Name: CAR-T hücrelerinde GM-CSF ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin CAR-T hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile GM-CSF genini devre dışı bırakma yöntemini. Bu protokol, immünoterapi üretiminde genetik mühendisliği uygulayarak daha etkili ve daha az toksik kanser tedavileri geliştirmeyi amaçlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma K12CA090628 (SSK), Ulusal kapsamlı kanser ağı (SSK), Mayo Clinic Center bireyselleştirilmiş Tıp (SSK), Predolin Vakfı (SSK), Mayo Clinic Office çeviri uygulama (SSK) gelen hibe yoluyla destekleniyordu ve Mayo Clinic tıp bilimcisi eğitim programı Robert L. Howell hekim-bilim adamı Bursu (RMS).

Bu protokol Mayo Clinic 'in kurumsal Inceleme Kurulu (ıRB) ve kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (ıBC) yönergelerini takip eder.
1. CART19 hücre üretimi
<ol><li>T hücresi yalıtımı, stimülasyon ve ex-vivo kültürü<ol>
<li>Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir hücre kültürü kaputu tüm hücre kültürü çalışmalarını gerçekleştirin. Periferik kan mononükleer hücreleri hasat (pbmcs) bu pbmcs uygun bir kaynak olduğu bilinmektedir gibi Aferez sırasında toplanan de-teşhis normal donör kan konileri.13
</li>
		<li>PBMCs yalıtmak için, bir 50 mL yoğunluk degrade ayırma tüpü bir yoğunluk degrade orta 15 mL ekleyin. Hücre bindirmeyi önlemek için% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren fosfat-tamponlu tuz (PBS) eşit hacmine sahip donör kanı seyreltin.<ol>
<li>Ayırma tüpü içine koni seyreltilmiş donör kan ekleyin, dikkatli kan ve yoğunluk degrade orta arasındaki arayüz rahatsız değil. 1.200 x g 'de santrifüjün 10 dakıka içinde RT.</li>
			<li>Yeni bir 50 ml konik içine süpernatant decant, 40 ml kadar getirerek PBS + 2% FBS ile yıkayın, RT 8 dakika için 300 x g Santrifüjlü, Aspire süpernatant, pelletini içinde 40 ml tampon, ve sayma hücreleri.</li>
		</ol>
</li>
		<li>T hücrelerini, üreticinin protokolüne göre tam otomatik hücre ayırıcı kullanarak negatif seçim manyetik boncuk kiti ile PBMCs 'den yalıtın.</li>
		<li>İzole T hücrelerini kültüre etmek için,% 10 insan AB serumu (v/v),% 1 penisilin-streptomisin-glutamin (v/v) ve serum içermeyen hematopoetik hücre ortamını içeren T hücresi Orta (TCM) hazırlayın. 0,45 μm steril vakum filtresinde ve ardından 0,22 μm steril vakum filtresiyle ortamı sterilize edin.</li>
		<li>Gün 0 (T hücre stimülasyon günü), T hücrelerinin stimülasyon öncesinde Yıkamak için, boncuk gerekli hacmi (3:1 boncuk oranı için yeterli CD3/CD28 boncuk kullanın: T hücreleri; Not boncuk konsantrasyonu değişken olabilir) steril bir 1,5 ml microsantrifüz tüp ve pelletini 1 ml tcm.</li>
		<li>Mıknatıs ile temas halinde yerleştirin.</li>
		<li>1 dk sonra, TCM Aspire ve 1 ml taze TCM içinde pelletini boncuklar yıkamak için.</li>
		<li>Bu prosedürü toplam üç yıkama için tekrarlayın.</li>
		<li>Üçüncü yıkama sonra, TCM 1 ml boncuk pelletini.</li>
		<li>T hücrelerini say.</li>
		<li>3:1 boncuk oranındaki T hücrelerine boncuklar aktarın: hücreler.</li>
		<li>Hücreleri 1 x 106 hücreli/ml son konsantrasyonuna seyreltin.</li>
		<li>37 °C ' de, 24 saat için% 5 CO2 ' de inkübe</li>
	</ol></li>
	<li>T hücreli transfeksiyon ve dönüştürücü<ol>
<li>Hücre kültürü davlumbaz, kişisel koruyucu ekipman ve bertaraf önce çamaşır suyu ile kullanılan malzemelerin dezenfeksiyon dahil olmak üzere BSL-2 + önlemleri kullanarak lentiviral çalışma gerçekleştirin.</li>
		<li>Elde bir CART19 bir lentiviral vektör yapı. Not: burada kullanılan CART19 yapı tasarlanmış ve sonra da Novo ticari olarak kullanılabilir bir protein sentezi satıcı kullanarak sentezlenmiş. CAR yapı daha sonra bir EF-1α Promoter kontrolü altında üçüncü nesil Lentivirus içine klonlanmış. Tek zincir değişken bölge parçası türetilir FMC63 klonlama ve insan CD19 tanır. CAR19 yapı ikinci nesil 4-1BB costimulatory etki alanı ve CD3ζ stimülasyon (FMC63-41BBz) sahiptir. 12 tane
</li>
		<li>Daha önce açıklandığı gibi lentiviral üretim gerçekleştirin. 12 tane<ol>
<li>Kısacası, Lentivirus üretmek için,% 70-90 konfluency ulaştı 293T hücreleri kullanın.</li>
			<li>15 μg bir gag/pol/tat/Rev paketleme vektörü, 7 μg bir VSV-G zarf vektörü, 111 μL ön-kompleks reaktif, 129 μL dahil olmak üzere transfeksiyon reaktiflerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon izin transfeksiyon reaktif, ve 9,0 mL transfeksiyon orta önce 293T hücrelere eklemeden. Daha sonra 37 °C, 5% CO2' de Transferli hücreleri kültürleştirin.</li>
			<li>Hasat, santrifü112.700 13.028 jü (900 x g için 10 dk), filtre (0,45 μM naylon filtre), ve konsantre süpernatant 24 ve 48 h ile ultracent </li>
			<li>Gelecekteki kullanım için-80 °C ' de dondurur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1. gün, hafifçe pelletini t hücreleri 1 x 106/ml gün 0 uyarılmış olmuştu t hücrelerinin rozetleri kırmak için.</li>
		<li>Tüm lentiviral çalışma için uygun BSL-2 + önlemleri altında, 3,0 ' in enfeksiyonunun bir çokluğu (MOı) ile uyarılan T hücrelerine taze veya dondurulmuş hasat virüsü ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T hücre genişletme<ol>
<li>Genişleme aşaması sırasında, 37 °C,% 5 CO2' de Traned T hücrelerini inküymeye devam edin. Sayı CAR-T hücreleri gün 3 ve 5, ve taze eklemek, önceden ısıtılmış TCM kültürü için bir CAR-T hücre konsantrasyonu korumak için 1 x 106/ml.</li>
		<li>Bir mıknatıs kullanarak uyarıcı (gün 6) sonra 6 gün transed T hücrelerinden boncuk çıkarın. Hasat, resuspend, ve yer T hücreleri 50 mL konik tüpler için bir mıknatıs içinde 1 dakika. Sonra süpernatant toplamak (Car-T hücreleri içerir), ve boncuklar atın.</li>
		<li>Genişleme devam etmek için 1 x 106 hücreler/ml konsantrasyonunda kültüre GERI toplanan Car-T hücreleri yerleştirin.</li>
		<li>6. gün, Akış sitometrisi ile OTOMOBILIN yüzey ifadesini değerlendir. Not: çeşitli yöntemler, bir keçi Anti-fare IgG (H + L) Cross-adsorbed ikincil antikor ile boyama veya bir CD19 spesifik peptid ile boyama gibi, bir fluorokrom konjuli, otomobıl yüzey ifadesi algılamak için kullanılabilir. Burada, kültürden bir kısım (yaklaşık 100.000 T hücreleri) alın ve Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu,% 2 fetal sığır serumu ve% 1 Sodyum azid ile hazırlanan akış tampon ile yıkayın. Anti-CAR antikor ile hücreleri leke ve iki kez yıkayın. Canlı/ölü leke ve CD3 monoklonal antikor (OKT3) ile hücreleri leke. Hücreleri yıkayın ve akış tamponunun pelletini. Dönüştürücü verimliliğini belirlemek için bir sitometresi elde.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T hücre ağoprezervasyon<ol>
<li>Hasat ve cryopreserve CAR-T hücreleri 8 gün stimülasyon (gün 8 T hücre genişleme), kültür hücreleri hasat.</li>
		<li>300 x g'de 5 dakika aşağı spin.</li>
		<li>% 10 dimetil sülfoxid ve 90% fetal sığır serumu oluşan donma ortamında şişe başına mL başına 10.000.000 hücrelerde donma ortamında resuspend.</li>
		<li>A-80 °C dondurucu içinde-1 °C/dk soğutma hızı elde etmek ve sonra 48 h sonra sıvı nitrojeni aktarmak için bir donma kabı içinde dondurmak.</li>
		<li>İn vitro veya in vivo deneyler için kullanımından önce, sıcak TCM CAR-T hücreleri çözüyor.</li>
		<li>Seyreltilen hücreleri yıkayın ve dimetil sülfoxid ve pelletini bir konsantrasyon 2 x 106 hücreler/ml sıcak t cm kaldırın. 37 °C ' de gece istirahat,% 5 CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GM-CSF k/o CART19 üretim
<ol><li>GM-CSF ' ı kesintiye uğratmak için, daha önce insan sitokinin GM-CSF ' ı kodlayan CSF2 geni için yüksek verimliliğe sahip olduğu bildirilen tarama gRNAs aracılığıyla seçilen insan GM-CSF (CSF2) eXoN 3 ' ü hedefleyen bir kılavuz RNA (gRNA) kullanın. 14 Not: Bu gRNA (U6 Organizatör altında) içeren ticari olarak sentezlenmiş araştırma notu Cas9 üçüncü nesil lentiviral yapı kullanılmıştır. Yapı, puromisin direnç geni içerir. GRNA dizisi GACCTGCCTACAGACCCGCC şeklindedir. 12 tane
</li>
	<li>Lentivirus üretmek için,% 70-90 konfluency ulaştı 293T hücreleri kullanın.</li>
	<li>Faiz lentiviral plazmid 15 μg izin, 18 μg bir gag/pol/tat/Rev paketleme vektörü, 7 μg bir VSV-G zarf vektörü, 111 μL ön-kompleks reaktif, 129 μL transfeksiyon reaktif, ve 9,0 mL transfeksiyon orta için 30 dakika Oda te saklamayýn.</li>
	<li>Transfeksiyon reaktifler 293t hücrelere ekleyin. Sonra kültür 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Hasat, Santrifüjü (10 dk için 900 x g), filtre (0,45 μM naylon filtre) ve 24 ve 48 h 'de, 2 saat için 13.028 x g , 18 h veya 112.700 x g için de, gelecekteki kullanım için donma-80 °c ' de konsantre süpernatant.</li>
	<li>1. gün, hafifçe Rosettes kırmak için T hücreleri pelletini.</li>
	<li>Bir BSL-2 + onaylı laboratuvarda, araç-T hücreleri oluşturmak için uyarılmış T hücrelere dondurulmuş veya taze hasat virüs ekleyin. CAR19 Lentivirus ve GM-CSF CRıPR Lentivirus hedefleme ile T hücreleri transduce. CAR19 Lentivirus ile 3. CRıPR Lentivirus titrasyon mümkün değildi bu yana, 10 x 106 T hücreleri dönüşüm için 15 UG Plasmid hazırlık oluşturulan virüs parçacıkları kullanın.</li>
	<li>Adım 1 ' de anlatıldığı gibi T hücresi stimülasyon, genişleme ve ağaloprezervasyon kalan adımlarına bakın .
</li>
	<li>Puromisin direncini taşıyan lentiCRISPR-düzenlenmiş T hücreleri için, 3 ve gün 5 günü 1 mL başına 1 μg puromisin konsantrasyonunda puromisin Dihidroklorür ile hücreleri tedavi edin.</li>
</ol>3. GM-CSF bozulma verimliliği ve GM-CSF k/o CART19 fonksiyonel değerlendirme
<ol><li>GM-CSF bozulma verimliliği: ayrıştırma (TIDE) sıralama ve analiz ile ındels izleme<ol>
<li>GM-CSF geni ile ilgilinin eXoN dizisi için, aşağıdaki astar kullanın. TGACTACAGAGAGGCACAGA GM-CSF (CSF2) için bir ileri primer sıra kullanın ve TCACCTCTGACCTCATTAACC bir ters astar dizisi.</li>
		<li>Genomik ekstraksiyon kiti ile 5.000.000 CAR-T hücrelerinden DNA ayıklayın. PCR reaksiyonu için, μM ' nin PCR reaksiyonu, 0.1-0.5 μg şablon DNA 50 'Sı ile her bir astar için son konsantrasyon ile reaksiyon başına 25 μL, bir Taq Mastermix kullanın</li>
		<li>Tablo 1' de açıklanan PCR Bisiklet koşullarına bakın.</li>
		<li>PCR örneklerini, 100 V 'de 30 dakika boyunca% 1-2 agaroz jel ile çalıştırın ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak ayıklayın.</li>
		<li>Seri PCR amplicons. Ham verileri uygun bir gelgit yazılımına yükleyerek allel modifikasyon sıklığını hesaplayın. 15
</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSFk/o CART19 GM-CSF üretim ve fonksiyonel değerlendirme<ol>
<li>CAR-T hücrelerinin sitokin üretimini belirlemek için, vahşi tip CART19 hücreleri ve GM-CSFk/o CART19 CD19 ifade eden akut lenfoblastik lösemi hücre hattı NALM6 1:5 Için 37 °c ' de 4 h, monensin varlığına% 5 Co2 çözüm, anti-human CD49d, anti-human CD28 ve anti-human CD107a.</li>
		<li>Akış sitometri için kültürden hasat hücreleri. Hücreleri akış sitometri tamponunu ile yıkayın. Hücreleri canlı/ölü boyama kiti ile lekelenin. Oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkara 15 dakika. sabitleme ortamı ile hücreleri düzeltin ve oda sıcaklığında karanlıkta inkübasyon 15 dakika.</li>
		<li>Yıkandıktan sonra, anti-human ıfnγ monoklonal antikor, Anti-insan GM-CSF, anti-human MıP-1β, anti-human IL-2 ve anti-human CD3 ile kombinasyon halinde geçirgen orta ile hücreler arasında Lekelenmek ve 30 için oda sıcaklığında karanlıkta kulkaylık Min. numuneleri yıkayın ve pelletini. Bir akış sitometresi örnekleri elde ve hücre içi GM-CSF ifade yüzdesi için analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK, Novartis 'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasında bir anlaşma kapsamında) lisanslı araç T-Cell terapisi alanında patent üzerine bir mucidi. Bu çalışmalar Humanigen (SSK) bir hibe tarafından kısmen finanse edildi. RMS, MJC, RS ve SSK bu iş ile ilgili patentler üzerinde mucitler vardır. Laboratuar (SSK) tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys ve actinium 'dan fon alır.

Bu raporda, CAR-T hücrelerinde ikincil modifikasyonları teşvik etmek için CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanmak üzere bir metodoloji açıklanmaktadır. Özellikle, bu gRNA faiz gen hedefleme ve GM-CSFk/o CART19 hücreleri oluşturmak için Cas9 içeren bir viral vektör ile lentiviral dönüştürücü kullanılarak gösterilmiştir. Daha önce GM-CSF nötralizasyonu bir xenograft modelinde CRS ve NT iyileştirir göstermiştir. 12 daha önce açıklandığı gıbı, GM-CSFk/o Car-T hücreler ÜRETIM sürecind...

Chimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücre tedavisi kanser tedavisinde büyük söz sergiler. 1 , CD19 (CART19) hedefleyen 2 adet Car-T hücre terapisi, son zamanlarda Birleşik belirtilen ve Avrupa 'da çok merkezli klinik çalışmalarda çarpıcı sonuçlar gösterdikten sonra B hücreli malignite kullanımı için onaylanmıştır. 3 ' ü , 4 , CAR-T hücrelerinin daha yaygın kullanımına yönelik 5 bariyer, katı tümörlerde ve sitokin serbest bırakma Sendromu (CRS) ve NÖROTOKSISITE (NT) dahil olmak üzere ilişkili toksisitelerde sınırlıdır. 3 ' ü , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Car-t hücre tedavisinin terapötik indeksi geliştirmek için, çinko parmak nükrenler gibi genom mühendislik araçları, Talens, ve CRıNPR daha az toksik veya daha etkili Car-t hücreleri oluşturmak için bir GIRIŞIM daha Car-t hücreleri değiştirmek için kullanılmaktadır. 10 ' dan fazla , 11 ' i
Bu yazıda, CRISPR/Cas9 düzenlenmiş CAR-T hücrelerini oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemin spesifik amacı, daha az toksik veya daha etkili CAR-T hücreleri oluşturmak için CRISPR/Cas9 üzerinden CAR-t hücre üretimi sırasında araç-T hücrelerini genetik olarak değiştirmenizi sağlamaktır. Bu metodolojisi geliştirmek için mantık, Car-t hücre tedavisinin terapötik penceresini artırmak ve uygulama genişletmek için yeni stratejiler için acil bir ihtiyaç gösterir CAR-T hücre tedavisinin klinik deneyiminden öğrenilen dersler üzerine kurulmuştur diğer tümörler ve klinik girmeye başladı CAR-T hücrelerin birden fazla değişiklik sağlayan sentetik biyoloji son gelişmeler tarafından desteklenmektedir. Çeşitli genom mühendislik araçları geliştirilmiştir ve çinko parmak nükler, TALENs ve JıSPR gibi farklı ayarlarla uygulandığında, metodolojimiz CAR-T hücrelerinin CRISPR/Cas9 modifikasyonu açıklanmaktadır. 10 ' dan fazla , 11 Crispr/Cas9, yabancı DNA 'yı ortadan kaldırmak IÇIN tasarlanan RNA bazlı bir bakteriyel savunma mekanizmasıdır. CRıSPR, bir kılavuz RNA (gRNA) aracılığıyla tanımlanan bir hedef sırasını ayırmak için endonükleazları kullanır. CAR-T hücrelerinin CRıNPR düzenleme diğer genom mühendislik araçları üzerinde çeşitli avantajlar sunar. Bu, gRNA dizisinin hassasiyetini, faiz geni, yüksek gen düzenleme verimliliği ve birden fazla gRNAs aynı anda kullanılabilir olduğundan birden çok geni hedefleme yeteneğini hedefleyen bir gRNA tasarlamak için basitlik içerir.
Özellikle burada açıklanan yöntemlerle, bir Lentivirus kodlama CRıPR Kılavuzu RNA ve Cas9 T hücrelerinin araba dönüştürücü sırasında bir geni bozmak için kullanılır. CAR-T hücrelerini düzenlemek için uygun bir tekniği seçerken, burada açıklanan tekniği araştırma notu CAR-T hücreleri oluşturmak için etkili bir mekanizma olduğunu öneririz, ancak genom içine Cas9 kalıcı entegrasyonu uzun vadeli etkisi bilinmiyor, biz Konsept araştırma notu CAR-T hücrelerinin kanıtı geliştirmek için bu metodoloji önermek ama iyi üretim uygulama notu CAR-T hücreleri üretmek için değil.
Özellikle, burada granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) nakavt Car-T hücreleri insan CD19 hedefleyen nesil açıklanmaktadır. Bu CAR-T hücreleri lentiviral parçacıklar GM-CSF (gen adı CSF2) ve Cas9 özel bir kılavuz RNA kodlama ile dönüştürücü tarafından oluşturuldu. Daha önce GM-CSF nötralizasyonu bir xenograft modelinde CRS ve NT iyileştirir bulundu. 12 GM-CSFk/o Car-t hücreleri GM-CSF üretim sürecinde inhibisyonu IÇIN izin, etkili GM-CSF üretimini azaltarak ise Car-t hücre anti-tümör aktivitesi ve hayatta kalma IÇINDE vivo wildtype Car-t hücrelere kıyasla artırır. 12 böylece, burada Crispr/CAS9 düzenlenmiş Car-T hücreleri oluşturmak için bir metodoloji sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>CD3 Monoklonal Antikor (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Monoklonal Antikor (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Seçim Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3 / CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Sistemi B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>akış sitometresi</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu</td><td>Gibco</td><td>14190-144 &</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Manyetik Parçacık Konsantratörü)</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Mıknatıs</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan T Hücresi İzolasyon Kiti&nbsp;</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>17951</td><td>negatif seçim manyetik boncuklar; 17951RF, uçlar ve tampon içerir</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare Anti-İnsan CD107a ve nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon Ortamı (Orta A)</td><td>GAS001S100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GenCRISPR gRNA Yapısı: Adı: CSF2 CRISPR kılavuzu RNA 1; Tür: İnsan, Vektör: pLentiCRISPR v2; Direnç: ampisilin; Kopya numarası: Yüksek; Plazmid hazırlama: Standart teslimat: 4 &mu; g (Ücretsiz ücretli)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>özel sipariş</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>Masaüstü Genetik İnsan AB Serumu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; Erkek Bağışçılar; AB tipi; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gama Monoklonal Antikoru (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma için</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lenforep</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solüsyonu, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD28 Klonu CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD49d Klonu 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan MIP-1 ve beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Dondurma Kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, klon G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>akut lenfoblastik lösemi hücre hattı</td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vakum Filtre Sistemleri, 500 mL, PES Membran, 0.22uM, steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene CN Membranlı Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri 0.45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Orta (1X), Sıvı</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Fare Anti-İnsan IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100X), Sıvı</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Geçirgenlik Ortamı (Orta B)</td><td>Canlandırıcı</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomik DNA Mini Kiti</td><td>Canlandırıcı</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin Dihidroklorür</td><td>MP Biyomedikal, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Anti-İnsan GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>21000</td><td>Tam Otomatik Hücre Ayırıcı</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide, %5 (a/h)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

car-t hücrelerinde gm-csf ' ı knock out için crispr/cas9 kullanma

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Chimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücre tedavisi, kanser için bir kesme kenarı ve potansiyel olarak devrimci yeni tedavi seçeneğidir. Ancak, kanser tedavisinde yaygın kullanımı için önemli sınırlamalar vardır. Bu sınırlamalar, sitokin serbest bırakma Sendromu (CRS) ve nörotoksisite (NT) ve sınırlı genişleme, efektör fonksiyonları ve katı tümörlerde anti-tümör aktivitesi gibi benzersiz toksisitelerin gelişmesini içerir. Bir strateji Car-t etkinliğini artırmak için ve/veya CAR-t hücrelerinin kontrol toksisiteleri Car-t hücre üretimi sırasında kendilerini CAR-k hücrelerinin genomu düzenlemek için. Burada, araç-T hücrelerinde CRISPR/Cas9 gen düzenlemenin, granülocayt makrophaj kolonisi uyarıcı faktörüne (GM-CSF) ve Cas9 için bir kılavuz RNA içeren bir lentiviral yapı ile dönüştürücü yoluyla kullanımını tarif ediyoruz. Örnek olarak, biz GM-CSF CRISPR/Cas9 aracılı nakavt açıklanmaktadır. Biz bu GM-CSFk/o Car-t hücrelerinin etkili daha az GM-CSF kritik T hücre fonksiyonu koruyarak ve gelişmiş anti-tümör aktivite içinde vivo VAHŞI tip Car-T hücrelere kıyasla sonuç ürettiğimiz göstermiştir.

Şekil 1 GM-CSFk/o CART19 HÜCRELERINDE GM-CSF azaltılması gösterir. T hücrelerinin genomunun, GM-CSF ' d e değiştirildiğini doğrulamak için, GM-CSFk/o CART19 hücrelerinde (ŞEKIL 1a) tid sıralaması kullanılmıştır. CAR-T hücre yüzeyi boyama, T hücrelerinin canlı CD3 + hücrelerde (Şekil 1B) gating tarafından araç yüzey reseptörü in vitro başarıyla ifade ettiğini doğrular. GM-CSF akı...

Burada, bir CRISPR/Cas9 sistemi üzerinden araç-T hücrelerini genetik olarak düzenlemek için bir protokol sunuyoruz.

CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Protokolümüz, DAHA etkili ve daha az toksik ürün üretmek için CRISPR teknolojisi ile üretim leri sırasında CAR-T hücresinin genetik modifikasyonu açıklar. Bu tekniğin bir avantajı CAR-T hücre üretimi ve genetik manipülasyon hem iyi verimlilik ile bir hücrede oluşabilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Rosalie Sterner, bir MD doktora öğrencisi, Michelle Cox, bir teknoloji ve yüksek lisans öğrencisi, ve Reona Sakemura, doktora sonrası adam, benim laboratuvar dan olacaktır.Hasat edilen periferik kan mononükleer hücrelerinden T-hücrelerini izole ettikten sonra, önce T-hücre ortamını hazırlayarak ve daha sonra 0,45 mikrometre steril vakum filtresi nden ve ardından 0,22 mikrometrelik steril vakum filtresi ile filtreleyerek sterilize ederek onları toplamaya başlayın. T-hücre stimülasyonu veya sıfır günü, stimülasyon dan önce, steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp boncuk gerekli hacmi yerleştirerek ve TCM bir mililitre resuspend cd3/CD28 boncukyı yıkayın. Bir dakika için bir mıknatıs ile temas tüp yerleştirin.Daha sonra TCM aspire ve taze TCM bir mililitre tekrar boncuk yıkamak ve üç yıkama toplam tekrar. Ve son olarak, tcm bir mililitre boncuk askıya. T-hücrelerini sayarak, boncukları t-hücrelerine üç ila bir boncuk oranında hücrelere aktarın.Daha sonra hücreleri mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonuna seyreltin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın, 24 saat boyunca %5 CO2. Lentiviral vektörde cart19 konstrüksiyonu aldıktan sonra, lentiviral plazmid, ambalaj vektörü, zarf vektörü, precomplexing reaktifi, transfeksiyon reaktifi ve transfeksiyon ortamını oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatarak lentiviral üretim gerçekleştirin. Hücre kültürü başlıkları, kişisel koruyucu ekipmanlar ve kullanılmış malzemelerin imha edilmeden önce çamaşır suyu ile dezenfeksiyonu da dahil olmak üzere BSL2+önlemler kullanarak lentiviral iş yapmak.Kuluçkadan sonra, bu transfeksiyon reaktiflerini %70-90'a ulaşan 293 T-hücresine ekleyin ve transfected hücreleri 37 santigrat derece ve %5 CO2'de kültüre aktarın. Transfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra, hasat, santrifüj, filtre ve ultrasantrifüj ile virüs içeren konsantre supernatant ve gelecekteki kullanım için eksi 80 santigrat derece donma. İlk gün, hücrelerin rozetlerini kırmak için sıfır gününde mililitre başına bir milyon hücrede uyarılan T-hücrelerini nazikçe yeniden askıya alın.Uygun BSL2+ önlemleri altında, 3.0 enfeksiyon çokluğu simüle T-hücrelerine taze veya dondurulmuş hasat virüs ekleyin. Transekten T hücrelerini 37 santigrat derecede, %5 CO2'de kuluçkaya yatırmaya devam edin. Üçüncü ve beşinci günlerde, CAR-T hücrelerini sayın ve mililitre başına bir milyon hücreden oluşan CAR-T hücre konsantrasyonu sağlamak için kültüre taze önceden ısıtılmış TCM ekleyin.Simülasyondan altı gün sonra, ilk hasat ve hücreleri yeniden sulama tarafından transduced T-hücrelerinden boncuk kaldırın. Hücreleri 50 mililitrelik konik tüpler halinde aktarın ve tüpleri bir dakika lığına mıknatısa yerleştirin. CAR-T hücre içeren supernatant toplandıktan ve boncuk atarak sonra, bir kültür şişesi mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu olarak kültür hücreleri geri yerleştirin.CAR'lerin yüzey ekspresyonunu değerlendirmek için akış sitometrisi için bir hücre örneği kullanın. Genişlemeye devam etmek için geri kalanını kuluçkaya yatırın ve sonra el yazmasında açıklandığı gibi sekizinci günde hücreleri hasat edip kriyo-korumak. Granülosit makrofaj koloniuyarıcı faktör bozmak için, el yazması açıklandığı gibi bir kılavuz RNA kullanmak.30 dakika oda sıcaklığında transfeksiyon reaktifleri inkübat. Kuluçkadan sonra, %70-90'a ulaşan 293 T hücresine ekleyin ve transfected hücreleri 37 santigrat derecede, %5 CO2'de merceksi bir virüs üretmek için kültüre dönüştürün. 24 ve 48 saat, hasat ve konsantre virüs içeren supernatant ultracentrifugation tarafından 50 mililitre ultracentrifuge tüpler ve eksi 80 derece santigrat gelecekteki kullanım için dondurma.Sonra ilk gün, rozetleri kırmak için T-hücrelerini nazikçe askıya alın. Bir BSL2 + onaylı laboratuvarda, CAR-T hücreleri oluşturmak için, simüle T-hücreleri CAR19 lentivirus ve GMCSF hedefleyen CRISPR lentivirus ekleyin. Puromisin direnci taşıyan lentiCRISPR tarafından düzenlenmiş T hücreleri için üçüncü gün ve beşinci gün, mililitrede bir mikrogram puromisin konsantrasyonu yla hücreleri puromisin dihidroklorürile tedavi edin.Gelgit sıralaması GM-CSF nakavt CART19 hücrelerinde bir GM-CSF azalma onaylamak için kullanılan yaklaşık bir bozulma verimliliği ile 71% CAR-T hücre yüzeyi canlı CD3-pozitif hücreler üzerinde gated akış arsalar hem vahşi tip CART19 ve GM-CSF nakavt CART19 başarıyla ve benzer bir moda içinde car yüzey reseptörü in vitro ifade göstermektedir. Öte yandan, gm-BOS'un akış sitometrisi ile hücre içi boyanması da canlı CD3-pozitif hücrelerde geçilen gm-CSF'nin nakavt hücrelerinde yaban tipi CART19 hücrelerine göre azalan ekspresyonun uyanışını göstermektedir. Genetik olarak modifiye edilmiş CAR-T hücrelerinin gelişimi için en kritik olan bu işlemin transdüksiyon adımları sırasında özellikle dikkatli olunmalıdır.Açıklanan metodoloji, daha az toksik ve daha etkili bir ürün üretmeye yardımcı olmak için CRISPR/CAS9 üzerinden CAR-T hücrelerini değiştirmek için çeşitli genlere uygulanabilir. CRISPR/CAS9 teknolojisi, car-t hücrelerinin genomunu doğrudan hedeflemek ve mevcut klinik eksikliklere çözümler tasarlamak için stratejiler sağlar.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Video, CRISPR-Cas9 Sistemi aracılığıyla genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücreleri oluşturma sürecini özetlemektedir. T hücrelerinin CRISPR ve CAR lentivirüsleri ile enfekte edilmesi, hedef gende modifikasyonlara ve bir kimerik antijen reseptörü veya CAR'ın sentezine neden olur ve sonuçta genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücrelerinin oluşumuna yol açar.

CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanarak CAR T Hücrelerini Genetik Olarak Değiştirme

Bu video, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak insan T hücrelerinde gen düzenlemesi yapmak için bir testi göstermektedir. Birincil CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir karışımı, nakavt için spesifik genleri hedefleyen bir CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi ile birleştirilir. Elektroporasyon üzerine, sgRNA, Cas9'u hedef DNA dizisine yönlendirerek hassas kesimler oluşturur. Bu kesikler daha sonra hücrenin homolog olmayan uç birleştirme mekanizması tarafından onarılır ve bu da gen nakavtına yol...

T Hücrelerinde Gen Düzenleme için Bir CRISPR-Cas9 Tekniği

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Burada, CAR-T hücrelerini değiştirmek için CRISPR Cas Teknolojisini kullanarak birincil insan T hücrelerinde gen düzenleme protokolü sunuyoruz.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Makale, sağlıklı donör kimerik antijen reseptörü T hücrelerinde genom çapında bir CRISPR nakavt ekranını tamamlamak için tükenme için bir in vitro modelin uygulanması için bir protokolü açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Birincil CAR T hücreleri için optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 knockout tarama protokolü geliştirdik. Enzimatik sindirim ve sgRNA kaseti çekilmesiyle gDNA taşınmasını azaltarak, bu yaklaşım PCR artefaktlarını en aza indirerek doğru sgRNA tespitini ve fonksiyonel gen hedeflerinin sağlam tanımlanmasını sağlar.

CAR T Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Ekranlarının İyileştirmesi: Kütüphane Hazırlığı için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Öğrenin CAR-T hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile GM-CSF genini devre dışı bırakma yöntemini. Bu protokol, immünoterapi üretiminde genetik mühendisliği uygulayarak daha etkili ve daha az toksik kanser tedavileri geliştirmeyi amaçlar.

CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma

Daha fazla video keşfet