Name: Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Keşfedin, embriyonik kök hücrelerden granülosit-makrofaj kolonisi uyarıcı faktör taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri izole etme yöntemini. Bu protokol bağışıklık yanıtını düzenleyebilen yüksek kaliteli vezikül üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İletim elektron mikroskop görüntülerini elde eden Arkadiusz Slusarczyk ve Kentucky Biyomedikal Araştırma Altyapı Ağı'na (KBRIN, P20GM103436) minnettarız. Bu çalışma kısmen NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 ve CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) ve Free to Breathe Research Grant (K.Y.) hibeleri ile desteklendi.

1. ES-D3 hücrelerinin kült örültme
<ol><li>Eksozom içermeyen fetal sığır serumu (FBS) oluşturmak için FBS'yi 4 °C'de 16 saat boyunca 100.000 x g'da ultracentrifuge ve santrifüje yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, ES-D3 murine ESC hücre hattını kültleştirmek ve ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler elde etmek için ekzozom içermeyen FBS olarak serum supernatant toplayın.</li>
	<li>ES-D3 hücrelerini kaplamadan önce, 15 cm doku kültürü yemeklerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca jelatin (%0,1) kullanarak kaplayın.</li>
	<li>Daha önce açıklanan bir protokol16'nınardından, jelatin kaplı 15 cm doku kültürü yemeklerinde besleyici katman hücreleri olmayan ES-D3 hücrelerini kültürleyin. ES-D3 hücre kültürü ortamı DMEM'den oluşur, ekzozom içermeyen FBS (%15), gereksiz amino asitler (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penisilin (50 birim/mL), streptomisin (50 μg/mL) ve lösemi inhibitör faktörü (LIF; 100 birim/mL). %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de kültür ES-D3 hücreleri.</li>
	<li>ES-D3 hücreleri 15 cm'lik doku kültürü yemeklerinde yaklaşık% 90 izdiah ulaştığında, ortamı aspirasyonla çıkarın. Hücreleri tripsin kullanarak yıkayın (%5 mL; %0,05). Yemeklere tripsin (5 mL) ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri bulaşıklardan toplayın.</li>
	<li>Trypsin'i devre dışı bırakmak için toplanan hücrelere taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri taze ortamda yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin.</li>
	<li>Hücreleri geçirmek için, ES-D3 hücrelerini (5 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm'lik bir doku kültürü çanağı ile taze orta (15 mL) ve kültür ile 3 gün boyunca plakalayın.</li>
	<li>Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin izolasyonu için hücre kültürü üstnatantını toplamak için, hücre kültürü süpernatantı toplamadan önce 3 gün boyunca ES-D3 hücrelerini (1 x 107)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm doku kültürü kabında taze orta (15 mL) ile tabaklayın.</li>
</ol>2. GM-CSF ekspresyon plazmid üretimi
NOT: GM-CSF'yi ES-D3 hücrelerinde aşırı ifade etmek için transfection plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturun. Bu plazmidde, murine GM-CSF cDNA'nın marker proteini ile birlikte renilla reniformis GFP (hrGFP) ifadesi, insan polipeptid zincir uzama faktörü 1α (EF1α) promotörü17,18tarafından tahrik edilir.
<ol><li>Vektör omurgasını oluşturun.<ol>
<li>İki DNA parçası oluşturmak için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI (100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP 'yi (20 μg DNA) sindirin: vektör omurgası (6,0 kb) ve FD3ER kesici ucu (2,5 kb).</li>
		<li>Sindirilmiş plazmid DNA'nın (10 μg) %50'sini bir adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 saat boyunca 37 °C'de alkali fosfataz (20 birim) ile tedavi edin. Agarose jel elektroforez (%2) kullanarak hem tedavi edilmemiş hem de defosforillenmiş DNA'yı çözün.</li>
		<li>Vektör omurga DNA parçalarını (6,0 kb) DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırın. Tedavi edilmemiş vektör omurgası boş vektör (pEF1α-IRES-hrGFP) görevi görecekken, defosforillenmiş vektör omurgası GM-CSF ifade eden plazmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) oluşturmak için kullanılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSF cDNA kesici ucu oluşturun.<ol>
<li>İki DNA parçası üretmek için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI(100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP 19 'u (20 μg) sindirin: vektör omurgası (6,5 kb) ve murine GM-CSF cDNA kesici ucu (474 bp).</li>
		<li>Sindirilen DNA'yı agarose jel elektroforezi (%2) ile çözün. DNA jel çıkarma kiti kullanarak murine GM-CSF cDNA parçasını (474 bp) arındırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İfade plazmidlerini oluşturun.<ol>
<li>DNA ligasyon kiti kullanarak 2 ligasyon reaksiyonunu (10 μL toplam hacim) ayarlayın.<ol>
<li>Boş vektör pEF1α-IRES-hrGFP'yi oluşturmak için, işlenmemiş vektör omurgasını adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) kesin.</li>
			<li>pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturmak için, aşağıdaki DNA parçalarını birleştirir: (1) adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) ve (2) adım 2.2.2'de (474 bp; 200 ng) oluşturulan mGM-CSF cDNA parçasından defosforillenmiş vektör omurgası.</li>
		</ol>
</li>
		<li>5 dakika boyunca 25 °C'de ligat. Liglenmiş DNA'yı DH5α yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. Dönüştürülmüş E. coli hücrelerini karbenisilin (50 μg/mL) içeren LB-agar plakaları üzerine plakalayın.</li>
		<li>DNA izolasyon kiti kullanarak plazmidleri tek E. coli kolonilerinden arındırın. Plazmidlerin kimliklerini DNA dizilimi ile doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinin üretimi
NOT: GM-CS'yi aşırı ifade etmek için ES-D3 hücrelerini plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP ile transfect. Plazmid pBabe-Neo'yu ES-D3 hücrelerine kotransfect18,20.
<ol><li>Plazmidleri ES-D3 hücrelerine aktarın.<ol>
<li>ES-D3 hücrelerini (1,4 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 10 cm'lik doku kültürü çanağı ile transfeksiyon için kültür ortamı (10 mL) ile plakalayın. Kültür kaplamalı ES-D3 hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca.</li>
		<li>1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iki plazmid karışımı hazırlayın: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektör kontrolü) ile pBabe-Neo (4 μg) ve (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-CSF ifade eden) pBabe-Neo (4 μg). Transfection'ı, üreticinin protokolünü izleyerek bir transfection kiti kullanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Plazmid karışımlarını içeren her tüpe transfeksiyon ortamı (1 mL) ve transfeksiyon reaktifi (64 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın.</li>
		<li>Transfeksiyon karışımlarını ES-D3 hücrelerinin ilgili 10 cm'lik yemeklerine ekleyin. 5 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>10 cm'lik yemeklerdeki ortamı taze kültür ortamıyla (10 mL) değiştirin. 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonlarını oluşturun.<ol>
<li>Ortamı transfected ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%2 mL; %0,05). Tripsin (2 mL) ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır. Hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve tripsin nötralize etmek için 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj.</li>
		<li>Transknakte olmuş hücreleri taze kültür ortamında (10 mL) yeniden biriktirin. Üreticinin protokolünü izleyerek floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanarak transfected ES-D3 hücrelerinde GFP'nin floresan yoğunluğunu değerlendirin.</li>
		<li>Transfected hücreleri taze kültür ortamı (10 mL) içeren iki adet 10 cm'lik yemeklere aktarın. Bulaşmamış hücreleri ortadan kaldırmak için nembilin (0,5 mg/mL) ekleyin.</li>
		<li>Transkredaklı hücreleri neomisin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamında kültlü çalışmaya devam edin. Transfected ES-D3% 90 izdiah ulaştığında, hücreleri tekrar 15 cm doku kültürü yemeklerine aktarın. İşlemi 2 hafta boyunca tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stably transfected ES-D3 hücrelerinin klonlarını oluşturun.<ol>
<li>Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonları oluşturulduktan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi toplayın. Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri (1 x 107 hücre/mL) taze kültür ortamında yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hücreleri steril 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin. Üreticinin protokolüne uyarak FACS kullanarak GFP pozitif ES-D3 hücrelerini arındırın.</li>
		<li>Tek sıralanmış bir ES-D3 hücresini, yenidoğan içermeyen ortamda (200 μL) ebeveyn ES-D3 hücreleri (1 x 103)içeren jelatin kaplı (%0,1) 96 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyusuna plakalayın. Transtransfected ES-D3 hücrelerinin, transtrans enfekte olmayan ebeveyn meslektaşlarıyla birlikte kült halineilmesi, enfekte olmuş tek ES-D3 hücrelerinin tek bir klon olarak hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlar.</li>
		<li>Hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin ve daha sonra 96 kuyu plakalarına nembilin (0,5 mg / mL) ekleyerek enfekte olmayan ebeveyn ES-D3 hücrelerini ortadan kaldırın.</li>
		<li>GFP pozitif ES-D3 hücrelerini 1 hafta boyunca orta boy nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren 96 kuyu doku kültürü plakalarında kültleştirmeye devam edin. Klonal ES-D3 hücre hatlarını 1 hafta boyunca nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamı (5 mL) ile jelatin kaplı (%0,1) 6 cm doku kültürü yemeklerine aktarın.</li>
		<li>Üreticinin protokolüne uyarak, FACS kullanarak transfected ES-D3 hücre klonlarının her birinde GFP floresanının yoğunluğunu belirleyin. GM-CSF'yi veya yüksek düzeyde yeşil floresan içeren boş vektörü ifade eden ES-D3 klonlarını seçin.</li>
		<li>Üreticinin protokolüne uyarak, bir murine GM-CSF ELISA kiti kullanarak ES-D3 hücreleri tarafından salgılanan GM-CSF miktarlarını belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin izolasyonu
<ol><li>ES-D3 hücrelerini (1 x 107) 15cm doku kültürü yemeklerinde 37 °C'de 72 saat boyunca kültür edin. Hücre kültürü üstnatant toplamak. Mağaza, ekzomal bütünlüğü korumak için 1 haftaya kadar 4 °C'de süpernatant topladı.</li>
	<li>Büyük hücre parçalarını yatıştırmak için bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 60 dakika boyunca 5.000 x g'da hücre kültürü üstnatantını santrifüj edin.</li>
	<li>Bir ultracentrifuge kullanarak 4 °C'de 90 dakika boyunca 100.000 x g'da süpernatant ve santrifüjü toplayın.</li>
	<li>Üsttekini çıkarın. Kalan kültür üstnatantı kaldırmak için her peleti fosfat tamponlu salin (PBS; 1 mL) ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Her peleti PBS'de yeniden diritin. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri protein içeriğine göre ölçün5.<ol>
<li>Ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'lerin protein konsantrasyonlarını bicinkoninik asit (BCA) tahlili ile ölçün. ES-D3 hücrelerinden beklenen ekzozom zenginleştirilmiş EV verimi, hücre kültürü süpernatantının yaklaşık 4 μg proteini / mL'dir. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri PBS'de yeniden canlandırın (protein konsantrasyonu: ~6 μg/μL). Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin iletim elektron mikroskopisi ile karakterizasyonu
NOT: İletim elektron mikroskopisi (TEM) 5 kullanarak ESC'lerden izole edilen ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerin bileşimini ve yapısını araştırın5.
<ol><li>Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (3-5 μg/μL) oda sıcaklığında 2 saat boyunca %2 EM sınıfı paraformaldehit konsantrasyonu ile sabitlayın.</li>
	<li>Sabit numuneleri (10 μL) karbon destek filmi ile bakır ızgaralara yükleyin. Numuneleri bakır ızgaralarla 1 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından ızgaraları filtre kağıdı ile boşaltın.</li>
	<li>Izgaraları üreticinin protokolüne uygun bir boyama çözeltisi ile lekelendirin.</li>
	<li>Izgaraları cımbız kullanarak bir filtre kağıdı parçasına aktarın. Izgaraların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Üreticinin protokolüne uyarak bir iletim elektron mikroskobu (50.000x büyütme) kullanarak elektron mikroskopi görüntüleri elde edin.</li>
</ol>6. Ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin batı leke analizi ile değerlendirilmesi
<ol><li>Tüm hücre özlerini hazırlayın.<ol>
<li>Ortamı 15 cm'lik yemeklerde kültürlenmiş ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%5 mL; %0,05). Hücrelere tripsin (5 mL) ekleyin. 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Hücreleri toplayın ve tripsin nötralize etmek için taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. PBS'deki hücreleri yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da tekrar santrifüj edin. %0,5 SDS (5.000 hücre/μL) içeren SDS-PAGE yükleme arabelleğindeki hücreleri yeniden kullanın.</li>
		<li>Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin lizazlarını hazırlayın.<ol>
<li>Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri 1,2 μg/μL konsantrasyonda %0,5 SDS içeren SDS-PAGE yükleme tamponunda yeniden kullanın.</li>
		<li>Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteinleri Batı lekesi ile tespit edin.<ol>
<li>Bis-Tris PAGE jelinin her kuyusuna (%4-20) tam hücre özleri (10 μL; 5.000 hücre/μL) ve eksozomla zenginleştirilmiş EV lizazları (10 μL; 1,2 μg/μL) yükleyin. Proteinleri polivinylidene florür (PVDF) membranlarına aktarın.</li>
		<li>Membranları uygun primer ve sekonder antikorlarla kuluçkaya yatır. PBS, Ara-20 (%0,2) ve yağsız kuru süt (%10 w/v) içeren şişirme tamponunda antikorları seyreltin (aşağıda belirtilen konsantrasyonlarda).<ol>
<li>Aşağıdaki primer antikorları kullanın: anti-Annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-sitokrom c (100 ng/mL), anti-protein disülfit isomerase (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) ve anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).</li>
			<li>Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan IgG (20 ng/mL) ve peroksidaz konjuge keçi anti-fare IgG (20 ng/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gelişmiş bir kemimuminesans tespit kiti kullanarak proteinleri tespit edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ELISA tarafından ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerde GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi
NOT: Üreticinin bazı değişikliklerle yaptığı protokolü izleyerek, ELSA tarafından murine GM-CSF için bir kit kullanarak exozom zenginleştirilmiş EV'lerdeki GM-CSF miktarlarını değerlendirin.
<ol><li>ELISA plakasını yakalama antikor ile kapla. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (0,6 μg) sadece PBS'de veya PBS + %0,05 Ara-20 (100 μL) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin. Kaplamalı ELISA plakasına işlenmiş numuneler ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.</li>
	<li>Örneklere algılama antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın. Örneklere Avidin-HRP ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.</li>
	<li>Mikro plaka okuyucuda emiciliği 450 nm olarak ölçerek ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerde GM-CSF konsantrasyonlarını belirleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases%3A+From+principles+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li>
<li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li>
<li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li>
<li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+%28TEX%29+in+Cancer+Immunity%3A+Is+It+All+in+the+ConTEXt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li>
<li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF%3A+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li>
<li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li>
<li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+data+from+2+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li>
<li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li>
<li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent%2C+specific%2C+and+long-lasting+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li>
<li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTremml%2C+G+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , (2008).</li>
<li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells%3A+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li>
<li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer%3A+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?</a> PLoS One. 7 (7), e42289(2012).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , (2006).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li>
<li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).</li>
<li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li>
<li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).</li>
</ol>

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li ve John W. Eaton ABD patent başvurusunda "Mühendislik embriyonik kök hücre türevli ekzozomları ve kullanım yöntemlerini içeren kompozisyonlar" sundular.

Bu çalışma, ekozomla zenginleştirilmiş EV'lerin bağışıklık modülatörü etkilerini incelemek için sunulabilen bağışıklık uyarıcı protein GM-CSF'yi taşıyan ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için son derece verimli bir yöntem göstermektedir. Çeşitli çalışmalar ekzomların bağışıklık düzenleyici ve anti-tümör fonksiyonları sergilediğini göstermektedir22. Bu nedenle, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden gelen ekzozomlar da bağışıklık yanıtını düzenleyen biyolojik faaliyetlere sahip olabilir....

ESC'ler preimplantasyon embriyosunun blastosist aşamasından türetilir1. Pluripotent kök hücreler olarak, ESC'ler her türlü embriyonik hücreye kendi kendini yenileme ve ayırt etme yeteneğine sahiptir. Olağanüstü gelişimsel potansiyelleri ve uzun vadeli proliferatif kapasiteleri nedeniyle, ESC'ler biyomedikal araştırmalar için son derece değerlidir1. Mevcut araştırma çalışmaları büyük ölçüde DIYABET, kalp hastalığı ve nörodejeneratif hastalıklar 2,3,4dahil olmak üzere çeşitli ana patolojik bozukluklar için ESC'lerin terapötikpotansiyelineodaklanmıştır.
ESC'ler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin hücre dışı ortama değişken boyutlarda veziküller salması bilinmektedir ve bu EV'ler hücreler arası iletişimdeki rolleri nedeniyle birçok fizyolojik ve patolojik işleve sahiptir5. EV'lerin farklı alt tipleri arasında, ekzozomlar, çeşitli hücre tiplerinden, ara endosit bölmelerin, çokvesiküler gövdelerin (MVB'ler) plazma membran6ile füzyonu üzerine hücre dışı boşluğa salınan küçük membran vezikülleridir. Ekzozomların hücreler arası iletişime aracılık yaptığı ve birçok (pato)fizyolojik süreçlerde kritik rol aldığı bildirilmiştir7,8. Ekzozomlar bazı biyolojik işlevleri kendi ebeveyn hücrelerinden miras alırlar, çünkü ekzozomlar proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere sitozolden elde edilen biyolojik malzemeler içerir. Bu nedenle, belirli bir hastalığa özgü immün yanıtı uyarıcı ilişkili antijenler veya faktörler, belirli hücre türlerinden ekzozomlarda kapsüllenir9. Bu, kanser önleyici bir aşı olarak tümör türevi ekzozomları araştıran klinik çalışmaların önünü açtı10.
GM-CSF, farklı bağışıklık hücreleri tarafından salgılanan bir sitokindir11. Ortaya çıkan kanıtlar, GM-CSF'nin bağışıklık sistemini aktive ettiğini ve düzenlediğini ve antijen sunma sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir12. Örneğin, bir klinik rapor GM-CSF'nin tümörlere karşı bağışıklık tepkisini bir aşı adjuvan13olarak uyardığını göstermektedir. KLINIK DENEYLERDE GM-CSF'nin güçlü immün uyarıcı aktivitesini kullanmak için çeşitli GM-CSF tabanlı kanser immünoterapi stratejileri araştırılmıştır14. Bunlar arasında, ışınlanmış GM-CSF salgılayan tümör hücrelerinden oluşan bir kanser aşısı, metastazlı tümörlerde hücresel ve humoral antitümör yanıtları ve sonraki nekrozu indükleyerek ileri melanom hastalarında bazı vaatlerde bulundu15.
ESC'lerden elde edilen ekzozomlar orijinal ESC'lerle benzer biyolojik aktivitelere sahip olduğundan, belki ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozomlar bağışıklık tepkisini düzenlemek için hücresiz veziküller olarak işlev görebilirim. Bu makalede, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmıştır. Bu ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık tepkisini modüle etmek için bağışıklık düzenleyici veziklinler olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Alkali fosfat, Buzağı Bağırsağı</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Fosforilleyici DNA plazmid</td></tr><tr><td>anti-Annexin V mAb</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>klonu H-3, sc-74438</td><td>Western blot, RRID:AB_1118989</td></tr><tr><td>anti-CD81 mAb</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>klonu B-11, sc-166029</td><td>Western blot, RRID:AB_2275892</td></tr><tr><td>anti-sitokrom c mAb</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>klonu A-8, sc-13156</td><td>Batı lekesi, RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>anti-Flotillin-1 mAb</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>klonu C-2; sc-74566</td><td>Batı lekesi, RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>anti-GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>Batı lekesi, RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>anti-fare IgG, keçi, peroksidaz konjuge</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td><td>Batı lekesi, RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>anti-Oxphos COX IV-alt birim IV mAb</td><td>Thermo Fisher</td><td>klonu 20E8C12 A21348</td><td>Batı lekesi, RRID: AB_221509</td></tr><tr><td>anti-protein disülfid izomeraz (PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>Batı lekesi, RRID: AB_10616242</td></tr><tr><td>anti-tavşan IgG, keçi, peroksidaz konjuge</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Western blot, RRID: AB_228341</td></tr><tr><td>BCA (bikinkoninik asit) testi</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>Protein konsantrasyonlarının belirlenmesi</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Jel, ExpressPlus, %4-20</td> <td>Genscript</td><td>M42015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Karbenisilin, Disodyum Tuzu</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>E. coli kolonilerinin seçilmesi</td></tr><tr><td>Santrifüj, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Düşük hızlı santrifüjleme</td></tr><tr><td>Santrifüj rotoru, JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U1597</td><td>Düşük hızlı santrifüj</td></tr><tr><td>Santrifüj şişesi, Nalgene PPCO</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td> Karbon destek filmi ile <td>düşük hızlı santrifüjleme</td></tr><tr><td>Cu ızgaraları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>FF200-Cu</td><td>Elektron mikroskobu görüntülerinin alınması</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>Sindirim DNA plazmidi</td></tr><tr><td>Gelişmiş kemilüminesans algılama sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>FACScalibur akış sitometresi</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>ES-D3 hücrelerinin GFP seviyelerinin incelenmesi</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td></td><td>ATCC SCRR-30-2020</td><td>ES-D3 hücreleri için ortam</td></tr><tr><td>Fisherbrand Steril Hücre Süzgeçleri; Kafes Boyutu: 40 & mu; m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>FACS sıralaması için ES-D3 hücrelerinin filtrelenmesi</td></tr><tr><td>Jelatin (%0,1)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>ES-D3 hücrelerinin kültürlenmesi</td></tr><tr><td>GM-CSF ELISA kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>88733422</td><td>GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi</td></tr><tr><td>Dulbecco'yu nakavt etme s Modifiye Kartal' </td><td>ES-D3 hücreleri için</td>s Medium <td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td> Medium</tr><tr><td>Lösemi İnhibitör Faktör</td><td>ES-D3 hücreleri için</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td> Medium</tr><tr><td>ES-D3 hücreleri için</td><td>L-glutamin</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td> Ortamı</tr><tr><td>Lipofektamin 2000 transfeksiyon reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>ES-D3 hücrelerini aktarma</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu, PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi</td></tr><tr><td>MoFlo XDP yüksek hızlı hücre sıralayıcı</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Tek ES-D3 hücre klonlarının izole edilmesi</td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Yetkin E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>GM-CSF ekspresyonu plazmid oluşturma</td></tr><tr><td>Neomisin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-131-035</td><td>ES-D3 klonlarının seçilmesi</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td></td><td>ES-D3 hücreleri için</td>Thermo Fisher <td>SH3023801</td> Medium</tr><tr><td>Yağsız kuru süt</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>ES-D3 hücrelerinin transfekte edilmesi</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>Elektron mikroskobu görüntülerinin elde edilmesi</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>ES-D3 hücreleri için ortam</td></tr><tr><td>Plazmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>GM-CSF ekspresyonu plazmid</td></tr><tr><td>PVDF membranlarının</td> oluşturulması <td>Millipore EMD</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>GM-CSF ekspresyonu plazmid oluşturma</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>GM-CSF ekspresyonu plazmidi oluşturma</td></tr><tr><td>Hızlı Ligasyon Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>GM-CSF ekspresyonu plazmid oluşturma</td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>Elektron mikroskobu görüntülerinin alınması</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>ES-D3 hücrelerinin kültürlenmesi</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj, OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>High hızlı santrifüjleme</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj rotoru, 45Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>Yüksek hızlı santrifüjleme</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj polikarbonat şişe</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td>Yüksek hızlı santrifüjleme</td></tr><tr><td>UranyLess boyama çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>22409</td><td>Elektron mikroskobu görüntülerinin elde edilmesi</td></tr></tbody></table>

embriyonik kök hücrelerden granülosit-makrofaj kolonisi uyarıcı faktör taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin İzolasyonu

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Embriyonik kök hücreler (ESC' ler), kendini yenileyebilen ve her türlü embriyonik hücreye ayırabilen pluripotent kök hücrelerdir. Diğer birçok hücre tipi gibi, ESC'ler de ekzomlar gibi küçük membran vesiklelerini hücre dışı ortama bırakır. Ekzozomlar hücreler arası iletişimin temel arabulucuları olarak hizmet eder ve birçok (pato) fizyolojik süreçte temel bir rol oynar. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) immün yanıtı modüle etmek için bir sitokin olarak işlev eder. Eksozomlarda GM-CSF varlığı, bağışıklık düzenleyici işlevlerini artırma potansiyeline sahiptir. Burada, GM-CSF, ES-D3 numaralı murine ESC hücre hattında bıçaklanarak aşırı ifade edildi. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinden yüksek kaliteli eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri (EV) izole etmek için bir protokol geliştirilmiştir. İzole ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler çeşitli deneysel yaklaşımlarla karakterize edildi. Daha da önemlisi, eksozom zenginleştirilmiş EV'lerde önemli miktarda GM-CSF bulunduğu bulunmuştur. Genel olarak, ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık düzenleyici faaliyetlerini uygulamak için hücresiz veziküller olarak işlev görebilir.

GM-CSF, murine ESC'lerde aşırı ifade edilir. ES-D3 hücrelerinde GM-CSF'yi kesin bir şekilde aşırı ifade etmek için, murine GM-CSF cDNA, pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Şekil 1A)ifade vektörünü oluşturmak için bir transfeksiyon vektörüne klonlandı. GM-CSF, ES-D3 hücrelerinde transfeksiyon ile aşırı ifade edildi ve geçici olarak transktaklı ES-D3 hücrelerinin yaklaşık% 20'si GFP pozitifti. GM-CSF'yi veya boş vektör kontrolünü kast...

Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Protokolümüz, immün uyarıcı faktör olan GM-CSF'yi ifade eden embriyonik kök hücrelerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziküller üretmek için kullanılabilir. GM-CSF taşıyan eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinler, bağışıklık tepkisini modüle edebilecek hücresiz bir bağışıklık düzenleyici veziklinlere hizmet etme potansiyeline sahiptir. Temel moleküler ve hücresel biyoloji eğitimine sahip araştırmacılar, bu protokol gibi kolayca yapabilmeli, ancak bu protokolü ilk kez gerçekleştiren herkes talimatları yakından takip etmelidir.Protokolümüz karmaşık olduğundan, her adımın karmaşık ayrıntılarını görselleştirmek, diğer araştırmacıların eksozom içermeyen FBS üretmelerine, istenen FBS hacmini ultracentrifuge etmelerine ve eksozom içermeyen süpernatantı toplamalarına yardımcı olacaktır. ESD üç hücresini kaplamadan önce, 15 santimetrelik doku kültürü yemeklerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0,1 Jelatin ile kaplayın. Aspirasyon ve kültür ile Jelatin çıkarın ESD'de besleyici katman hücresi olmayan ESD üç hücreli üç hücre, hücreler% 90 izdiah edene kadar% 5 Karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede orta.Neredeyse bir aradaki kültürleri, yemek başına beş mililitre %0,05 trypsin ile yıkayın ve ardından taze tripsinlerde 37 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyon. Kuluçkanın sonunda müstakil hücreleri bir santrifüj tüpüne çekin ve trypsin'i beş mililitre taze kültür ortamı ile etkisiz hale getirin. Hücreleri santrifüjleme ile tortulayın ve paletleri geçmek için saymak için taze ortamda yeniden askıya alın, plaka beş kez 10 ila altıncı ESD hücre kültürü 15 mililitre hücre kültürü orta yeni Jelatin kaplamalı plakalar üzerinde üç gün kültür alt kültleme önce hücre kültürü supernatant ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezne plakasının izolasyonu için toplamak için bir kez 10 kez yedinci ESD üç hücre 15 hücre kültürü mililitreleri yeni Jelatin kaplı plaka başına üç gün boyunca hücre kültürü süpernatantlarını toplamadan önce ekzozom zenginleştirilmiş ekstra hücresel veziklin izolasyonu için, İlk önce 72 saat kültürlenmiş ESD üç hücreden toplanan süpernatantlar içindeki büyük hücre parçalarını santrifüjleme ile yatıştırın.Süpernatantı topladıktan sonra, Ultracentrifuge örnekleri ve süpernatantları atın. Üreticinin talimatına göre, herhangi bir kalıntı kültür üstnatanını çıkarmak ve ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikül protein içeriğini Bicinchoninic asit tahlili ile ölçmek için her paleti yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez hafifçe durulayın. Daha sonra pbs'deki eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri eksi 80 santigrat derecede depolamak için mikro metre konsantrasyonu başına altı mikrogram olarak yeniden askıya alın.Ekstrakom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri iletim elektron mikroskopisi ile görselleştirmek için, hücre dışı veziklin mililitre başına üç ila beş mikrogramı, oda sıcaklığında iki saat boyunca% 2 elektron mikroskop ızgara paraformaldehit son konsantrasyonu ile sabitlemek. Kuluçkanın sonunda, sabit numunelerin 10 mikrolitresini filtre kağıdı ile ızgaraları boşaltmadan önce bir dakika boyunca karbon destek filmi ile Bakır Izgaralara yükleyin, üreticinin protokolüne göre uygun bir boyama çözeltisi ile ızgaralarda kalın ve ızgaraları bir filtre kağıdı parçasına aktarmak için cımbız kullanın, daha sonra standart protokollere göre elektron mikroskopi görüntüleri elde etmek için iletim elektron mikroskobu 50.000 kat büyütme ile kullanın. Tüm Hücre Özlerini hazırlamak için, gösterildiği gibi kültürden ESD üç hücre toplayın ve PBS'de hasat edilen hücreleri sayım için yeniden askıya alın.İkinci bir santrifüjlemeden sonra, %0,5 SDS konsantrasyonu içeren SDS sayfa yükleme tamponunun mikroliteri başına beş çarpı 10'dan üçüncü hücrelere kadar hücreleri yeniden askıya alın ve örnekleri %10 genlikli bir Sonicator'da 10 saniye boyunca sonicate edin. Daha sonra numuneleri 100 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziküller için lizaz hazırlamak, Mikroliter konsantrasyonu başına 1,2 mikrogramda %0,5 SDS içeren SDS sayfa yükleme tamponunda eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri yeniden askıya alın ve numuneleri gösterildiği gibi 10 saniye boyunca sonicate edin, ardından numuneleri beş dakika boyunca 100 santigrat derecede ısıtın.Batı Blot Analizi için, 10 mikrolitre toptan ekstrakt ve ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklin lizat örneklerini en iyi stres sayfası jelinin bireysel Kuyularına yükleyin. Koşunun sonunda, proteinleri PVDF membranlarına aktarın ve membranları uygun birincil ve ikincil ilgi antikorlarıyla kuluçkaya yatırın, ardından üreticinin talimatlarına göre gelişmiş bir kemümilüminesans tespit kiti kullanarak protein ekspresyonunun tespit edilmesi. Exozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerde GM-CSF miktarını değerlendirmek, Bir ELISA Plakasını anti GM-CSF yakalama antikoru ile kaplamak için bir kit kullanın, 0,6 mikrogram ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklin örneğini sadece 100 mikrolitre PBS ile veya PBS artı 0,05% ara 20 oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin.Kuluçkanın sonunda, tedavi edilen numuneleri oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için hazırlanan ELISA Plakasının bireysel Kuyularına ekleyin ve ardından uygun karşılık gelen Kuyuların sadece PBS ile yıkanması veya PBS artı% 0.05 ara 20. Yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için numunelere algılama antikorunu ekleyin ve ardından sadece PBS veya PBS ile yıkama artı gösterildiği gibi% 0.05 ara 20, Daha sonra oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için numunelere Avidin Yaban Turpu Peroksidaz ekleyin, ardından 450 nanometrede bir Mikro plaka Okuyucusunda her kuyudaki emiciliği yıkayın ve ölçün. ESD üç hücre hattını veya boş bir vektörü ifade eden bir ESD üç hücre hattını ifade eden bir GM-CSF'nin GFP floresan yoğunluğu, ebeveyn meslektaşlarından çok daha yüksektir.ELISA, GM-CSF'yi ifade eden ESD üç hücresinin hücre kültüründe boş vektör kontrol hücrelerinden belirgin şekilde daha yüksek gmcsf seviyeleri ürettiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, GM-CSF'nin ESD üç hücresini ifade ederek ürettiği GM-CSF miktarı, GM-CSF'yi ifade eden STO fibroblastları tarafından üretilene benzer. Vektör transdüklenmiş ve GM-CSF transdüklenmiş hücre kültürlerinden izole edilmiş hücre dışı veziküllerin iletim elektron mikroskopisi, beklenen 30 ila 100 nanometre çap aralığına giren farklı boyutlardaki vezikülleri ortaya koymaktadır.CD81, Annexin V ve flotillin-1 dahil olmak üzere ekzomal belirteçlerin ekspresyözü, Batı blot analizi ile karşılık gelen toptan özlere kıyasla ESD üç hücresinden izole edilmiş hücre dışı veziklilerde belirgin bir şekilde geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, endoplazmik retikulum belirteci, Protein Disülfit Isomerase, mitokondriyal belirteçler, sitokrom C ve Oxphos kompleks IV-subunit IV ve sitozolik belirteç GAPDH dahil olmak üzere ESD türevli üç hücre dışı vezikülde diğer hücresel altı bölme belirteçlerinin varlığı saptanmamıştır. %0,05 ara 20 ile yıkandıktan sonra, hücre dışı veziklikleri kontrolde tespit edilen arka plan GM-CSF seviyeleri önemli ölçüde azaltıldı.Buna karşılık, GM-CSF ekspresyatör hücrelerinin hücre dışı vezikliklerindeki GM-CSF seviyeleri 20 ara ile önemli ölçüde artmıştır. GMCSF taşıyan yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezneler elde etmek, bu protokolün başarısı için en önemli adımdır. Araştırmacılar, GM-CSF'ye bağımlı hücre hatlarındaki ve hayvanlardaki çalışmalar gibi ek deneyler gerçekleştirerek GM-CSF'ye bakan eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinlerin hücresiz bağışıklık düzenleyici veziküller olarak işlev görüp göremeyeceğini belirleyebilirler.Bu eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezneler daha sonra immün yanıtın modülasyonunun farklı hastalık koşullarını nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, beyin bağışıklık hücrelerinden (mikroglia) türetilen hücre dışı vezikülleri veya EV'leri izole etmek için boyut dışlama kromatografisine (SEC) dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. EV'ler, bir bağışıklık tepkisini düzenleyen aracıları iletmek için moleküler kargo görevi görür. Bu nedenle, izole edilmiş EV'ler, bir nöronal bağışıklık tepkisi sırasında mikroglia-nöron karışmasını incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Mikroglia Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin SEC Tabanlı İzolasyonu: Mikroglia Şartlandırılmış Kültür Ortamından Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Ekzozom uygulaması ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir araçtır. Mekanistik çalışmalar için CB-SC adı verilen yeni tanımlanmış kök hücrelerden ekzozomları izole etmek için yüksek saflıkta bir ekzozom izolasyon protokolü uyguluyoruz. Ayrıca insan monositleri ile CB-SC kaynaklı ekzozomlar, fenotipik farklı makrofajlar içine farklılaşmayol eşkültür.

Monositlerin İnsan Kordon Kan Kök Hücresi (CB-SC)-Türetilmiş Ekzozomlar Ile Tedavi Sonrası Fenotipik Farklı Makrofajlara Farklılaşması

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

Kemik sarkomlarda kanser kök hücrelerinin varlığı (rulmanları) son zamanlarda onların patogenezi ile bağlantılı olmuştur. Bu makalede, yapışmayan koşullarda büyümeye CSCS yeteneğini kullanılarak geleneksel osteosarkoma (OS) insan biyopsilerinden elde edilen birincil hücre kültürlerinden CSCS izole sunulmuştur.

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

Keşfedin, embriyonik kök hücrelerden granülosit-makrofaj kolonisi uyarıcı faktör taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri izole etme yöntemini. Bu protokol bağışıklık yanıtını düzenleyebilen yüksek kaliteli vezikül üretimi sağlar.

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet