Name: Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Keşfedin, tümör hücrelerinin makrofaj aktivasyonunu baskılayan parakrin sinyallerini Transwell ko-kültür yöntemiyle nasıl inceleyebilirsiniz. Bu teknik, fiziksel temas olmadan bağışıklık baskılayıcı mekanizmaları analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eric Ubil, kısmen, Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Bursu (128770-PF-15-216-01-LIB) tarafından finanse edildi. Çalışma NIH (R01-CA205398) ve Meme Kanseri Araştırma Vakfı ödülü (BCRF-18-041) hse bir hibe tarafından desteklendi.

Murin periton makrofajlarının hasat ve kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'nde (UNC) yürütülmüş ve UNC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Makrofaj kültürü
NOT: Bu yordam, birincil periton makrofajları (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır), kemik iliği kaynaklı makrofajlar veya J774 (ATCC) veya RAW264 (ATCC) gibi makrofaj hücre hatlarını kullanabilir.
<ol><li>Hasat periton makrofajlar daha önce açıklandığı gibi16,17 ve plaka doğrudan üst hazneiçine 0.4 μm polyester membran eklemek co-kültür 6 kuyu plakası(Şekil 1A). NOT: Her izolasyondan makrofajların yaklaşık verimi toplam 1 x 106 hücredir, bu nedenle kuyu başına ortalama hücre sayısı ~1.5-1.6 x 105 hücredir.</li>
	<li>Kültür Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM)/F12, 10% Fetal Sığır Serum (FBS), 1x penisilin / streptomisin, 20 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CF) 3 gün için hasat makrofajlar 37 °C, 5% CO2. NOT: Alt hazne 1,5 mL ile doldurulurken üst haznede 1 mL kültür ortamı içerir. Ortam her odaya eklenmelidir.</li>
</ol>2. Makrofajlı tümör hücrelerinin eşkültürü
<ol><li>Kullanmadan önce, atcc tarafından önerilen doku kültürü yöntemlerini takiben kendi ortamlarında ticari olarak mevcut olan tümör hücreleri.</li>
	<li>Yapışık tümör hücrelerini bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, %0,05 tripsin + etilenediamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve hücreler ayrışana kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Orta içeren FBS hücreleri resuspend, bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak hücrelerin toplam sayısını quantitate, ve sonra pelet için 220 x g 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Santrifüj sırasında, makrofaj içeren geçirbilebilir membran destek plakalarının üst ve alt odalarından orta aspirat ve taze ortam ile değiştirin.<ol>
<li>Tümör hücrelerinin kaplandığı alt bölmeler için, hücre ilavesi için yeterli hacim sağlamak için 1,5 mL yerine 1 mL orta ile doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DMEM/F12'de %10 FBS, 1x penisilin/streptomisin ve 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonda 20 ng/mL M-CSF ile pürelenmiş tümör hücrelerinden aspire ortamı.</li>
	<li>İstenilen kuyuların alt haznesine 0,5 mL 3 x 105 hücre/mL tümör hücresi ekleyin (Şekil 1B). NOT: Hücreler hemen tedavi edilebilir.</li>
</ol>3. Ortak kültürlü hücrelerin tedavisi
<ol><li>Makrofaj pro-inflamatuar gen ekspresyonunu indüklemek için, 100 ng/mL IFNγ ve 50 ng/mL LPS ekleyerek tek başına veya eş kültürlü makrofajları tedavi edin.<ol>
<li>Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu içinde oluşur 2 saat ve bazı tümör aracılı bastırma oluşur 8 h. Co-kültür için 24 h sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama verimleri. NOT: Alternatif olarak, makrofajlar interlökin-10 (IL10) gibi faktörlerin eklenmesi ve tümör salgılanan ligand etkisi değerlendirilerek yara yanlısı bir iyileşme fenotip indüklenebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Olumsuz bir kontrol olarak, kültür makrofajlar tek son ve tedavi edilmezse bırakın. Pozitif kontrol olarak, 100 ng/mL IFNγ ve 50 ng/mL LPS ile tek kültürlü makrofajları tedavi edin.</li>
</ol>4. Ortak kültürlü hücrelerin downstream analizi
<ol><li>İstenilen kuluçka süresi geçtikten sonra, test ihtiyaçlarına bağlı olarak, hücre lisate veya koşullandırılmış kültür ortamını istenilen şekilde izole edin.</li>
	<li>Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için hücre lisatını izole etmek için, kuyunun her iki odasından da ortam alıvurun ve 2 mL PBS ile bir kez yıkayın. RNA lysis tamponu makrofajları içeren üst hazneye uygulayın. Hücre lisatını serbest bırakmak için membranı yavaşça kazıyın ve RNA izolasyon kiti üreticisinin protokolüne göre daha fazla işlem için bir toplama tüpüne aktarın.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan co-kültür tahlil bağışıklık hücresi aktivasyonu üzerinde tümör salgılanan faktörlerin incelenmesi için izin veren daha önce kurulmuş tahliller bir değişikliktir. Hücre-hücre temasının immün aktivitede değişikliklere yol açtığı bilinmekle birlikte, tümörse salgılanan ligandların bağışıklık aktivasyonunu modüle etme yeteneği daha az anlaşılmaktadır. Doğrudan ortak kültürün aksine, tümörkaynaklı salgılanan sekans faktörlerinin temas aracılı sinyalin kafa karıştırıcı doğası olmadan bağışıklık hücre aktivasyonu...

Son çalışmalar, kanser hücrelerinin bağışıklık hücreleri tarafından tespit önlemek için yeteneği üzerinde duruldu, lokal immün aktivasyonu bastırmak, ya da tümör mikroortamda bir tolerojenik tümör-buna kalım ortamı üretmek için. Bu etkileri kolaylaştıran iki geniş tümör ve bağışıklık hücresi etkileşimi sınıfı tanımlanmıştır: temas aracılı etkileşimler veya tümör salgılanan ligandlar. Tümörler tarafından kullanılan temas aracılı immün inhibisyonun en iyi çalışılmış ve klinik olarak çekilebilir mekanizmalarından biri PD-L1 ifadesidir, hangi PD-1 ile T hücreleri onların aktivasyon vefonksiyoninhibe etkileşime 1,2. Aktif bağışıklık hücrelerinin bir dizi tarafından ifade edilen interferon-gama (IFNγ), yanıt olarak, tümör hücreleri PD-1-ifade aktive T hücrelerinin yorgunluğunu neden pd-L1 ekspresyonu artırabilir, bu nedenle etkili tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasını engelleyerek3. PD-L1 ve PD-1 arasındaki etkileşimi engellemek için antikorların kullanımı şu anda insanlarda birden fazla kanser türlerini tedavi etmek için kullanılır4. Bu klinik başarı ve diğerleri ışığında, tümör kaynaklı immünsupresif mekanizmaların tanımlanması ve hedefalınması giderek artan bir ilgi almıştır.
Adaptif bağışıklık baskılanması ötesinde, tümörler de doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin pro-inflamatuar yanıtları bastırmak faktörlerse salgılamak bilinmektedir. Tümör kaynaklı veya tümör kaynaklı salgılar, IL-6 dahil, IL-10, VEGF, IL-23, ve koloni uyarıcı faktör (BOS-1), doğal katil antitümör yanıtlarını inhibe gösterilmiştir (NK) hücreleri, granülositler, ve tümör mikroortamında dendritik hücreler5,6,7. Tümör hücreleri de t hücre aktivasyonu bastırılması teşvik etmek için tümör mikroortamında işe alım ve miyeloid türetilmiş hücrelerin farklılaşması çarpık faktörler salgılayabilir8,9.
Tümör progresyonu üzerinde derin bir etkiye sahip doğuştan gelen bağışıklık hücresi bir türü makrofaj olduğunu. Uzun yıllar boyunca, tümör ilişkili makrofajlar varlığı (TAMs) hasta sağkalım negatif prognostik olarak kullanılmıştır10. İmmünsupresif TAM'ların immün hücre aracılı tümörlerin temizlenmesini azalttağı kavramı 40 yıldan daha uzun bir süre önce11. Daha yakın zamanda, makrofaj pro-inflamatuar yanıtın alt regüle edilebildiği, tümör mikroortamında pro-tümör fenotipinin indüklenebileceği gösterilmiştir. Bu immünsupresif makrofajlar tolerojenik bir yanıta katkıda bulunabilir, tümör ilerlemesi ve kemoterapi direnci sürüş- ve immünoterapi12. Makrofajlar genellikle tümör ile en bol lökositler biri olduğu göz önüne alındığında, onların tümöre özgü bağışıklık aktivitesinin restorasyonu antikanser terapötikler için potansiyel bir hedef temsil13.
Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki temas aracılı etkileşimler doğrudan kokültür yoluyla modellenebilir iken, geçirgen membran desteklerkullanımı tümör-immün hücre hücre teması potansiyel şaşırtıcı etkisi olmadan hangi tümör salgılanan faktörlerin immünomodülatör olduğunu açıklayabilir. Biraz benzer yöntemler kullanarak, diğerleri mikroglia / nöronal etkileşimleri salgılanan faktörlerin belirlenmesi potansiyelini göstermiştir14 yanı sıra mezotelyal hücreleri ile tümör hücreleri15. Ayrıca bu ortak kültür tekniğini, LPS ve interferon-gamma16ile periton makrofajlarının uyarılmasından sonra pro-inflamatuar gen ekspresyonunun bastırıcısı olarak tümör salgılanan bir protein olan Pros1'in rolünü karakterize etmek için başarıyla kullandık. Burada tümör salgılanan faktörlerin makrofaj aktivasyonunu nasıl etkileyebileceğini sorgulamak için kullanılabilecek basit bir metodolojiyi açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>cDNA sentez kiti</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Millipor</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O111: B4'ten lipopolisakkaritler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr>, <tr><td>Murin, M-CSF</td>, <td>Prospec</td>, <td>CYT-439</td><td></td></tr>, <tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>, 15140122</td><td></td></tr>, <tr><td>Pros1, ELISA</td>, <td>MyBioSource</td>, <td>MBS2886720</td> RAW264.7, ATCC, ATCC, TIB-71, Rekombinant Fare, <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> IFN&gama;<td></td></tr><tr><td></td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX kiti</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Transwell geçirgen destekler</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

permeable membran destekleri ile co-culture kullanarak tümör salgılanan parakrin ligandların makrofaj aktivasyonu Üzerine etkilerinin İnceleştirilmesi

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tümör kaynaklı parakrin sinyalizasyon lokal immünsupresyonun gözden kaçan bir bileşenidir ve sürekli kanser büyümesi ve metastaz için izin verilen bir ortama yol açabilir. Parakrin sinyalleri farklı hücre tipleri arasında hücre-hücre teması içerebilir, PD-L1 gibi tümörlerin yüzeyinde doğrudan T hücrelerinin yüzeyinde PD-1 ile etkileşim, ya da bir tümör hücresi tarafından ligands salgılanması bir bağışıklık hücresi etkilemek için ifade. Burada tümör salgılanan ligandların bağışıklık hücresi (makrofaj) aktivasyonu üzerindeki etkilerini sorgulamak için bir ortak kültür yöntemi ni tanımlıyoruz. Bu basit prosedür, ticari olarak mevcut 0,4 μm polikarbonat membran geçirgen destekler ve standart doku kültür plakaları kullanır. Açıklanan süreçte makrofajlar üst haznede, tümör hücrelerinde ise alt odada kültürlenir. 0.4 μm bariyerinin varlığı, iki hücre tipi aynı ortamı ve parakrin ligandlara maruz kalma açısından şaşırtıcı değişkeni olmadan hücreler arası sinyalleme nin incelenmesine olanak sağlar. Bu yaklaşım, makrofajın genetik değişiklikleri (örn. genetik nakavt farelerden izolasyon) veya tümör (örneğin, CRISPR aracılı değişiklikler) gibi diğer kişilerle birleştirilip belirli salgılanan faktörlerin ve reseptörlerin rolünü inceleyebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda iki hücre popülasyonlarını ayırmak için akış ayarı gerek kalmadan, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) veya Batı leke analizi gibi standart moleküler biyolojik analizlere de katkıda bulunur. Enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) benzer şekilde çoklu hücre tipi bağlamda hücre sinyalinin dinamik etkileşimini daha iyi anlamak için salgılanan ligandları ölçmek için kullanılabilir. Eş-kültür süresi de zamansal düzenlenmiş olayların çalışma için çeşitli olabilir. Bu co-kültür yöntemi bağışıklık bağlamında tümör salgılanan sinyallerin çalışmasını kolaylaştıran sağlam bir araçtır.

Tümör salgılanan ligandların makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için açıklanan prosedür kullanılmıştır. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif (tedavi edilmemiş = çok sol) ve pozitif (IFNγ ve LPS uyarılmış = 2soldan) kontrolleri olarak kullanılmıştır (Şekil 2A). Alternatif olarak, periton makrofajları B16F10 melanom tümör hücreleri (ATCC) ile birlikte kültürlendi (Şekil 1A). Kaplamadan hemen sonra ...

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Bu Transwell co-kültür yöntemi bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan parakrin sinyal çalışması için kullanılır. Bu yöntem yeni salgılanan ligands keşfetmek için kullanılabilir, yanı sıra bağışıklık baskılayıcı etkileri mekanistik temelleri. Daha önce tümör salgılanan faktörlerin makrofaj pro-inflamatuar gen transkripsiyonuna nasıl engel olabileceğini göstermek için bu yöntemi kullandık.Bu aletin tümör kaynaklı immün baskılama çalışmalarında geniş kapsamlı etkileri olduğuna inanıyoruz. Bu tekniğin en önemli avantajlarından biri, hücre-hücre temasının potansiyel olarak kafa karıştırıcı değişkeni olmadan tümör hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki parakrin sinyalizasyon çalışmaları için kullanılabilmedir. Bu platform aynı zamanda downstream analizi için moleküler biyolojik teknikler çeşitli münasip olduğunu.Periton makrofajları hasat ettikten sonra, doğrudan 0,4 mikrometre polyester membran eklemek co-kültür altı-iyi plaka üst odaları içine plaka. Daha sonra üst oda bir mililitre ve alt oda 1.5 mililitre içeren kuyuya eklenmiş DMEM eklendi. %5 karbondioksitle 37 derecede üç gün kuluçkaya yat.İlk olarak, atcc aşağıdaki kendi ortamda kültür ticari olarak kullanılabilir doku kültürü yöntemleri önerilir. Daha sonra, yapışık tümör hücrelerini pbs ile bir kez yıkayın. EDTA'da %0.05 tripsin ekleyin ve hücreler ayrışana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ardından, FBS içeren ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Pelet için beş dakika için 220 kez G hücre ve santrifüj toplam sayısını quantitate için bir hemositometre veya hücre sayacı kullanın. Santrifüj sırasında, geçirilmez membran destek plakaları içeren makrofajın üst ve alt odalarından ortayı aspire edin ve taze ortamla değiştirin.Tümör hücrelerinin kaplandığı alt bölmeler için, hücre ilavesi için yeterli hacim bırakmak için 1,5 mililitre yerine bir mililitre orta ile doldurun. Santrifüj tamamlandığında, peletli tümör hücrelerinden orta aspire ve mililitre başına 300, 000 hücre konsantrasyonu ile eklenmiş DMEM hücreleri yeniden askıya. İstenilen kuyuların alt odasına bu hücre süspansiyon0,5 mililitre ekleyin.Makrofaj pro-inflamatuar gen ekspresyonunu indüklemek için, mililitrede 100 nanogram ve mililitrede 50 nanogram konsantrasyonda LPS konsantrasyonuna interferon gama ekleyerek tek başına veya eş kültürlü makrofajları tedavi edin. Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu iki saat içinde gerçekleşir ve bazı tümör aracılı bastırma sekiz saat oluşur.24 saat boyunca ortak kültür sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama sağlar. Olumsuz bir kontrol olarak, kültür makrofajlar tek son ve tedavi edilmezse bırakın. Pozitif kontrol olarak, tek kültürlü makrofajları interferon gama ve LPS ile numuneler için kullanılan aynı konsantrasyonlarda tedavi edin.İstenilen kuluçka süresi geçtikten sonra, test ihtiyaçlarına bağlı olarak hücre lisate veya durum kültürü ortamını istenildiği gibi izole edin. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyon analizi için hücre lisatını izole etmek için, kuyunun her iki odasından ortayı aspire edin ve iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. RNA lysis tamponu makrofajları içeren üst hazneye uygulayın.Bundan sonra, hücre lisatını serbest bırakmak için membranı hafifçe kazıyın ve RNA izolasyon kiti üreticisinin protokolüne göre daha fazla işleme için bir toplama tüpüne aktarın. Burada açıklanan ortak kültür yöntemi makrofajlar ve tümör hücrelerinin fiziksel temas olmadan kültürünü içerir. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılır.Peritoneal makrofajlar B16F10 tümör hücrelerinin varlığında eş kültürlü ancak uyarıcı aktive olmadan pro-inflamatuar ilişkili genlerin ekspresyonunu artırmaz. Bu tümör salgılanan ligands ya kendileri tarafından pro-inflamatuar gen ekspresyonu neden yeterli olmadığını ima, ya da tümör salgıları ile bağışıklık aktivasyonu varsa, parakrin ligands doğal seviyelerine bastırmak için yeterli dir. Bu eş-kültür yöntemi, interferon gama ve LPS ile polarize makrofajlar tümör hücrelerinin varlığında kültürlendiğinde, inflamasyona bağlı gen ekspresyonunun baskılanmasının %60'a kadar azaldığı, rurine makrofaj hücre hattı J774 peritonmakrofajlarının yerine geçildiğinde makrofaj pro-inflamatuar gen baskılanmasının karşılaştırılabilir düzeyde gözlendiğini göstermektedir.Önceki çalışmada makrofaj aktivasyonunu inhibe edebilir bir tümör salgılanan faktör olarak protein S tespit etmiştir, bu nedenle geçirgen membran destek co-kültür modeli 24 saat sonra şartlı ortamda protein S konsantrasyonu teşif etmek için bir lysA ile birlikte kullanılır. İnterferon gama ve LPS ile tedavi edilen B16F10 melanom hücrelerinden klimalı ortamda, Protein S mililitre başına yaklaşık 475 nanogram konsantrasyonu ile ifade edilir. Aynı koşullarda tedavi edilen peritoneal makrofajlar mililitrede yaklaşık 61 nanogram protein S'yi ifade etti.İlginçtir, co-kültür, interferon gama protein S konsantrasyonu ve LPS tedavi iyi mililitre başına yaklaşık 86 nanogram oldu. Bu da ya makrofajların tümörse salgılanan protein S'i yuttuğunda ya da Makrofajlar varlığında B16F10 hücreleri tarafından salgılanan Protein S miktarının önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Bu sonuçlar, makrofajlar tümör hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde makrofaj aktivasyonu ve parakrin sinyalizasyon derin değişiklikler vurgulamak.Transwell ortak kültür yöntemi parakrin sinyalizasyon ile ilgili çeşitli soruları yanıtlayabilir. Tümör salgılanan proteinlerin makrofajlarda çeşitli sinyal yollarını nasıl değiştirdiğini belirlemek için Batı leke analizi yapılabilir.

studying-effects-tumor-secreted-paracrine-ligands-on-macrophage

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, bir ko-kültürde makrofaj fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) regülasyonunu incelemek için yapılan bir testi göstermektedir. MSC'nin makrofajlarla birlikte kültürlenmesi üzerine, pH'a duyarlı bir florofora konjuge edilmiş opsonize olmayan zimozan partikülleri, makrofajlar tarafından fagosite edilmek üzere eklenir. Fagositozdaki artışla birlikte, floresan yoğunluğu artar ve fagositik aktivitenin MSC aracılı regülasyonunun belirlenmesine izin verir.

Mezenkimal Kök Hücreler ile Makrofaj Fagositozunun Düzenlenmesini İncelemek İçin Bir Test

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Kanserin kötü huylu davranışını anlamak, tümör hücrelerinin makrofajlar gibi tümör mikro çevresinin bileşenleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair doğru modeller oluşturmayı gerektirir. Burada, tümörle ilişkili makrofajlar ve mikroglia ile glioblastoma hücre etkileşimini incelemek için iki yöntem tanımlanmıştır ve burada glioblastoma invazyonu üzerindeki etki değerlendirilmektedir.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Parakrin ve juxtacrine hücresel etkileşimlerin tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada, proksimal kültür yöntemi parakrin sinyal incelemek için doğrudan hücresel temas engelleyen sırasında salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları nerede saklanır kullanılır.

Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

İnsan CART ve miyeloid hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için mevcut olan sınırlı ksenogreft modelleri göz önüne alındığında, insan makrofajlarının CART hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için in vitro ve in vivo modeller oluşturduk. Bulgular, tümör mikroçevresindeki makrofaj rollerini değerlendirmek ve makrofaj hedefli immünoterapileri test etmek için potansiyel olarak genelleştirilebilir.

Miyeloid Hücreler ve CAR T Hücreleri Arasındaki Etkileşimlerin İn Vitro ve İn Vivo Olarak İncelenmesi

Keşfedin, tümör hücrelerinin makrofaj aktivasyonunu baskılayan parakrin sinyallerini Transwell ko-kültür yöntemiyle nasıl inceleyebilirsiniz. Bu teknik, fiziksel temas olmadan bağışıklık baskılayıcı mekanizmaları analiz etmenizi sağlar.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Daha fazla video keşfet