Name: Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Keşfedin, bakteri, maya ve insan hücrelerinde geçici şaperon komplekslerinin yerinde izlenmesi için yakınlık bağlantı deneyini. Bu yöntem, hücresel proteostaz ve protein etkileşimlerini anlamada araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NBN Victoria Devlet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti finansmanı ile Monash Üniversitesi Tıp Hemşireliği ve Sağlık Bilimleri Fakültesi özel bir İşe Hibe tarafından desteklenir. Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) ve Harm H. Kampinga'ya (Hücre ve Sistemler Biyomedikal Bilimler Bölümü, Groningen Üniversitesi, Hollanda) değerli destekleri ve reaktiflerin paylaşımı için teşekkür ederiz, Holger Lorenz (ZMBH) Görüntüleme Tesisi, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) konfokal mikroskopi ve görüntü işleme ile destek için, ve Claire Hirst (ARMI, Monash Üniversitesi, Avustralya) el yazması eleştirel okuma için.

1. Hela Hücre Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, %10 FCS ve %1 Pen-Strep ile desteklenmiştir; PBS'de %4 paraformaldehit; PBS'de %0.5 Triton-X100; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, %0.05 Tween), pH 7.4; %0.0001 steril poli-L-L-Lizin çözeltisi; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda; kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları. NOT: Optimum fiksasyon verimliliğini sağlamak için paraformaldehit çözümleri her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Islä±k dokularla kapalÄ± bir kutunun altÄ±nÄ± kaplayarak nemli bir hazne hazirlayÄ±n. Enzimatik reaksiyonları kuluçkaya yatırırken oda sıcaklığının 37 °C'de olduğundan emin olmak için, deneye başlamadan önce nemli hazneyi 37 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>T25 şişelerinde Kültür HeLa hücreleri, 5 mL DMEM (Yüksek Glikoz, Glutamat ve Sodyum Piruvat takviyeli) %10 FCS ve %1 Pen-Strep ile desteklenir, %5 CO2içeren 37 °C CO2 kuluçka makinesinde . % 0.05 Trypsin-EDTA kullanarak yapışık hücreleri ayrıştırın. Ayrıştırılmış hücrelere taze DMEM ilave edildikten sonra, hücre sayma odası nı kullanarak hücreleri sayın ve nemli bir odanın içindeki tanısal slaytlarda büyür.</li>
	<li>30 dakika boyunca steril bir hücre kültürü başlık UV-ışınlama ile tanı slaytlar sterilize.</li>
	<li>Deney için gerekli olan her kuyuya %0,0001 poli-L-l-lizin filtrelenmiş 100 μL steril ekleyin. 30 dk. Fazla poli-L-lizini her kuyu3x 50 μL ultrasaf su ile yıkayarak yıkayın.</li>
	<li>HeLa hücrelerini deneyin ve her kuyuya yaklaşık 15.000 hücre ekleyin. Gerekirse hücreleri kuyu başına en az 30-50 μL DMEM'e seyreltin.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C 5% CO2 kuluçka makinesi içinde nemli bir odada büyümek yaklaşık 24 saat. Hücreler PLA başlamadan önce% 60-80 konfluent olmalıdır. NOT: Çok yüksek bir birleşimi reaktiflerin emilimini azaltarak protokol sonunda elde edilen sinyali azaltır.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıt koyarak orta çıkarın. Kuyuları 50 μL PBS ile 3x yıkayın. NOT: Hücreler sıvılar sert bir şekilde eklendiğinde ayrıştırılabilir. Bu, yeni sıvı eklemeden önce kuyuların tamamen kurumasına izin vermemek ve yeni sıvıyı kuyunun kenarına hafifçe ekleyerek önlenebilir.</li>
	<li>Her kuyuya PBS'de 50 μL taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri düzeltin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.</li>
	<li>Slaytları PBS'de 3 x yıkayın. 100 mL PBS içeren Coplin slayt boyama kavanozunda yıkıntıları gerçekleştirin. Her yıkama için, sallayarak olmadan oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.</li>
	<li>Bir Coplin slayt boyama kavanozunda PBS'de %0,5 Triton-X100'ün 100 mL'lik kısmını batırarak hücre zarını permeabilize edin. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.</li>
	<li>TBS-T'de slaytları 3kat yıkayın. 100 mL TBS-T içeren Coplin slayt boyama kavanozunda yıkıntıları gerçekleştirin. Her yıkama için, sallayarak olmadan oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, bir kağıt mendil ile fazla tampon kaldırın. Bu noktada hücreler bölüm 4'te tartışılacak Yakınlık Ligasyon Test protokolü için hazırdır.</li>
</ol>2. S. cerevisiae Hücre Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: 100 mM KPO4, pH 6.5, Yıkama Tamponolarak anılacaktır; %37 formaldehit; 100 mM KPO 4%4paraformaldehit , pH 6.5; 100 mM KPO 4, pH6.5'te 1.2 M sorbitol; lyticase çözeltisi (500 μg/mL lyticase, 20 mM β-mercaptoetanol, 100 mM KPO4, pH 6.5); %0.0001 poli-L-L-Lizin çözeltisi; 100 mM KPO4%Triton-X100% 1, pH 6.5; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda (adım 1.2'deki gibi hazırlanır); kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları. NOT: Optimum fiksasyon verimliliğini sağlamak için paraformaldehit çözümleri her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Sallayarak 30 °C'de seçici olmayan Maya Özü, Peptone ve Dekstroz (YPD) ortamlarında bir gecede kültür yetiştirin. NOT: Deneysel gereksinimlere bağlı olarak S. cerevisiae hücreleri Sentetik Komple (SC) orta veya seçici Sentetik Minimal (SM) orta yerine yetiştirilebilir.</li>
	<li>Sabit kültürü 20 mL ortadaki 0,1'lik OD600'e seyreltin. OD600 0,5 ulaşınceye kadar sallayarak 30 °C'de hücreleri büyütün.</li>
	<li>20 mL kültürünü 50 mL'lik santrifüj tüpe aktarın. 3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. 5 mL taze ortamda hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Kültüre %37 formaldehit in 550 μL'lik kısmını ekleyerek hücreleri düzeltin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka.</li>
	<li>3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. Wash Tampon'da taze hazırlanmış %4 paraformaldehitin 1 mL'lik kısmını yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka.</li>
	<li>Kuluçka sırasında, her kuyuya %0,01 poli-L-lizin çözeltisi ekleyerek tanı slaytlarını hazırlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytlar kuluçka.</li>
	<li>30 dk sonra fazla poli-L-lizini ultra saf suyla yıkayın ve kaydıraklar kurumasını bekleyin. Kuru slaytlar kullanıma hazırdır.</li>
	<li>1 mL Yıkama Tamponu ile hücreleri iki kez yıkayın. 3 dk. için 665 x g'deki hücrelerin santrifüjünde yıkıntıları gerçekleştirin.</li>
	<li>3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. Yıkama Tamponu'nda 1 mL 1,2 M sorbitol'deki hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. Hücre duvarını sindirmek için 250 μL taze hazırlanmış Lyticase çözeltisi içinde pelet resuspend. Sallayarak 30 °C'de 15 dakika lyticase çözeltisindeki hücreleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Sindirimden sonra hücreleri 3 dk için 665 x g santrifüj ile 3x yıkayın ve supernatant çıkarın. Wash Tampon'da 1,2 M sorbitol'ün 250 μL'lik hücrelerini yeniden askıya alın. NOT: Hücreler hücre duvarı sindiriminden sonra kırılgan olduğundan, hücrelere zarar vermemek için onları çok dikkatli bir şekilde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Poli-L-l-lizin kaplı slaytlara 20 μL'lik resuspended hücreleri ekleyin. 30 dk. Kuyuları 50 μL Yıkama Tamponu ile 3x yıkayarak yapışmayan hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Yıkama Tamponunda %1 Triton-X'in %50'si Triton-X ile 3x yıkayarak hücre zarını permeabilize edin. NOT: Bu noktada hücreler bölüm 4'te tartışılacak yakınlık ligasyon test protokolü için hazırdır.</li>
</ol>3. E. coli Hücre Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, %0.05 Tween-20), pH 7.4; lysozyme solüsyonu (2 mg/mL lysozyme, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM Glikoz, 10 mM EDTA); %0.0001 poli-L-L-Lizin çözeltisi; %99 buz gibi metanol; %99 oda sıcaklığında metanol; %99 aseton; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda (adım 1.1.1 olarak hazırlanır); kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları.</li>
	<li>Sallayarak 30 °C'de Luria-Bertani (LB) orta bir gecede kültür büyümek.</li>
	<li>Taze LB orta 0,02 bir OD600 sabit kültür seyreltin. OD600 günlük faz hücreleri için 0.4 ulaşana kadar sallayarak 30 °C'de hücreleri büyütün.</li>
	<li>Hücreler 0,4'ün OD600'üne ulaşmadan yaklaşık 15 dakika önce, her kuyuya %0,0001 poli-L-l-l-lizin ekleyerek poli-L-lizin kaplı slaytlar hazırlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytlar kuluçka.</li>
	<li>30 dk sonra aşırı poli-L-lizin ultrasaf su ile yıkayın ve slaytlar hava kuru izin. Kuru slaytlar kullanıma hazırdır.</li>
	<li>Hücreler 0,4'ün OD600'üne ulaştığında, kültürün 1 mL'sini steril mikrosantrifüj tüpüne ve 2 dk için 2.650 x g'lık pelet hücrelerine aktarın.</li>
	<li>LB orta 50 μL hücreleri resuspend.</li>
	<li>1 mL buz gibi %99 metanol ekleyerek hücreleri düzeltin. Elle çok nazikçe karıştırın. -20 °C'de 30 dk kuluçka yada hücreler.</li>
	<li>Fiksasyondan sonra poli-L-lizin kaplı slaytlara hücrelerin 20 μL'sini ekleyin. Slaytlar 30 dakika kuru masını bekleyin.</li>
	<li>Hücre duvarını sindirmek için her kuyuya 50 μL taze hazırlanmış lysozyme çözeltisi ekleyin. 25 °C'de 30 dk nemli bir odada kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıt ekleyerek kuyulardan lysozyme çözeltisini çıkarın. PBS-T'nin 100 mL'sinde 3x kaydırakyı yıkayın. Her yıkamayı 30 s boyunca coplin slayt boyama kavanozunda, titremeden gerçekleştirin.</li>
	<li>Slaytlara bir kağıt mendil indeksi dokunarak slaytlardan yıkama arabelleği kaldırın.</li>
	<li>Her kuyuya %99 metanol 50°L ekleyerek hücre zarlarını permeabilize edin. Oda sıcaklığında 1 dakika kuluçka.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek metanol çıkarın.</li>
	<li>Her kuyuya %99 aseton 50 μL ekleyin. 1 dk kuluçka.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek aşırı asetonu çıkarın. Slaytların kurumasını bekleyin. Bu noktada hücreler bölüm 4'te tartışılacak yakınlık ligasyon test protokolü için hazırdır.</li>
</ol>4. Yakınlık Ligasyon Tonu
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: Engelleme Tamponu; Antikor Seyreltme Tampon; Yıkama Tampon 'A' - (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Yıkama Tamponu 'B' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anti-Tavşan Sekonder Antikor PLUS; Anti-Fare Sekonder Antikor EKSI; 5x Ligasyon Tampon; ligase; 5x Amplifikasyon Tampon (Turuncu: λex 554 nm; λem 576 nm); polimeraz; ultra saf su; ve DAPI içeren montaj ortamı. NOT: PLA algılama reaktifleri Yeşil (λex 495 nm; λem 527 nm), Kırmızı (λex 594 nm; λem 624 nm), FarRed (λex 644 nm; λem 669 nm) veya Brightfield (horseradish peroxidaz (HRP) türevlerinde de mevcuttur. konjuge).</li>
	<li>Her kuyuya engelleme Arabelleği bir damla ekleyerek hücreleri engelleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 30 dk kuluçka.</li>
	<li>Antikor Seyreltme Tampon stok antikorları seyrelterek antikor çözeltileri hazırlamak. Her kuyu için 40 μL antikor çözeltisi gereklidir.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıdı yerleştirerek engelleme tamponu kaldırın. Her kuyuya Antikor Seyreltme Tamponu'nda seyreltilmiş 40 μL antikor ekleyin. 37 °C'de nemli bir odada 60 dakika veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek kuyulardan antikor solüsyonu çıkarın. Slaytları 100 mL'lik Yıkama Tamponu 'A'yı Coplin slayt boyama kavanozunda 5 dakika boyunca, titremeden yıkayın.</li>
	<li>Yıkama adımları sırasında, seyreltmek 5x ikincil antikor probları, anti-tavşan PLUS & anti-fare MINUS (probların türlerinin özgüllüğü kullanılan birincil antikorlara bağlıdır), Antikor Seyreltme Tampon. Kuyu başına 40 μL antikor çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Her kuyuya 40 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 60 dk kuluçka.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıdı yerleştirerek kuyulardan ikincil antikor solüsyonu çıkarın. Slaytları 100 mL'lik Yıkama Tamponu 'A'yı Coplin slayt boyama kavanozunda 5 dakika boyunca, titremeden yıkayın.</li>
	<li>Yıkarlar sırasında kuyu başına 40°L ligasyon karışımı hazırlayın, 8 μL 5x Ligation Tampon, 31°L ultrasaf su ve 1 μL ligase karıştırılarak.</li>
	<li>Her kuyuya 40 μL ligasyon karışımı ekleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 30 dk kuluçka.</li>
	<li>Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek kuyulardan ligasyon karışımı çıkarın. Kaydırma 2x yıkayın 100 mL Yıkama Tampon 'A' bir Coplin slayt boyama kavanozunda 2 dakika, sallayarak olmadan.</li>
	<li>Yıkarlar sırasında kuyu başına 40 μL amplifikasyon karışımı hazırlayın, 8 μL 5x amplifikasyon çözeltisi, 31,5 μL ultrasaf su ve 0,5 μL polimeraz karıştırılarak. NOT: 5x amplifikasyon floresan problar içerir. Bu karışımı ışıktan koruyun. Ayrıca, aşağıdaki adımların her biri sırasında slaytları ışıktan koruyun. Yarı saydam Coplin slayt boyama kavanozları ve nemli odaları kullanıyorsanız, alüminyum folyo sarın.</li>
	<li>Kuyu başına 40 μL amplifikasyon karışımı ekleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 100 dk kuluçka.</li>
	<li>Kuyulardan amplifikasyon karışımını çıkarın. Kaydırma 2x 100 mL Yıkama Tampon 'B' bir Coplin slayt boyama kavanozunda 10 dakika sallayarak olmadan.</li>
	<li>100 mL'lik Yıkama Tamponu 'B' 1:100'ü Coplin slayt boyama kavanozundaki ultra saf suda 30 s'lik bir suda yıkayın.</li>
	<li>Slaytlara kuyu başına montaj ortamı içeren 20 μL DAPI ekleyin. Bir coverslip ile slaytlar kapatın ve oje ile mühür slaytlar.</li>
	<li>Görüntüleme durumunda, ışıktan korunurken, 10-15 dk montaj ortamı içeren DAPI'yi hemen kuluçkaya yatırın. Değilse, slaytları ışıktan korunan -20 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>5. Algılama
<ol><li>Sırasıyla 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA ve 100x/1.4 NA Plan Apochromat hedefleri ile HeLa, S. cerevisiae ve E. coli hücrelerinin görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanın. 405 nm darbeli diyot lazer ile DNA lekeli DAPI heyecanlandırmak. PLA sinyali için (bu çalışma için) 561 nm katı hal lazer ile heyecan.</li>
</ol>

<ol><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li>
<li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSP70+chaperone+machinery%3A+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li>
<li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases%3A+emergence+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li>
<li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li>
<li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li>
<li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li>
<li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li>
<li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CbpA%2C+a+DnaJ+homolog%2C+is+a+DnaK+co-chaperone%2C+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li>
<li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li>
<li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li>
<li>Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+proximity+ligation+assay+%28PLA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li>
<li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li>
<li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li>
<li>Nagy, P., Szöllosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+or+no+proximity%3A+that+is+the+question+%E2%80%93+but+the+answer+is+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li>
<li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li>
<li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li>
<li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li>
<li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li>
<li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li>
<li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679(2015).</li>
<li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+lysis+of+microbial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li>
<li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension%3A+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ko-immünoprepitasyon ve ko-lokalizasyon aparatlarına dayalı yaklaşımlar, protein birliğini karakterize etmek için uzun süreli yöntemler olarak kullanılmıştır. Geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerinin saptanması bu tür geleneksel yöntemlerle büyük bir sorundur ve sonuç olarak, önceki bulgular büyük ölçüde nitel yorumlamalarla sınırlıdır. Hücre lisis tabanlı koimmünopremteknikleri genellikle protein-protein etkileşimlerini stabilize etmek için çapraz bağlantı gerektirir. Hücre lisisgeçici olarak oluşturulan ...

Hücresel etkileşimleri tam olarak anlamamız nedeniyle büyük miktarda genomik bilgi yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kimyasal çapraz bağlantı ve protein ko-lokalizasyonu olmayan protein ko-immünopresidipitasyonu gibi geleneksel protein-protein etkileşim isaptama metodolojileri bir dizi dezavantaj teşkil eder. Bazı ana dezavantajları etkileşimleri kötü nicelleştirme ve olmayan yerli bağlayıcı olayların potansiyel giriş içerir. Buna karşılık, gelişmekte olan yakınlık tabanlı teknikler hücrelerde protein etkileşimleri yakalamak için bir alternatif ve güçlü bir yaklaşım sağlar. Yakınlık ligasyon test (PLA)1, şimdi özel bir kit olarak kullanılabilir, özellikle etkileşimalt birimlerinin yakınlığına dayalı protein kompleksleri hedef antikorlar kullanır.
PLA, hedeflenen protein kompleksinin yüzeyinde küçük DNA etiketleri (PLA probları) bulunan primer ve sekonder antikorlardan oluşan bir iskele nin oluşumu ile başlatılır (Şekil1, adım 1-3). Daha sonra, DNA etiketlerinin yakınlığı ile belirlenen dairesel bir DNA molekülü konektör oligonükleotidlerle melezleme yoluyla oluşturulur (Şekil1, adım 4). Dairesel DNA'nın oluşumu bir DNA ligasyon adımı ile tamamlanır. DNA'nın yeni oluşan dairesel parçası sonraki haddeleme daire amplifikasyon için bir şablon olarak hizmet vermektedir (RCA)tabanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) konjuge oligonükleotid etiketleri biri tarafından astarlanmış. Bu, antikor iskelesi aracılığıyla protein kompleksine bağlı tek iplikli konkatemerik bir DNA molekülü oluşturur (Şekil1, adım 6). Concatemeric DNA molekülü, yükseltilmiş DNA'ya dağılmış birden fazla benzersiz diziyle melezleşen floresan etiketli oligonükleotidler kullanılarak görselleştirilmiştir (Şekil1, adım 7)2. Floresan nokta (Şekil1, adım 7) olarak görünen üretilen PLA sinyali, hedeflenen protein kompleksinin hücredeki konumuna karşılık gelir. Sonuç olarak, titretisi protein komplekslerini yüksek mekansal doğrulukla tespit edebilir. Teknik sadece protein etkileşimleri yakalama ile sınırlı değildir, ama aynı zamanda yüksek duyarlılık1,2ile proteinler üzerinde tek moleküller veya protein değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir .
Hsp70, bir dizi temizlik ve stresle ilişkili fonksiyonlara katılarak hücresel protein homeostazını korumak için temelde çok yönlü bir şaperon sistemi oluşturur. Hsp70 şaperon sisteminin temizlik faaliyetleri arasında de novo protein katlama, hücre zarları arasında protein translokasyonu, protein komplekslerinin biraraya toplanması ve disassemblyasyonu, protein aktivitesinin düzenlenmesi ve farklı protein katlamalarının bağlanması/ kalite kontrol makineleri3. Aynı şaperon sistemi aynı zamanda yanlış katlanmış/açılmamış proteinleri yeniden katar, protein agregasyonunu önler, protein ayrıştırmasını teşvik eder ve hücresel proteazlarla işbirliği ederek hücresel onarımı kolaylaştırmak için ölümcül olarak yanlış katlanmış/hasarlı proteinleri bozar. proteotoksik gerilmeler4,5. Bu işlevsel çeşitliliği elde etmek için, Hsp70 şaperon JDP ailesinin eş-şaperonları ve substrat bağlama veserbest3 Hsp70's ATP bağımlı allosteric kontrolü ince ayar nükleotid değişim faktörleri (NEFs) ortaklık dayanır 6 . Ayrıca, JDP eş-şaperonlar bu çok yönlü şaperon sistemi için substrat seçiminde hayati bir rol oynamaktadır. Bu ailenin üyeleri prototip JDP, E. coli DnaJ kendi yapısal homoloji dayalı üç sınıf (A, B ve C) ayrılır. A sınıfı JDO'lar, Hsp70 ile etkileşime giren Bir N-terminal J-etki alanı, glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölge, Çinko parmak benzeri bir bölge (ZFLR) ve iki β-varil etki alanından oluşan bir substrat bağlama bölgesi ve bir C-terminal dimerizasyon etki alanı içerir. N-terminal J-etki alanı ve glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölgeye sahip, ancak ZFLR'den yoksun JD'ler B sınıfına girerler. Genel olarak, bu iki sınıfın üyeleri refakat işlevlerinde yer almaktadır. Sadece J-etki alanı4paylaşmak JDPs içeren catchall sınıf C, altında düşen Üyeler, olmayan refakatsiz işlevleri çeşitli gerçekleştirmek için Hsp70s işe. JDP'lerin Hsp70 sisteminin değiştirilebilir substrat tanıma "adaptörleri" olarak önemli rolü, evrim sırasında aile üyelerinin genişlemesi ile yansıtılır. Örneğin, insanlar üzerinde 42 farklı JDP üyeleri4. Bu JDP'ler monomer, homodimer ve/veya homo/hetero oligomer4,5olarak işlev görür. Son zamanlarda, A sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) ve B sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) ökaryotik JDPs in vitro agregaların verimli tanınmasını teşvik bildirilmiştir7,8. Bu karma sınıf JDP kompleksleri muhtemelen Hsp70 oluşumunu kolaylaştırmak için toplanan proteinlerin yüzeyinde biraraya- ve Hsp70 + Hsp100 tabanlı protein disaggregases7,8,9, 10. Ökaryotik hücrelerde geçici olarak oluşturulmuş bu karma sınıf JDP komplekslerinin varlığını destekleyen kritik kanıtlar PLA8ile sağlanmıştır.
PLA giderek metazoa protein etkileşimlerini değerlendirmek için istihdam edilmektedir, öncelikle memeli hücrelerinde. Burada, tomurcuklanan maya S. cerevisiae ve bakteri E. coli gibi ökaryotik ve prokaryotik tek hücreli organizmalarda geçici olarak oluşan şaperon komplekslerini izlemek için bu tekniğin başarılı bir şekilde genişlemesini rapor ediyoruz. Daha da önemlisi, bu genişleme pla'nın insan ve hayvan hücrelerini enfekte eden mikropların saptanması nda ve analizinde potansiyel kullanımını vurgulamaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 37 Formaldehit</td><td>Merck</td><td>103999</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNAJA2 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab157216</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNAJB1 antikoru</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ADI-SPA-450</td><td></td></tr><tr><td>anti-DnaK antikoru</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td></td></tr><tr><td>anti-Sis1 Antikoru</td><td>Cosmo Bio Corp</td><td>COP-080051</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ydj1 antikoru</td><td>StressMarq Biosciences</td><td>&nbsp; SMC-150,</td><td></td></tr> <tr><td>anti-YFP antikoru</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin slayt boyama kavanozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5516</td><td></td></tr><tr><td>Teşhis slaytları</td><td>Marienfeld</td><td>1216530</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fischer</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink Yerinde Tespit Reaktifleri Orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92007</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In Yerinde Montaj Ortamı + DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink Yerinde PLA Probu Anti-Fare MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink Yerinde PLA Probu Anti-Tavşan PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink Yerinde Yıkama Tamponları, Floresan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Thermo-Fischer</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Termo-Fischer</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P47-07</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Merck</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Termo-Fischer</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Zimolaz 100T / / Lyticase</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik</td><td>Z1004</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteri, maya ve İnsan hücrelerinde geçici olarak oluşan moleküler Şaperon meclislerinin yerinde İzlenmesinde

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-etki proteinleri (JDP' ler) ökaryotik hücrelerdeki en büyük ve en çeşitli eş-şaperon ailesini oluşturur. Son bulgular, JDP ailesinin belirli üyelerinin ökaryotlarda 70 kDa ısı şok proteini (Hsp70) şaperon bazlı protein disaggregazları için substrat seçiminde ince ayar yapmak için geçici heterokompleksler oluşturabileceğini göstermektedir. JDP kompleksleri akut/kronik strese bağlı toplu proteinleri hedef alır ve muhtemelen protein agregalarının yüzeyine birden fazla Hsp70'i işe alarak disagregaların biraraya getirilmesine yardımcı olur. Bu fiziksel olarak etkileşen JDP'ler tarafından oluşturulan protein kalite kontrol (PQC) ağının kapsamı in vivo olarak büyük ölçüde tanımlanmamış tır. Burada, ökaryotik hücrelerin farklı hücresel bölmelerinde bu geçici olarak oluşturulmuş şaperon komplekslerini sağlam bir şekilde yakalayabilen yakınlık ligasyon analizi (PLA) adlı yerinde protein etkileşimi testinde mikroskopi tabanlı bir tanım atıyoruz. Çalışmalarımız pla istihdamını insan hücrelerinden mayaya(Saccharomyces cerevisiae)ve bakterilere(Escherichia coli)genişletir ve böylece her ikisinde de geçici olarak oluşan protein derlemelerinin dinamiklerini izlemek için önemli bir araç oluşturur. prokaryotik ve ökaryotik hücreler.

Saflaştırılmış proteinler iã§in daha Ã¶nceki in vitro Ã§alÄ±Å malarÄ±mÄ±z, insan sÄ±nÄ±fÄ± A ve B sÄ±nÄ±f JDP' lerinin bir alt kümesinin, agregaedilen proteinlerin geniÅ bir seÃ§eneÄ ini verimli bir Å efi hedeflemek ve muhtemelen Hsp70 bazlÄ± birleÅ tirmeyi kolaylaÅ tÄ±rmak iÃ§in geçici karma sÄ±nÄ±f JDP kompleksleri oluşturduÄ protein disaggregases7. Karışık sınıf (A+B) JDP komplekslerinin insan servikal kanser hücrelerinde (HeLa) oluşup oluşmadığını belirlemek için PLA'yı çalıştırdık. İnsan JDPs...

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Bu yöntem bakteri ve maya gibi organizmalarda ve farklı hücre tiplerinde geçici protein etkileşimlerini yakalar. Burada hücresel proteostazda yer alan geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerini izliyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde protein derlemelerinin dinamiği ve hücre altı lokalizasyonu hakkında bilgi üretebilme yeteneğidir.Bakteri ve maya gibi tek hücreli organizmalarda bu tekniğin adaptasyonları, araştırmacılar mikrobiyal enfeksiyonlar ile ilgili hastalıkları araştırmak için güçlü bir araç olarak kullanmak için izin verir. Bu teknik, protokolün numune hazırlama aşamasındaki koşulları değiştirerek hemen hemen tüm organizmalardaki protein etkileşimlerini analiz etmek için potansiyel olarak kullanılabilir. İmmünhistokimya, immünfloresans, ELISA veya immünoprediyağışlarda spesifik ve test edilmiş kaliteli antikorların seçilmesi önemlidir.Poli-L-Lizin ile 10 kuyulu tanısal slaytları önceden tedavi ederek başlayın. Her kuyuya 100 mikrolitre steril ve filtrelenmiş %0.0001 poli-L-L-L-Lizin ekleyin ve slaytları steril laminar akış kaputunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, fazla poli-L-L-Lizin kaldırmak için steril su 50 mikro

in-situ-monitoring-transiently-formed-molecular-chaperone-assemblies

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

Kaynak: Dahl, J. ve ark. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, asit ve ısı stresi altında bir substrat proteininde çaperon aktivitesini değerlendirmek için floresans spektrofotometre tabanlı bir testi göstermektedir. Işık saçılması yoluyla substratın açılması ve toplanmasının izlenmesi adımlarını, eşlikçi ile ve olmadan koşulları karşılaştırarak açıklar.

Bir Model Proteinin Termal Açılması Yoluyla Bakteriyel Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan tükenme-kurtarma deneyleri için bir yöntem tanımlıyoruz. Adenofeksiyon, tek hücre düzeyinde mitotik hücre bölünmesi ve miyogenez gibi ince ayarlanmış aktin bazlı dinamiklere dayanan biyolojik süreçler içindeki proteinlerin fonksiyonel analizlerini sağlar.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Keşfedin, bakteri, maya ve insan hücrelerinde geçici şaperon komplekslerinin yerinde izlenmesi için yakınlık bağlantı deneyini. Bu yöntem, hücresel proteostaz ve protein etkileşimlerini anlamada araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Daha fazla video keşfet