2. Metabolitlerin temsilcisi MS doruklarına. (A) Glukonik asit, (B) glikoz 6-fosfat (G6P), (C) 6-phosphogluconate (6PG) ve (D) CE-MS analizi ile elde edilen nikoinamid ADENIN dinükleotid fosfat (NADP+) olarak açıklamalı elektrophergramlar. Her satır, kullanılan hücre çizgisini (katı, HCC827; noktalı, PC-9) ve tedavi (mavi, PBS; kırmızı, diamide) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> Şekil 3. Hücre içi metabolitlerin metabolome profilleri. (A) HCC827 ve (B) diamid ile tedavi edilen PC-9 hücrelerinde metabolitlerin kat değişiklikleri günlük2(diamıde/PBS) olarak gösterilir. Toplam olarak, 175 ve 150 metabolitleri sırasıyla HCC827 ve PC-9 hücrelerinde açıklamalı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> Şekil 4. Diamit tedavisi üzerine PPP 'nin yukarı düzenlenmesi. Diamid ile tedavi edildikten sonra glikoliz ve pentoz fosfat yolu (PPP) dahil anahtar metabolitlerin hücre içi konsantrasyonları (pmol/106 hücreler) gösterilir. Metabolitler HCC827 ve PC-9 hücrelerinde PBS (mavi) veya diamid (kırmızı, 250 μm) ile tedavi edilen Glukonik asit, glukoz 6-fosfat (G6P), fruktoz 6-fosfat (F6P), 6 gibi 30 dk. temsili metabolitleri elde edildi -fosfoglukonat (6Pg) ve nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADP+) gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Bu makalenin amacı, metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması için bir protokol açıklamak için, özellikle, kapiller Elektroforez-kütle spektrometresi.

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Bu makalenin amacı sonraki metabolome analizi için kültürlü kanser hücrelerinden sulu metabolitleri ayıklamak için ayrıntılı, adım adım görsel protokol sağlamaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı yapışık hücrelerden metabolitleri ayıklamak için sadeliği ve güvenilirliğidir. Ama her şeyden önce, kılcal elektroforez-kütle spektrometresi veya CEMS kullanarak metabolom analizi için iyi optimize edilmiş.Metabolomik biyobelirteçleri belirlemek veya erken evre kanser tespit etmek ve kanser hastalarına kemoterapi yanıtı tahmin etmek için güçlü bir tekniktir. Bu gösteride kanser hücrelerini kullanıyoruz. Ancak, bu teknik aynı zamanda iPS hücrelerinde fibroblastlar gibi diğer yapışık hücrelerden metabolitleri hasat için uygulanabilir.Metabolit konsantrasyonları canlı hücre sayısına göre normalleşir. Kültürün çok dikkatli hazırlanması, bu iyi tekrarlanabilir veri elde etmek için anahtardır. Prosedürü gösteren Ami Maruyama, laboratuvarımdan bir teknisyen olacak.Başlamak için, plaka HCC827 ve PC-9 hücreleri 100 milimetrelik yemekler de RPMI-1640 orta 10% fetal sığır serumu ile takviye 10 mililitre içeren. Kültürlere 24 saat boyunca bulaşıkları %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede bir kuvöze yerleştirin. Kuluçkadan sonra, hücre kültürü ortamını aspire etmek için 100 milimetrelik kültür yemeklerini yavaşça yatırın.Kalsiyum ve magnezyum olmadan fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi iki mililitre kullanarak her çanak hücreleri yıkayın. PBS çözeltisi tamamen çanak yüzeyini kaplar, sonra yıkama tampon aspire için bulaşıkları yatırın, böylece yavaşça her çanak kaya. Sıcak 0.25%tripsin-EDTA çözeltisi 37 santigrat derece.Beş mililitrelik serolojik pipet ile, her çanağa ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisinin iki mililitresini ekleyin. Tripsin tamamen çanak yüzeyini kaplar, böylece yavaşça her çanak kaya. Kültür yemeklerini yaklaşık beş dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Sonra, her yemek için önceden ısıtılmış tam büyüme orta dört mililitre ekleyin. Ve yavaşça orta hücreleri yeniden askıya almak için birkaç kez pipet. Her hücre süspansiyonunu ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.Santrifüj 800 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve önceden ısıtılmış tam büyüme orta iki mililitre her hücre pelet yeniden askıya. 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte 10 mikrolitre lik hücre süspansiyonu ile %0,4 trippan mavisi çözeltinin 10 mikrolitresini karıştırın.Kapiller eylem yoluyla bir hücre sayma odası slayt içine karışımın 10 mikrolitre yükleyin. Odayı otomatik hücre sayacına yerleştirin ve görüntüyü yakalamak için yakalama düğmesine basın ve hücrelerin toplam sayısı ve yüzde canlılığının sonuçlarını görüntüleyin. Toplam hücre sayısı mililitre başına 0,5 milyon hücrenin üzerinde ise, istenilen hücre konsantrasyonu elde etmek için 15 mililitrelik konik tüp daha fazla büyüme orta ekleyin.Şimdi, her 100 milimetrelik hücre kültürü yemeğine 2 ila 5 mililitre kültür ekleyin ve her yemek başına yaklaşık 1 ila 2,5 milyon hücre yiyelim. Kültür yemeklerini 37 derecede %5 karbondioksitle 18 saat kuluçkaya yatırın. İlk olarak, 15 mililitrelik hacimsel bir şişede, L-Metiyonin sülfone ve D-Camphor-10-sülfonik asit 1, ultrasaf suda 000 kat içeren ticari bir iç standart çözelti seyreltmek.Ultra saf suda mililitre mannitol çözeltisi başına 0,05 gram yıkama tamponu olarak hazırlamak için ultra saf suda mannitol çözün. Daha sonra, her santrifüj filtre ünitesinin filtre kabına, pipet 250 mikrolitre ultra saf su. Filtre ünitelerini sıkıca kaplayın ve 9, 100 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Her filtrate hacmini kontrol edin. İlk kısa dönüş sırasında önemli bir filtrat birikmişse, filtre ünitesi arızalı olabilir. Filtre ünitesini atın ve bunun yerine yeni bir filtre birimi kullanın.Filtre ünitelerinin kapaklarını sıkıca kapatın ve 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede 9, 100 kez g'de tekrar santrifüj edin. Filtre kaplarının hiçbirinde ultra saf su kalmadığından emin olun ve her toplama tüpündeki filtrelenmiş ultra saf suyu pipetle çıkarın. Filtre kaplarını toplama tüplerine geri yerleştirin ve kurutma nın ardından zarar görmesini önlemek için bir saat içinde santrifüj filtre ünitelerini kullanın.100 milimetrelik kültür yemeklerini kuvözden alın ve her yemekten hücre kültürü ortamını aspire edin. Hücre tabakasını rahatsız etmemeye özen terek, her çanağa 250 mikromolar diamid içeren veya olmayan 10 mililitre PBS kültür ortamı ekleyin. Kültür yemeklerini 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, her 100 milimetrelik kültür çanamı hücre kültürü ortamını aspire edin. Biraz çanak tilt ve yavaşça hücre tabakası rahatsız değil dikkat, hücreleri yıkamak için her yemeğin kenarına% 5 mannitol yıkama tampon iki mililitre ekleyin. Her kültür çanağı yıkama tampon aspirate ve biraz çanak yatırarak ve yavaşça çanak başına yıkama tampon 10 mililitre ekleyerek hücreleri tekrar yıkayın.Sonra, tamamen her kültür çanak kenarından yıkama tampon aspire. Şimdi, kültür çanak başına% 99.7 metanol 800 mikrolitre ekleyin ve yavaşça ileri geri her kültür çanak rock, tüm yüzeyini kapsayacak şekilde. Bulaşıkları oda sıcaklığında 30 saniye bekletin.Pipetin ucunu metanolün içine batırarak ve birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak çanak başına seyreltilmiş iç standart çözeltinin 550 mikrolitresini yavaşça ekleyin. Yavaşça tüm yüzeyini kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak rock ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca bulaşıkbırakın. Daha sonra, her kültür çanağı çıkarılan çözeltiyi ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.Tüpleri 2, 300 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Her süpernatantın 700 mikrolitresini birim başına 350 mikrolitre ile iki santrifüj filtre ünitesine aktarın. Filtre tüplerini filtre kaplarında sıvı kalmayana kadar yaklaşık iki saat boyunca 4 santigrat derecede 9, 100 kez g olarak santrifüj edin.Filtre kaplarını çıkarın ve toplama tüplerinin kapaklarını sıkıca kapatın. Bu çalışmada, HCC827 ve PC-9 hücreleri eşit üç saat büyüdü. CEMS analizi, her iki hücre hattı için diamid ile tedavi edilen hücreler ile PBS ile tedavi edilen hücreler arasındaki farkı gösterir.Bunlar arasında, pentoz fosfat yolu ve üst glikoliaz birkaç ara diyamid tedavi edilen koşullarda önemli ölçüde daha yüksek, birkaç trikarboksilik döngüsü ara tedavi koşullarında ise daha düşük tükenir. Hücre içi metabolitlerin metabolom profillerinde HCC827 ve PC-9 hücrelerinde sırasıyla 175 ve 150 diferansiyel metabolit saptandı. Diamid tedavisinden sonra, glukonik asit ve okside glikoz düzeyi HCC827 hücrelerinde 12 kat, PC-9 hücrelerinde 10 kat arttı.Benzer şekilde, ilk heksosinaz katalize glikoliz ürününde fosfori glukoz 6-fosfat düzeyi de HCC827 ve PC-9 hücrelerinde sırasıyla 6.3 ve 3.5 kat artmıştır. Buna ek olarak, pentoz fosfat yolunun ilk ara orta seviyesi olan 6-fosfat kotonat düzeyleri HCC827 hücrelerinde 89 kat, PC-9 hücrelerinde ise 231 kat artmıştır. Buna karşılık, diyamid deneysel durumda fruktoz 6-fosfat gibi diğer glikolitik ara düzeyleri değişmedi.Total nikotinamid adenin dinükleotid fosfat düzeyleri diyamid tedavisi ile PBS kontrol koşulları arasında neredeyse eşdeğerdi. Yıkama hücreleri için yıkama tamponu CEMS analizi için çok önemlidir, çünkü tuz bazlı tamponlar analizi bozar ve ölçümü olumsuz yönde etkiler. Bu protokol lipidler gibi hidrofobik metabolitleri ayıklamak için uygun değildir, bu yüzden daha kapsamlı metabolom analizi için hem hidrofilik hem de hidrofobik metabolitleri rahatlıkla çıkarmak için bir protokol geliştirmemiz gerekir.Bu teknik hemen hemen her yapışık hücrelerden metabolitlerin kolay bir ekstraksiyon ufark eder, ve böylece, kanser gibi çeşitli araştırmalar için geçerlidir, kök hücreler, farmakoloji, beslenme, ve kozmetik bilimi.

extraction-aqueous-metabolites-from-cultured-adherent-cells-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Bir sheathless gözenekli ucu arayüz tasarımı kullanılarak kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi ile biyolojik numunelerin metabolik profil için bir protokol verilmektedir.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

Bu makale, kararlı izotop izleme, belirli hücre tiplerini izole etmek için hücre sıralama ve kütle spektrometresinin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık topluluklarda hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Biz hızlı içinde in situ örnekleme yüksek kesinlik ve en az işgal kılcal tabanlı mikro-örnekleme, kimyasal bir anlık görüntüsünü metabolik aktivite karakterizasyonu kolaylaştırmak için kullanarak tek bir hücre bulunan küçük bir bölümünün etkinleştirmek adımları tarif canlı embriyolar bir ölçüye göre tek hücre Kapiler Elektroforez ve kütle spektrometresi platformu kullanarak.

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Öğrenin, kanser hücreleri gibi yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması için güvenilir bir yöntem. Bu protokol, kılcal elektroforez-kütle spektrometresi ile metabolomik analiz için optimize edilmiştir.

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması (Video) | JoVE Journal

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Daha fazla video keşfet