Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Bu protokol, tek bir ekstraksiyon yöntemi ve tek bir LC-MS yöntemi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'nin on farklı lipid sınıfını ölçmek için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem, farklı kimyasal ve fiziksel özelliklere sahip izobarik ve izojik lipidik türlerin saptanmasını ve nicelemesine olanak sağlar. Saccharomyces cerevisiae kültürü için, ilk olarak steril YNB orta içeren iki Erlenmeyer şişelerinin her birine %2'lik son glukoz konsantrasyonuna 5 ml steril %20 glikoz çözeltisi ekleyin.

Daha sonra, her şişe ve kültür her şişe içine yedi maya hücreleri beş kez on içeren bir gecede maya kültürünün bir hacim aktarmak için steril bir pipet kullanın dakikada 200 devrimleri rotasyonsal sallayarak 30 derece santigrat en az 24 saat şişeleri. Lipid ekstraksiyonu için, kültür mililitre başına maya hücrelerinin toplam sayısını belirlemek ve 15 ml santrifüj tüp içine yedinci hücrelere beş kez on aktarın. 15 ml kadar toplam hacmi getirmek ve santrifüj ile hücreleri toplamak için buz gibi nano saf su ekleyin.

İkinci bir santrifüj için 15 ml buz gibi izo-tonik amonyum bikarbonat tamponundaki maya peletini yeniden askıya alın ve peleti 1,5 ml taze buz gibi amonyum bikarbonat çözeltisi içinde yeniden askıya alın. Santrifüjün sonunda, peleti çıkarma kadar 80 derecede saklayın. Lipid ekstraksiyonu başlatmak için, buz soğuk nano saf su 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya almadan önce buz üzerinde hücre pelet çözülme.

Bir duman kaputunda, hücre süspansiyonunu 15 ml'ye, yüksek mukavemetli bir cama, politetrafloroetilen kaplı kapaklı vidalı üst santrifüj tüpüne aktarın ve 2:1 kloroform metanol'de hazırlanan dahili lipid standartları karışımından 25 mikrolitre ekleyin. 100 mikrolitre 425-600 mikromolar asit yıkanmış cam boncuklar ve tüp bir 17:1 kloroform metanol 600 mikrolitre. Hücreyi bozmak için tüpü oda sıcaklığında beş dakika yüksek hızda girdaplayın.

Lipid ekstraksiyonu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında düşük hızda bir saat girdap takip. Ekstraksiyon sonunda, protein yağışı ve sulu ve organik fazların ayrılması teşvik etmek için, buz üzerinde 15 dakika boyunca örnek kuluçka. Kuluçka sonunda, alt organik fazdan üst sulu fazı daha fazla ayırmak için numuneyi santrifüj edin ve duman kaputunda, alt organik fazı politetrafloroetilen kaplı kapaklı yeni 15 ml'lik yüksek mukavemetli cam vidaüst santrifüj tüpüne aktarmak için borosilikat cam pipet kullanın.

Azot gazı akışı altında alt organik faz yerleştirin ve, duman kaputunda, kalan üst sulu faza 2:1 kloroform metanol karışımı 300 mikrolitre ekleyin. Fosfatidikasit, fosfatidilserin, fosfatidilisol ve kardiyo-lipid ekstraksiyon girdap kuvvetle oda sıcaklığında beş dakika boyunca tüp teşvik etmek için örnek santrifüj önce. Azot altında alt organik faz içine alt organik faz aktarmak ve duman kaputundaki kombine organik fazlarda çözücü buharlaştırmak için bir borosilikat cam pipet kullanın.

Daha sonra, azot gazı akışı altında lipid film tüpleri kapatın ve 80 santigrat derece örnekleri saklayın. Sıvı kromatografiiçin, çıkarılan lipidlerin 500 mikrolitrelik bir 63:35:5 aceto-nitril-2-propanol nano-saf su karışımının lipid film tüpüne ayrılması ve oda sıcaklığında girdap başına üç kez girdap. Sadece gösterildiği gibi girdap başına on saniye için tüp üç kez girdap önce 15 dakika boyunca ultrasonik sonication için tüp içeriğini tabi.

Numunenin 100 mikrolitresini 24 kuyu plakası için kullanılan bir kesici uçla cam bir şişeye aktarın ve kesici uçtaki kabarcıkları ortadan kaldırın. Kesici ucu 24 kuyuluktan birine yerleştirin ve sıvı kromatografi sistemine bir ön kolonla birleşen ters faz C18 sütun CSH yükleyin. Kolon sıcaklığını 55 dereceye, akışı dakikada 300 mikrolitreye ayarlayın.

Tüm parametreler ayarlandığında, ilk numuneyi yüklemeden önce bir çıkarma boşunun on mikrolitresini yükleyin. Daha sonra, belirtildiği gibi sıvı kromatografi gradient kullanarak farklı lipid türleri ayırın. Hücrelerden çıkarılan lipidler için LC-MS verilerinden temsili bir iyon kromatogramı üretilecektir.

Çıkarılan lipidlerin kütle spektrometrik analizi için, numuneleri ısıtmalı elektro-sprey iyonizasyon kaynağı ile donatılmış bir kütle spektrometresine yükleyin ve analiz parametrelerini tabloda belirtildiği şekilde ayarlayın. MS-1 ana iyonlarını 60,000 çözünürlükte ve 150-2000 dalton kütle aralığında tespit etmek için Fourier Transform Analyzer'ı kullanın. Ardından, tabloda belirtildiği gibi ayarları kullanarak MS-2 ikincil iyonlarını algılayın.

Geniş tandem LC-MS dosyalarından farklı lipitleri tanımlamak ve ölçmek için, tam tarayın MS-1 verileri ve veri bağımlı MS-2 verilerini içeren LC-MS ham dosyalarını ücretsiz, estersiz yağ asitleri için arayın, kardiyo-lipid, fitoserimid, fitosidilamid, fitosidilgolen, fosfatidiletanolamin, fosfatiddenolamine, fosfatydlinositol, fosfatydlinositol, fosfatydlserinve triacifiyinserinve triacylglycerol lipid sınıfları prekürsör iyonları iyonları iyonları için milyon da perdelik beş parça ve milyon iyonları için on parça şarj toleransı ile bölünmüş bir kitle kullanarak. Daha sonra, olağandışı yağ asidi bileşimlerine sahip dahili lipid standartlarını ve lipid türlerini belirlemek için yazılım kullanım kılavuzunda verilen talimatları uygulayın. Bu hassas tandem LC-MS yöntemi, mikrolitre başına 0,165 picomolar gibi düşük konsantrasyonlarda lipidmoleküler türlerinin tanımlanmasını ve sayısallaştırılmasını sağlar.

Bu sayısallaştırma sınırı, çok çeşitli konsantrasyonlarda farklı lipid sınıflarından farklıdır. Bu yöntem, elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi için alternatif mobil faz katkı maddeleri kullanılarak lipidler için iyonlaşma nın verimliliğini artırmak için kullanılabilir. Bu alternatif mobil faz katkılarının her biri hem normal faz hem de ters faz LC sütunları için kullanılabilir.

Çarpışmaya bağlı dissosilasyon yöntemi, kitle spektrometresinin elektro-sprey iyonizasyon negatif modu için amonyum asetat mobil faz katkısı ile birlikte kullanıldığında faydalıdır, çünkü bu koşullar altında MS-1 lipid iyon parçalanmasının MS-2 ürünlerine veriminin artmasına olanak sağlar. Buna karşılık, yüksek enerji, çarpışma dissosiyasiyon yöntemi bu koşullar altında olduğu gibi kitle spektrometresi elektro-sprey iyonizasyon pozitif modu için amonyum formatmobil faz katkı ile birlikte kullanıldığında olumlu, MS-1 lipid iyon parçalanması nın MS-2 ürünlerine veriminin artırılmasını sağlar. Organik faz toplarken fazları karıştırmayın.

Azot gazı akışı altında tüpleri kapatın. Ekleme içindeki herhangi bir kabarcık ortadan kaldırmak ve doğru yönde sütun bağlayın. Herhangi bir tepenin kimliği LC-MS ile belirlenemiyorsa, MS-NMR molekülün yapısını saptamak için kullanılabilir.