Name: Hücre ve Dokularda Koenzim Anın Sayısallaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin hücre ve dokularda koenzim A nicelendirmesi için güvenilir bir yöntem. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanarak metabolizma ve nörodejenerasyon araştırmalarında CoA düzeylerini ölçün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar CoA Therapeutics, Inc, BridgeBio LLC, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe GM34496 ve Amerikan Lübnan Suriye Associated Charities bir yan kuruluşu tarafından sağlanan sponsorlu araştırma için finansman kabul.

Bu protokolde belirtilen hayvan prosedürü 323 ve 556 sayılı protokollere göre gerçekleştirilmiştir ve Özellikle St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümlerin hazırlanması
NOT: Tüm çözeltiler için ve prosedürlerde belirtildiği zaman ultra saf su kullanın.
<ol><li>Suda 1 mM potasyum hidroksit (KOH) hazırlayın.</li>
	<li>Suda 0,25 M KOH hazırlayın.</li>
	<li>Suda 1 M Trizma-HCl hazırlayın ve pH 8.0'a ayarlayın.</li>
	<li>Asetonitril (Optima Grade) içinde 100 mM monobromobimane (mBBr) hazırlayın. mBBr'nin stok çözümleri -20 °C'de aylarca sabittir, ışığa maruz kalmanın monobromobimane'yi bimane26'yafotolik olarak sunması koşuluyla aylarca.</li>
	<li>Katı faz ekstraksiyonu (SPE) kolonu için Yıkama Tamponu hazırlayın: %50 metanol (Optima Grade) + %2 asetik asit.</li>
	<li>SPE sütun için Elüsyon Tamponhazırlayın: 50 mM amonyum formatı içeren% 95 etanol (HPLC Grade).</li>
</ol>2. CoA-bimane standardının hazırlanması
<ol><li>Saygın bir kaynaktan (örneğin, Avanti Polar Lipidler, Inc.) yüksek kaliteli bir CoA standardı satın alın.</li>
	<li>20 mM Tris, pH 8'de CoA'nın yüksek konsantrasyonda stok çözeltisi hazırlayın. Yüksek konsantrasyondaki CoA miktarı λ260 nm'de spektrofotometrik absorbans ile belirlenir veya doğrulanır (16.800 M-10cm-1). mBBr 4 kat molar fazla ekleyin; 10 s için yüksek girdap. Örneğin, arabellekteki 10 mM CoA için 40 mM mBBr ekleyin. MBBr, tüm CoA'nın türevleştirilmiş olmasını sağlamak için fazla eklenir.</li>
	<li>MBBr ile CoA türevleştirmek için sallayarak olmadan karanlıkta 4 saat oda sıcaklığında kuluçka. mBBr CoA thiol grubu ile reaksiyona girer ve pH ve ısıya bağlı27. mBBr eklenmesi bir suda çözünen floresan CoA dönüştürür (veya ultraviyole emici) CoA-bimane (CoA-bimane; Şekil 2).</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için 100°L asetik asit ve girdap ekleyin.</li>
	<li>Herhangi bir çökelti kaldırmak için 15 dakika boyunca 2.000 x g santrifüj.</li>
	<li>Tepkimeye alamayan mBBr'yi kaldırmak için bir SPE sütunu kullanarak supernatant'ı temizleyin (aşağıda açıklanmıştır). SPE kolon temizliğinden sonra eluate filtrasyon ve santrifüj gerekli değildir (Bölüm 5.8).</li>
	<li>Önceden tartılmış bir tüpte CoA-bimaniçeren SPE sütunundan eluate toplayın, azot gazı altında kurulayın, bilinen miktarlarda CoA-bimane ile standart bir kalibrasyon eğrisi tartılayın ve inşa edin.<ol>
<li>Hem λ260 (adennine moiety) hem de λ393 (bimane moiety) ve kromatogramda her iki tepede de emici lik tespiti ile HPLC ile saflık için CoA-bimane standardını kontrol edin (aşağıya bakın).</li>
		<li>Yüksek konsantrasyonlu stoktaki CoA-biman standardının miktarını λ260 nm (16.800 M-100cm-1)kullanarak doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CoA-bimane standardını kullanarak deneysel numunelerde CoA-bimane'nin tanımlanması için HPLC saklama süresini kaydedin.</li>
	<li>CoA-bimane standardının yüksek konsantrasyonlu stokunun aliquot'larını ışıktan koruyun ve -20 °C'de 2 yıla kadar saklayın. Tekrar tekrar çözülme ve yeniden donma kaçının.</li>
</ol>3. Kültürlü hücrelerde CoA'nın çıkarılması ve türevi
<ol><li>Geç subconfluent yoğunlukları yaklaşırken kültürde toplama yapışık hücreleri. Örneğin, insan HepG2/C3A hücreleri 6-8 x 106yoğunluğuna kadar yetiştirilir veya HEK 293T hücreleri 100 mm çanak başına ~1,3 x 107 yoğunluğuna yetiştirilir.<ol>
<li>CoA belirlemeleri için düzenli olarak yinelenen veya üç kat kültürleri kullanın. Canlı hücre sayısını belirlemek için örnek hücre kültürlerine paralel olarak ayrı kültür yemeklerini kuluçkaya yatırın. HPLC saflaştırma sonra 106-107 hücreleri başına CoA miktarını hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çanak kapalı aspire kültür ortamı. Herhangi bir artık orta kaldırmak ve çanak kapalı PBS aspire buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile çanak hücreleri hızlı bir şekilde yıkayın. Kalıntı PBS'yi temizlemek ve bulaşıktaki suyu hızlı bir şekilde aspire etmek için hücreleri buz gibi suyla hızlı bir şekilde yıkayın. PBS veya su eklerken yapışık hücreleri rahatsız etmekten kaçının.</li>
	<li>Kültür yemeğine 1 mL buz gibi su ekleyin. Hücreleri çanaktaki soğuk suya kazıyın ve hücre süspansiyonuna 400 μL 0,25 M KOH ve 1,5 mL su içeren bir cam test tüpüne aktarın.<ol>
<li>Süspansiyonu 10 s'lik yüksek bir girdap ile şiddetle karıştırın. Daha sonra parafin filmi ile sıkıca kaplayın ve 55 °C'de su banyosunda titremeden 1 saat kuluçkaya yatırın. Numunenin pH'ı ≥ 12 olmalıdır. Yüksek pH CoA tiyoesterleri hidrolize etmek için önemlidir ve gerekirse KOH ek aliquots ile ayarlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Düşük hızda santrifüj ile süspansiyon da büyüyen kültürlü hücreleri hasat: 4 °C'de 6 dakika için 136 x g. Buz gibi PBS ile bir kez yıkayın, sonra soğuk su ile tekrar yıkayın ve son olarak 2,5 mL soğuk su artı 400 μL 0,25 M KOH'da tekrar yıkayın. Yukarıda açıklandığı gibi 55 °C'de şiddetle karıştırın ve kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>160 μL 1 M Trizma-HCl ve 10 00 mM mBBr 10 000 mBBr ekleyin ve 10 s yüksek girdap ile karıştırın. Bu da pH'ı serbest CoA ile mBBr reaksiyonu için yaklaşık 8'e çıkarır. MBBr'nin CoA'nın tiolile reaksiyona girip tepki göstermesi için karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında kapak ve kuluçka numuneleri.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için 100°L asetik asit ekleyin ve 10 s yüksekgirtile karıştırın</li>
	<li>Çökelmiş hücre enkazkaldırmak için 15 dakika için 2.000 x g santrifüj.</li>
	<li>Aşağıda açıklanan SPE sütun temizliği için cam test tüpündeki supernatant'ı çıkarın ve kaydedin.</li>
</ol>4. Dokularda CoA çıkarılması ve türevi
<ol><li>Hayvan dokusu parçalarını, yaklaşık 0,5 cm veya daha küçük parçalar, ve leke kısa bir süre (1-2 s) emici kağıt üzerinde ve sonra sıvı azot içinde flaş dondurma ve işleme kadar -80 °C'de saklayın. Dokularda CoA hidrolize veya dondurulmuş flaş değilse bir tiyoester dönüştürülür. Bu adım dokularda CoA maksimum verim elde etmek için önemlidir.</li>
	<li>Analize başlamadan önce dondurulmuş doku parçalarını (5 – 60 mg) hızlı bir şekilde tartın ve her numuneiçin ağırlığı kaydedin. Bu ıslak ağırlık tayini, HPLC saflaştırmasını takiben CoA içeriğinin hesaplanmasında kullanılır. Doku parçalarının tamamen çözülmesinden kaçının.</li>
	<li>Bir rotor-stator homogenizer ile bir prob ve doku bozulması takılması için mukadder bir cam test tüpü (örneğin, 13 mm x 100 mm tek kullanımlık) 2 mL 1 mM KOH ekleyin. Tüpü kullanıma kadar buzda tutun. Bu, numunelerin soğuk sıcaklıkta homojenleştirilmesini ve homojenizasyon sırasında oluşan ısı nedeniyle CoA'nın yok olmamasını sağlamak için yapılır.</li>
	<li>30 s. 30 s. Doku ların tamamen erimesini önlemek için cam test tüpünde (soğuk 1 mM KOH içeren) doku transferi ve homojenize.</li>
	<li>0,25 M KOH 500 μL ekleyin; 10 s için yüksek girdap ve tüm örnekler homojenize olana kadar buz üzerinde tutun. Bu toplam CoA (serbest CoA + hidrolize CoA tia thioesters) verim CoA tiyoesters hidrolize 12 yukarıdaki numunenin pH getirecektir.</li>
	<li>Hidrolizi desteklemek için sallayarak bir su banyosunda 2 saat için 55 °C'de kuluçka numuneleri.</li>
	<li>150 μL 1 M Trizma-HCl ve 10 00 mM mBBr ekleyin; 10 saniye boyunca yüksek girdap. Bu da pH'ı ücretsiz CoA ile mBBr reaksiyonuna destek olarak yaklaşık 8'e çıkarır.</li>
	<li>Tüm CoA'nın mBBr ile türetilmesini sağlamak için karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında kuluçka numuneleri.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için 100°L asetik asit ve girdap ekleyin.</li>
	<li>15 dk için 2.000 x g santrifüj çökelmiş hücre enkaz pelet.</li>
	<li>SPE sütun temizliği için cam test tüpündeki supernatant'ı çıkarın ve kaydedin (aşağıda açıklanmıştır).</li>
</ol>5. Katı faz ekstraksiyonu (SPE) sütunu ile numune temizleme
<ol><li>Oda sıcaklığında, piriyl fonksiyonel grubun protonated olduğundan ve bir aniyon değiştirici olarak işlev görmek için 1 mL Yıkama Tamponu ile her tek kullanımlık 2-(2-piriridyl)-etil silika jel kolon (1 mL boyutu) dengeleyin. 2-(2-piril)-etil silika jel temel pH CoA-bimaniçin ideal zayıf bir aniyon değiştirici. 2-(2-piriridil)-etil silika jel pKa 6 ve elüsyon pH ≥ 7 yapılır.</li>
	<li>Sütun ve eluate toplamak için örnek supernatant (adım 4.11) ekleyin.</li>
	<li>Herhangi bir istinatsız türü temizlemek için sütunu 1 mL Yıkama Tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>1 mL su ile kolon bir kez yıkayın.</li>
	<li>CoA-bimane'i toplamak için ayrı bir cam test tüpüne (12 mm x 75 mm) 1 mL Elütion Tampon uyla iki kez kolonu yıkayın.</li>
	<li>Kuru CoA-bimane numunesi tüpte azot gazı altında kuruluk için. Kurutulmuş numune daha fazla kullanıma kadar oda sıcaklığında stabildir. Mühür ve tamamen tüp ve mağaza kapağı.</li>
	<li>HPLC analizi için hazır olduğunuzda, 300 μL suda numuneyi yeniden askıya alın ve 10 s'lik yüksek girdap ile şiddetle karıştırın.</li>
	<li>Herhangi bir çökelti çıkarmak için bir santrifüj tüp filtresi (0,22 μm selüloz asetat, 2 mL boyutu) ve santrifüj 5.000 x g 10 dk için resuspended örnek aktarın.</li>
	<li>Filtrelenmiş numuneyi HPLC enjeksiyonuna uygun bir cam şişeye aktarın.</li>
</ol>6. HPLC arıtma ve CoA-bimane ölçümü
<ol><li>Arabellekleri hazırlayın. Tampon A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Tampon B: Asetonitril (Optima Grade).</li>
	<li>HPLC sistemini güçle. NOT: Laboratuvarımızdaki HPLC sistemi, 2489 Ultraviyole Görünür (UV-Vis) emici dedektörü ve Empower 3 yazılımı ile kontrol edilen 2475 floresan dedektörü ile donatılmış bir Waters e2695 Ayırma Modülüdür. Sistemde ayrıca otomatik numune enjektörü de vardır.</li>
	<li>Tablo 1'deki programı kullanarak her numuneyi (örneğin, 20 μL) Bir İkizler C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm kolonüzerinde 0,5 mL/dk akış hızıyla enjekte edin. Sütun sıcaklığı 25 °C'dir. Λ393 nm'de UV/Görünür dedektör emiciliğini ve λex = 393 nm, λem = 470 nm'de floresan algılamayı ölçün. Bekletme süresi, her örnek kümesinden önce bir CoA-bimane standart eğrisi çalıştırılarak belirlenir.</li>
	<li>Her örnek için CoA-bimane tepe noktasının altındaki alanı kaydedin ve HPLC sütununa enjekte edilen CoA-bimane pmolünü hesaplamak için standart eğriyle karşılaştırın. Doku örnekleri için CoA-bimane absorbans standart eğrisi, doku kültürü örnekleri için CoA-bimane floresan standart eğrisi kullanılır.</li>
	<li>CoA-biman değerleri her örnek için toplam CoA'yı temsil ettikçe, kültür örnekleri için canlı hücre sayısına veya doku örnekleri için mg ıslak ağırlığına normalleşin(Şekil 6). Alternatif olarak, her örnek için DNA veya protein içeriğinormalleştirme sonrasında toplam CoA değerlerini hesaplayın. DNA veya protein içeriği, KOH ilavesi öncesinde numune hazırlama sırasında çıkarılan numune aliquotları kullanılarak ayrı ayrı belirlenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Abiko, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbiko%2C+Y+%22Metabolic+Pathways%22">Metabolic Pathways</a>. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).</li>
<li>Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A%3A+Back+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li>
<li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li>
<li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pantothenate+kinase+gene+%28PANK2%29+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li>
<li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li>
<li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107(2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li>
<li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li>
<li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871(2012).</li>
<li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li>
<li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013(2015).</li>
<li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li>
<li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399(2018).</li>
<li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104(2017).</li>
<li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-4%27-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260(2017).</li>
<li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li>
<li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li>
<li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li>
<li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li>
<li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isolation+procedure+for+short-%2C+medium-%2C+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li>
<li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li>
<li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanes+.17.+%28Haloalkyl%29-1%2C5-Diazabicyclo%5B3.3.0%5DOctadienediones+%28Halo-9%2C10-Dioxabimanes%29+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol%2C+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li>
<li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).</li>
<li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toyoda+A%2CChohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li>
<li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A%2C+dephospho-coenzyme+A%2C+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li>
<li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li>
</ol>

MWF, CS ve SJ kağıt yazdı, MWF ve CS veri ve rakamlar sağlanan, COR deneyler tasarlanmış ve eleştirel el yazması gözden geçirdi. SJ ve COR bekleyen bir patent başvurusu (PCT/ US17/39037) "Pantotenat kinazların küçük molekül modülatörleri" PZ-2891 bileşik bu makalede başvurulan kapsayan St Jude Çocuk Araştırma Hastanesi tarafından düzenlenen mucitler vardır.

Burada, bir emicilik veya floresan çıkış dedektörü ile bir HPLC'ye sahip birçok laboratuvarda erişilebilen çok çeşitli doğrusal algılama ile hücre ve hayvan dokularında toplam CoA'nın ölçülmesi için güvenilir, adım adım bir prosedür gösteriyoruz. Alternatif olarak, kütle spektrometresi CoA ve CoA tiyoesterlerinin değerlendirilmesinde yaygın bir tekniktir, ancak enstrümantasyon maliyeti ve metodoloji ve verilerin yorumlanması için gerekli özel bilgi nedeniyle yaygın olarak mevcut değildir. Kütle spektrometresinde serbest ...

Koenzim A (CoA) tüm canlıorganizmalarda önemli bir kofaktördür ve pantotenik asitten sentezlenir, pantotenat (pantotenik asit tuzu) veya B5 vitamini olarak da adlandırılır. CoA organik asitlerin büyük hücre içi taşıyıcısıdır, asetat ve sinkinat gibi kısa zincirli asitler, propiyonat ve metimalonat gibi dal zincirli asitler, palmitat ve oleat gibi uzun zincirli yağ asitleri, çok uzun zincirli yağ asitleri gibi çoklu doymamış yağ asitleri, ve valproik asit gibi kkneobiyotikler. Organik asit, ara metabolizma1'de 100'den fazla reaksiyonda substrat olarak kullanılmasını sağlamak için CoAile enzimatik olarak bir tiyoester bağlantısı oluşturur. CoA tiyoesterler de allosterik düzenleyiciler ve transkripsiyonel aktivatörler vardır. Şimdi takdir2 hücresel toplam CoA kaynağı düzenlenir3,4; böylece, CoA kullanılabilirliği sınırlayıcı olabilir, ve CoA eksiklikleri felaket olabilir, CoA biyosentezi etkileyen kalıtsal genetik bozukluklar tarafından örneklenen5. Pantotenat kinazi CoA biyosentezinin ilk adımını katalizler (Şekil 1) ve Pantotenat Kiaz İlişkili Nörodejenerasyon, PKAN denilen, PANK2 genmutasyonları neden 6 . COA synthase, COASYN geni tarafından kodlanmış, CoA biyosentezinde son iki adımı katalizler(Şekil 1) ve COASY Protein İlişkili Nörodejenerasyon, CoPAN olarak adlandırılan, COASYN genmutasyonuna neden olur7. Hem PKAN hem de CoPAN beyinde demir birikimi ve CoA eksiklikleri ile ilişkili kalıtsal nörodejeneratif hastalıklardır.
Total CoA hücresel düzeyleri dokular arasında değişir8 ve toplam CoA fizyolojik, patolojik ve farmakolojik durumların çeşitli altında artırabilir veya azalabilir. Karaciğer CoA açlık durumuna beslenen yakıt geçiş sırasında artar9, ve karaciğer CoA düzeyleri leptin eksikliği obez farelera anormal derecedeyüksek10. Karaciğer CoA kronik etanol alımına yanıt olarak azalır11. Pank2 nakavt fare modelinde Beyin CoA düzeyleri perinatal dönemde depresif, ancak daha sonra yetişkin aşamasında beyin CoA içeriği vahşi tip düzeyleri eşdeğerdir, geliştirme sırasında adaptif CoA yanıtı gösteren12. Transgenez veya gen iletim yöntemleri ile doku CoA içeriğinin manipülasyonu metabolik ve sinirsel fonksiyonları etkiler13,14,15. PKAN veya CoPAN için potansiyel tedavilerin preklinik gelişimi etkinlik göstergesi olarak hücre veya doku CoA ölçümleri içerir16,17,18,19,20 . Tüm bu durumların ve bunların metabolik veya fonksiyonel sonuçlarının değerlendirilmesi, toplam CoA'nın ölçümü için nicel bir yöntem gerektirir.
Biyolojik numunelerde CoA'nın ölçülmesi için doğru ve güvenilir bir tahlil birçok laboratuvarda teknik bir sorundur. Doğal CoA tiyoesterlerinin analogları enzimleri kullanan CoA esteri çalışmalarında mekanistik problar olarak yaygın olarak kullanılmış olsa da, ne yazık ki, bozulmamış hücrelerde CoA veya CoA tiyoesterlerini değerlendirmek veya ölçmek için kullanılabilir problar bulunmamaktadır21. CoA dönüşüm, serbest sulfhydryl ile (-SH) moiety, bir CoA tiyoester (veya tersi) farklı bir ortama transfer sırasında hücre veya hayvan dokularında hızlı ve hücre lisis sırasında. Hücrelerdeki çok sayıda ayl-CoA sentezi ve acyl-CoA tiyostazları CoA havuzundaki dönüşümlere aracılık eder ve substratlar biyolojik numunelerde kimyasal veya fiziksel olarak söndürülene kadar aktif kalırlar. Anlamına gelir. Acil-transferazlar ile CoA'dan karnitin'e kadar olan asil gruplarının off-loading'i, CoA/CoA tiyoester dağılımını değiştirebilecek reaksiyonlar ağı içinde bir örnektir. Radyoaktif izleyiciler hücrelerde CoA sentezoranlarını ölçmek için kullanılabilir. Biyolojik numunelerde CoA ve CoA türevlerinin ölçülmesi için kullanılan mevcut yöntemler22 gözden geçirilmiştir ve birleştirilmiş enzimatik spektrofotometrik tahliller, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi tabanlı prosedürleri içermektedir. Ancak, bu yöntemler genellikle belirli CoA moleküler türler üzerinde duruldu ve toplam CoA havuzu varyasyon için kör. Birleştirilmiş enzimatik tahliller genellikle düşük algılama hassasiyetleri nedeniyle daha büyük miktarlarda giriş malzemesi gerektirir ve doğrusallık sınırlı bir aralığına sahiptir.
Laboratuvarımız kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında toplam CoA'nın sayısallaştırılması için güvenilir bir prosedür geliştirmiştir. Strateji, coa türlerinin tüm spektrumu korumak ve analiz etmek için çaba sarf etmek yerine, numune hazırlama sırasında sadece serbest CoA verim için tüm CoA tiyoesterlerin hidroliziçerir. Prosedür, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) sonrasında numune hazırlama, CoA türevileştirme, saflaştırma ve tanımlama için bireysel olarak yayınlanan yöntemlerin bir derlemesidir ve türemiş CoA'nın absorbasyon veya floresan algılama23,24,25. Bu prosedür kullanılarak elde edilen CoA tayini, CoA regülasyonu ve CoA eksikliklerinin tedavisi için terapötik bir yaklaşım geliştirilmesini anlamamızı sağlamıştır.

<table><tbody><tr><td>2- (2-piridil) -etil silika jel SPE sütunu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>koenzim A</td>, <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>870700</td><td></td></tr>, <tr><td>İkizler C18 3 & mu; m 100 & Aring; HPLC sütunu</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>monobromobimane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Tip prob doku bozucu</td><td>Omni International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 motorlu rotor stator homojenizatör</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X santrifüj tüp filtresi</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Fisher</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>Sular 2475 floresan dedektörü</td><td>Sular</td><td>2475</td><td></td>Sular</tr><tr><td>2489 UV-Vis dedektörü</td><td>Sular</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>Sular e2695 ayırma modülü</td><td>Sular</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre ve dokularda koenzim a'nın sayısallaştırılması

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Ortaya çıkan araştırmalar hücresel koenzim A (CoA) kaynağı büyüme, metabolizma ve sağkalım üzerinde zararlı bir etkisi ile sınırlayıcı hale gelebileceğini ortaya koymuştur. Hücresel CoA ölçümü nispeten düşük bolluk ve coa thioesters için ücretsiz CoA dinamik dönüşüm nedeniyle bir meydan okuma, sırayla, çok sayıda metabolik reaksiyonlar katılmak. Bir yöntem, numune hazırlama sırasında birçok biyomedikal laboratuvarda kullanıma uygun geniş bir doğrusal algılama aralığıile bir test verim potansiyel tuzaklar arasında gezinir açıklanmıştır.

Kültürlü hücre ve dokularda toplam CoA tespiti için nispeten hızlı ve güvenilir bir yöntem mBBr kullanarak bir floresan ajan CoA tiyol türevi ve daha sonra ters faz HPLC kullanarak türev coa-biman arındırıcı tarafından geliştirilmiştir. CoA-bimane standardının bilinen ve artan miktarlarının tek tek enjekte edildiği ve CoA-bimane kromatogramlarında zirvelerin altındaki alanların CoA-bimane girişinin bir fonksiyonu olarak çizildiği standart bir eğri ilk olarak oluşturulur (Şekil 4). CoA-bimane...

Bu yöntem, kültürhücreleri ve hayvan dokularından örnek hazırlanmasını, örneklerde koenzim A'nın çıkarılması nı ve türebenizasyonunu, türevleştirilmiş koenzim A'nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için yüksek basınçlı sıvı kromatografisi absorbans veya floresan algılama.

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Koenzim A, kısaca CoA denir, hücremetabolizmasında önemli bir kofaktördür. Kantitatif ölçümler hayvan modellerinde beslenme ve hormonal durumlarla meydana gelen değişiklikleri ortaya koymaktadır. Bu yöntem, basit ve güvenilir bir yöntemle, CoA türevleri ve ücretsiz CoA dahil olmak üzere hücresel CoA'nın toplam miktarını ölçüyor.Beyin demir birikimi ile nörodejenerasyon çeşitli CoA biyosentetik yol genlerinde mutasyonlar ile ilişkilidir. Tüm organizmalar hayatta kalmak, büyüme ve fonksiyon için CoA gerektirdiğinden bu yöntem herhangi bir biyolojik sisteme uygulanabilir. İlk kez araştırmacı olan bir araştırmacı, numune hazırlamada ilk adımlarla mücadele edebilir, burada numuneleri kesinlikle soğuk tutmak ve daha sonra hızlı bir şekilde potasyum hidroksite aktarmak önemlidir.Potasyum hidroksite aktarılmadan önce toplu olarak alınan numune sayısını sınırlayın ve deneysel numunelerle çalışmadan önce transferle pratik yapın. Birçok araştırmacı daha sonra biyokimyasal analiz için biyolojik örneklerin hazırlanmasında katı faz çıkarma ile tanışmış değildir. Başlamak için, paralel olarak triplicate kültür yemekleri inkübat, biyokimyasal analiz için iki ve canlı hücre sayısının belirlenmesi için bir.Kültür geç subconfluent yoğunlukları yaklaştığında, örneğin, insan HepG2/C3A hücreleri altı ila sekiz kez 10 bir yoğunluk büyüdü altı veya HEK 293T hücreleri yaklaşık 1.3 kat 10 00 00 00 000-10 00 bir yoğunluk büyüdü, kültürde yapışık hücreleri hasat. Sonra, aynı kültür çanak buz gibi su bir mililitre ekleyin. Hücreleri çanaktaki soğuk suya kazıyın ve hücre süspansiyonuna 400 mikrolitre 0,25-molar potasyum hidroksit ve 1,5 mililitre su içeren bir cam test tüpüne aktarArak pH'ı 12'nin üzerine çıkarın.Süspansiyonu 10 saniye boyunca yüksekbir şekilde girdaplayarak şiddetle karıştırın. Sonra parafin film ile sıkıca kaplayın ve bir su banyosunda sallayarak olmadan bir saat boyunca 55 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, tek azılı Trizma-hidroklorür çözeltisi 160 mikrolitre ve 100 milimolar mBBr 10 mikrolitre ekleyin.10 saniye boyunca yüksek girdap tarafından karıştırın. Bu da pH'ı serbest CoA ile mBBr reaksiyonu desteklemek için yaklaşık sekize çıkarır. Tüpü parafin filmle kaplayın ve mBBr'nin CoA'nın tiyoliyle reaksiyona sayılması için numuneleri iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.İki saat sonra, asetik asit 100 mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu durdurmak için 10 saniye girdap tarafından karıştırın. Tüpte bir yağış oluşur. Sonra, santrifüj 2, 000 kez g 15 dakika.Çökelmiş hücre enkazını çıkarmak için, katı fazlı ekstraksiyon sütunu temizliği için bir cam test tüpündeki süpernatant'ı aktarın ve kaydedin. Analize başlamadan önce, bir rotamatör-stator homogenizer ile bir prob ve doku bozulması yerleştirmek için tasarlanmış bir cam test tüpüne bir mililitre bir mililitre bir mililitre potasyum hidroksit ekleyin. Tüpü kullanıma kadar buzda tutun.Dondurulmuş doku parçalarını hızlı bir şekilde tartın ve her örnek için ıslak ağırlığı kaydedin. Dokuyu cam tüpe aktarın ve 30 saniye boyunca dokuyu homojenize edin. Doku tamamen çözülmesinden kaçının.0.25-molar potasyum hidroksit 500 mikrolitre ekleyin. Girdap 10 saniye yüksekte ve buzda kal. Bu toplam CoA verim coa tiyoesters hidrolize 12 yukarıdaki numunenin pH getiriyor.Tüpü parafin filmle kaplayın. Kültürlü hücrelerin hazırlanması ve dokuların hazırlanması bu işlemin en kritik adımlarıdır. CoA bozulmasını önlemek için hızlı bir şekilde yüksek potasyum hidroksit eklemek önemlidir.Hidrolizi desteklemek için titremeden numuneleri su banyosunda iki saat boyunca 55 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 150 mikrolitre tek molar Trizma-hidroklorür ve 100 milimolar mBBr 10 mikrolitre eklemek ücretsiz CoA ile mBBr reaksiyonu desteklemek için yaklaşık sekiz pH getirmek için. Girdap 10 saniye boyunca yüksekte.Tüpü parafin filmle kaplayın ve tüm CoA'nın mBBr ile türetilmesini sağlamak için numuneleri karanlıkta iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, asetik asit 100 mikrolitre ekleyin ve yüksek girdap 10 saniye boyunca reaksiyonu durdurmak için. 2, 000 kez g 15 dakika pelet çökelmiş hücre enkaz için santrifüj ve katı faz çıkarma sütunu temizleme için bir cam test tüpü içine supernatant aktarın.Oda sıcaklığında, piriridil fonksiyonel grubun protonated ve bir aniyon değiştirici olarak işlev sağlayacak yıkama tampon bir mililitre ile her bir mililitre tek kullanımlık 2-2-piriridyl-etil silika jel sütun dengeleyin. Daha sonra, pipet örnek supernatant sütun üzerine supernatant ve eluate toplamak. Sütunu bir mililitre yıkama tamponuyla iki kez ve bir mililitre suyla yıkayın.Daha sonra, ayrı bir cam test tüpü içine, CoA-bimane toplamak için elüsyon tampon bir mililitre ile iki kez sütun yıkayın. Tüpteki CoA-bimane örneğini azot gazı altında kurutun. Seal, tamamen tüp kapağı, ve eksi 20 santigrat derece saklayın.HPLC analizi için hazır olduğunuzda, 300 mikrolitre suda numuneyi yeniden askıya alın ve 10 saniye boyunca yükseklere girdap atarak şiddetle karıştırın. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dakika boyunca 5.000 kez g olarak bir santrifüj tüp filtresi ve santrifüj için resuspended örnek aktarın. Daha sonra, filtrelenmiş numuneyi HPLC enjeksiyonu için uygun bir cam şişeye aktarın.Bu çalışmada, temsili bir HPLC profili C18 HPLC sütununda CoA-bimane standardının bekletme süresini göstermektedir. CoA-bimane standardının artan miktarları ayrı ayrı enjekte edildi ve CoA-bimane kromatogramlarında zirvelerin altındaki alanlar CoA-bimane girdisinin bir fonksiyonu olarak çizildi. Standart eğri 393 nanometre dalga boyunda CoA-bimane emicilik büyüklüğünü yansıtıyor.CoA-bimane floresansı da 393 nanometre uyarma dalga boyu ve 470 nanometre emisyon dalga boyu yansıtıldı. Sonraki HPLC ayırma ve fare karaciğer veya insan kültürlü C3A hücreleri için tipik algılama profilleri burada kırmızı zirveleri ile gösterilir, arasında bir tutma süresi ile 11 ve 12 dakika elüsyon programı kullanılarak. mBBr ile reaksiyon tespit edilebilir sonuçlar vermezse, TRizma-HCl miktarının pH'ı yaklaşık sekize düşürmek için ayarlanması gerekebilir.Bu bimantürevleri olarak sulfhydryl veya tiyoester moieties içeren ek hücresel molekülleri tespit etmek mümkündür. Örneğin, glutatyon-bimane HPLC yöntemi ile tespit edilebilir. Bu teknik, diğer araştırmacıların tip 2 diyabetin hayvan modelleri gibi metabolik dengesizlikle ilişkili CoA disfonksiyonunun potansiyel rolünü araştırmalarına olanak sağlayacaktır.Araştırmacılar, katı faz lı ekstraksiyon için kullanılan organik çözücülerle çalışırken kişisel koruyucu ekipman kullanmalıdır.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, 14C-radyoaktif işaretli substrat kullanılarak substrat oksidasyonu sırasında salınan CO2 için bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Serbest bırakılan 14CO2, alkali bir çözelti içinde tutulur ve bir sintilasyon sayacı ile ölçülür. Farklı substratların oksidasyonu dokular arasında değişir ve dokunun patofizyolojik durumunu yansıtır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Substrat Oksidasyon Deneyi: Hapsolmuş CO2'den Radyoaktif Sinyalleri Ölçerek Hücrelerde Substrat Oksidasyonunu Ölçmek İçin Bir İn Vitro Test

Bu video, karmaşık gıda kaynaklarında demir biyoyararlanımını değerlendirmek için bir in vitro tekniği göstermektedir. Teknik, farklılaşmış Caco-2 hücreleri tarafından demir alımı ile birlikte insan sindiriminin simülasyonunu birleştirir. Hücre içi ferritin oluşumu, hücresel demir alımı için bir belirteç görevi görür.

Caco-2 Hücre Biyo-Testi: Karmaşık Gıda Kaynaklarında Demir Biyoyararlanımını Ölçmek için İn Vitro Bir Yöntem

Değişen hücre içi heme seviyeleri, kanser gibi yaygın hastalıklarla ilişkilidir. Bu nedenle, çeşitli hücrelerde hem biyosentez seviyelerinin ölçülmesine ihtiyaç vardır. Bu protokolün amacı, farklı hücrelerde hem sentezi seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için hızlı ve hassas bir yöntem sağlamaktır.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Burada izole edilmiş insan trombosit Ben rotenone inhibitör kompleksi cevaben metabolik uyarlamalar incelemek için ex vivo olarak erişilebilir bir şekilde modeli kullanılabilir göstermektedir. Bu yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile izotopik izleme ve nispi miktarını kullanır ve çalışma düzeni, çeşitli uygulanabilir.

Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + 'nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Demir (Fe) biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan, gıda ürünlerinden, takviyelerden, yemeklerden ve hatta diyet rejimlerinden Fe biyoyararlanımını değerlendirmek için uygun maliyetli ve çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder. İnsan çalışmalarına tamamen doğrulanmış, Fe biyoyararlanımı çalışmaları için en son teknolojiyi temsil eder.

Gıda Demir Biyoyararlanımının Ölçümü için Caco-2 Hücre Biyotahlili

Çok hücreli 3D tümör sferoidleri, akciğer adenokarsinom hücreleri, fibroblastlar ve monositler ile hazırlandı ve bunu kanserle ilişkili fibroblastların (CAF'lar) bu sferoidlerden izole edilmesi izledi. İzole CAF'lar, mitokondriyal transmembran potansiyelini, reaktif oksijen türlerini ve enzimatik aktiviteleri inceleyerek mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için normal fibroblastlarla karşılaştırıldı.

3D Çok Hücreli Akciğer Tümörü Sferoidlerinden İzole Edilen Kanserle İlişkili Fibroblastlarda Mitokondriyal Sağlığın Değerlendirilmesi

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Bu protokol, uzun zincirli ve çok uzun zincirli doymuş yağ asitlerinin BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 floresan analogları ile stimülasyon üzerine endotel hücrelerinde hücresel lipid alımını ölçmek için bir in vitro testi detaylandırır. Bu yöntem verimlidir ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir ve lipid metabolizmasını incelemek için yararlı bir yaklaşım sunar.

Floresan Yağ Asidi Analogları Kullanılarak Endotelyal Yağ Asidi Alımının Miktar Tayini

Öğrenin hücre ve dokularda koenzim A nicelendirmesi için güvenilir bir yöntem. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanarak metabolizma ve nörodejenerasyon araştırmalarında CoA düzeylerini ölçün.

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Daha fazla video keşfet