Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Pre-formed Fibril Indüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelendirilmesi
16 Ağustos 2020
Burada, birincil fare dopamin nöronlarında nöronal α-sinüklein birikimini incelemek için ayrıntılı bir protokol sıyoruz. Nöronlarda fosforial α-sinüklein agregaları önceden oluşan α-sinüklein fibrilleri ile indüklenir. İmmünfloresan etiketli hücrelerin otomatik görüntülemesi ve tarafsız görüntü analizi, bu sağlam protokolü α-sinüklein birikimini engelleyen ilaçların orta-yüksek iş akışı taraması için uygun hale getirilmiştir.
Bu protokol, bu birikimi düzenleyebilecek mekanizmalar ve tedavilerin incelenmesi için primer dopamin nöronlarında alfa sinüklein birikiminin sağlam, tekrarlanabilir bir modelini sağlar. Önceden biçimlendirilmiş alfa-sinüklein fibriller progresif, yüksek tekrarlanabilir protein birikimini otomatik görüntüleme ve tarafsız görüntü analizi ile birlikte indükler, bu protokol alfa-sinüklein birikimiin inhibe kamyonnispeten hızlı, orta ve yüksek verimli tarama kolaylaştırır. Progresif alfa-sinüklein birikimi Parkinson hastalığı ve bazı nükleer cisimlerde nöronal fonksiyonu tehlikeye faktörlerden biri olabilir.
Bu birikimi engelleyen yeni moleküller nöro dejenerasyon için yeni tedaviler haline gelebilir. Bu protokolün, Dopamin nöronlarında alfa-sinüklein birikimini düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için standart ve güvenilir bir araç oluşturmak için önemli bir adım olduğuna inanıyoruz. Prosedürü gösteren Julia Konovalova, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.
Birincil embriyonik orta beyin hücre kültürünü kurmadan önce, dopamin 50 mikrolitre ekleyin, nöron orta, Poly-L-Ornithine kaplı her kuyuya 96 iyi plaka ve aynı anda her kuyunun alt çizik ise orta aspire etmek için 100 mikrolitrelik pipet ucu kullanın her kuyunun çevresinde kaplama kaldırmak için dairesel bir yönde. Bir Poli-L-Ornithine kaplı ada her kuyunun ortasında kalacaktır. Mikro adalar oluşturmak için her kaplamalı adanın ortasına orta 10 mikrolitre ekleyin.
Fare embriyonik gün 13.5 fare embriyolarından birincil embriyonik orta beyin kültürleri kurmak için. Hasat edilen orta beyin zeminlerinin hepsini aynı 1,5 mililitrelik tüpe toplayın ve numuneleri yıkama başına 500 mikrolitre kalsiyum ve magnezyumsuz HBSS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için HBSS'yi %0,5 tripsin ile değiştirin.
Kuluçka sonunda kısmen sindirilmiş doku fbs çözeltisi yeni hazırlanmış DNase I 500 mikrolitre ekleyin ve doku triturate için bir yangın cilalı ucu ile silikonlu cam pipet kullanın. Sadece küçük, zar zor görülebilen parçacıklar bu doku parçalarının mikro santrifüj tüpünün dibine yerleşmesine ve bu süpernatantı boş bir 15 mililitrelik konik polipropilen tüpe aktarmasını sağlar. FBS'de DNase I içeren tüpe bir mililitre HBSS ekleyin ve pipetleme ile birkaç kez karıştırın.
Bu çözeltinin bir mililitresini kalan doku parçacıklarına aktarın ve örnekleri tekrar triturate edin. Daha sonra kalan DNase I ve HBSS'deki FBS ile doku örneğini bir kez daha triturating sonra kalan doku parçaları aktarmadan supernatant tüpü ile sindirilmiş hücre süspansiyon çekin santrifüj ile toplanan hücreleri ve pelet rahatsız etmeden supernatant aspire. Yıkama başına ısıtılmış dopamin nöron orta iki mililitre hücreleri iki kez yıkayın.
Ve hücreleri üç kez 10'da, mikro santrifüj tüpte altı mikrolitre lik taze sıcak, orta konsantrasyondaki kuvvet hücrelerine geri uzaklaştırın. Daha sonra her daha önce hazırlanmış mikro adadan orta çıkarın ve her mikro adaya hücrelerin altı mikrolitre eklemek için 10 mikrolitre pipet kullanmadan önce nazik pipetleme ile hücreleri karıştırın. Tüm hücreler eklendiğinde, plakanın kenarlarındaki boş kuyuları 150 mikrolitre su veya PBS ile doldurun ve plakayı bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kuluçka sonunda her kuyuya taze dopamin nöron orta 100 mikrolitre ekleyin ve kuvöz plaka dönmek. Bir laminar akış kaputunda hücre kültürünün sekizinci gününde her deneysel kuyuya mililitre başına 100 mikrogram lık 3.75 mikrolitre ve her bir kontrol kuyusu için 3.75 mikrolitre PBS ekleyin. PFS ile çalışırken istenmeyen protein kontaminasyonu konusunda dikkatli olun ve daha sonra kaputu ve PF ile ilişkili tüm aletleri %1 SDS ve %70 etanol ile temizleyin.
İlgi işaretleri için boyama sonra uygun deneysel bitiş noktasında, 10 X hedefi ile donatılmış yüksek içerik plaka tarayıcı üzerine 96 kuyu kültür plakası yükleyin. Ayarları, oyun türü, üretici, boyut, kuyular arasındaki mesafe ve ortamın türü ve hacmi gibi 96 kuyu plakasının özelliklerine göre ayarlayın. Her mikro adadaki tüm hücreleri kapsayacak şekilde kuyuların görüntüleme alanını seçin ve DAPI ifadesine otomatik odaklanmayı ayarlamak için bir kuyu kullanın.
Kontrol kuyularında boyama yoğunluğuna göre her floresan kanal için edinme süresini kalibre edin ve önceden bilgili fibril tedavi kontrol kuyularında dopamin hücreleri fosfoserin 129 alfa sinüklein agregaları hücre soma içinde barındıran açıkça ayırt edilebilir böylece parametreleri ayarlamak fosfoserin 129 alfa synüklein pozitif ve negatif hücrelerin kesin bir nicelik sağlar. Daha sonra seçilen kuyuların tümünün her kuyu için tam olarak aynı parametreleri kullanarak tüm kanallarda aynı anda görüntülenin. Görüntülerin analizi için CellProfiler analistini açın ve V2_THpos seçin.
özellikleri dosya. Segmente edilmiş hücreleri fosfoserin 129 alfa sinüklein pozitif ve negatif hücrelere ayırmak için önce hücre sayısını 50 rasgele hücreye ayarlayın ve segmente edilmiş hücrelerin görüntülerini yüklemek için getir'i tıklatın. En az 30 hücreyi pencerenin altındaki ilgili kutuya sürükleyin.
50 max kuralları veya rasgele orman sınıflandırıcılar ile hızlı nazik artırma kullanın seçin ve tren tıklayın. 50 pozitif hücreye getirin ve tren sınıflayıcısına göre puanlanan örnek pozitif fosfoserin 129 alfa sinüklein hücreleri elde etmek için getir'i tıklatın veya 50 negatif hücreye getir'i ayarlayın ve tren sınıflayıcısına göre örnek negatif fosfoserin 129 alfa sinüklein hücreleri elde etmek için getir'e tıklayın. Sonuçlar tatmin edici olduğunda, her kuyudaki fosfoserin 129 alfa sinüklein pozitif ve negatif dopamin nöronlarının sayısını özetleyen bir sonuç tablosu oluşturmak için tüm skora tıklayın.
Kaplamadan birkaç gün sonra homojen bir şekilde yayılan bir kültür, kaplamadan önce oluşturulan mikro adadaki ışık mikroskobu ile gözlemlenebilir. Primer nöronlar kaplamalı plaka alt homojen yerleşmek ve nöronal projeksiyonlar kurmak. Bu resimde çapı 150 mikro metreden küçük bir hücre yığını gözlemlenebilir.
Kontrol tedavi edilmeyen birincil fare nin immünboy boyanması nöronal hücre belirteçleri ile 15 gün sonra plaka kuyularının ortasında ki mikro adalar içindeki hücrelerin sınırlı bir eki ortaya çıkarır. Tirozin hidroksilaz belirteci ile etiketlenmiş dopamin nöronlar immün otoplin, mikro ada çevresinde bir monolayer halinde yayılır. Alfa-sinüklein önceden bürünen fibril tedavi edilen kültürlerde pS129 alfa sinüklein pozitif inklütleri de görülebilir.
Yedi gün boyunca in vitro preformafibriller ile tedavi diğer deneysel gruplara göre tirozin hidroksilaz pozitif nöron sayılarında önemli bir azalmaya neden olmaz. Glial hücre hattı ile tedavi ancak, pS129 alfa-sinüklein pozitif dahil yüzdesini azaltır, tirozin hidroksilaz pozitif dopamin nöronlar barındıran. Mikro adalar oluşturmadan önce, Poly-L ornitin kaplı kuyuların sağlam bir şekilde yıkandığından emin olun.
Ayrıca yeni beyin kültürleri kaplama zaman taze medya kullandığınızdan emin olun. Bu yöntem, gen düzenleme ve farmakolojik inhibitörleri ile birleştirilip belirli genlerin ve düşünce dalgalarının nükleon agregasyonu üzerindeki etkilerini inceleyebilir. Alfa sinüklein birikimini engelleyen yeni molekülleri taramak için rutin olarak bu yöntemi kullanıyoruz.
TDN birikimi korumalı etkilerini göstermiştir ve şu anda birkaç küçük aday molekülleri analiz.
Genel Bakış
Bu çalışma, primer fare dopamin nöronlarında α-synuclein birikimini incelemek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Model, fosforile α-synuclein agregatlarının birikimini indüklemek için önceden oluşturulmuş α-synuclein fibrilleri kullanır. Otomatik görüntüleme ve tarafsız analiz yoluyla yürütülen bu sağlam protokol, α-synuclein birikimini engellemeyi amaçlayan potansiyel ilaç adaylarının orta ila yüksek kapasiteli taraması için oldukça uygundur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Parkinson Hastalığı Araştırmaları
Arka Plan
- α-synuclein birikimi, Parkinson hastalığı dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir.
- Fosforile α-synuclein agregatlarının nöronal fonksiyonu bozduğu bilinmektedir.
- α-synuclein birikimini hedefleyen mevcut tedaviler sınırlıdır.
- Bu protokol, α-synuclein birikiminin moleküler mekanizmaları üzerine yapılan araştırmaları standart hale getirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Dopamin nöronlarında α-sinüklein birikimini incelemek için tekrarlanabilir bir model geliştirmek.
- Bu birikimi inhibe eden ilaçların yüksek kapasiteli taramasını kolaylaştırmak.
- Nörodejenerasyona katkıda bulunan temel biyolojik mekanizmaları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 13.5 günlük fare embriyolarından elde edilen primer embriyonik orta beyin nöronlarının hücre kültürü.
- Önceden oluşturulmuş fibrillerin uygulanması yoluyla α-synuclein agregasyonunun indüksiyonu.
- Görüntü analizi için CellProfiler kullanılarak, α-synuclein agregatlarının miktar tayini için otomatik görüntüleme yönteminden yararlanılması.
- Kritik adımlar arasında hücre kültürü için mikro adacıkların hazırlanması, belirli günlerde fibril eklenmesi ve görüntü alım ayarları yer almaktadır.
Temel Sonuçlar
- Protokol, dopamin nöronlarında tutarlı α-synuclein birikimini etkili bir şekilde oluşturur.
- Otomatik görüntüleme, fosforile α-synuclein açısından pozitif ve negatif hücrelerin net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar.
- Sonuçlar, α-synuclein ile ilişkili nörodejenerasyonla mücadele etmek için yeni terapötik hedeflerin araştırılmasını desteklemektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, α-synuclein birikimini hedefleyen terapötik müdahalelerin araştırılması için değerli bir araç sunmaktadır.
- Bu protokol, nörodejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmektedir.
- Gelecekteki uygulamalar, Parkinson gibi hastalıklar için yeni tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, primer dopamin nöronlarında α-synuclein birikimini incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir model oluşturarak, Parkinson hastalığı araştırmalarındaki terapötik hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar. Önceden oluşturulmuş fibril indüksiyonunu, otomatik görüntüleme ve tarafsız analizle birleştiren bu yöntem, patolojik protein agregasyonunu inhibe eden bileşiklerin orta ila yüksek kapasiteli taranmasını destekler. Bu yaklaşım, nörodejenerasyon ilaç keşif programlarında hedef doğrulama ve öncü bileşik belirleme için öngörücü güven sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili nöronal sistemlerde α-sinüklein agregasyon mekanizmalarına yönelik terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Endojen fosforile α-sinükleini kantitatif bir okuma parametresi olarak kullanarak, fonksiyonel hedef doğrulaması için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.
- Öngörücü Değer: Primer nöronlarda Lewy cisimciği benzeri histopatolojiyi modelleyerek öngörücü güvenilirliği destekler ve modülasyon stratejilerinin portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik taramaları ve genetik manipülasyon çalışmaları için uygun, 96 kuyucuk formatında doğrulanmış biyolojik sistemler oluşturur.
- Kantitatif Çıktılar: Kuyucuk başına fosfo-α-synuclein-pozitif dopamin nöronlarının otomatik ve tarafsız ölçümünü sağlayarak analiz standardizasyonuna ve tekrarlanabilirliğine imkan tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Mikro-ada kültür tasarımı, deneysel sağlamlığı ve gücü artırarak platformun farklı ilaç keşif kampanyalarında yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Translasyonel biyobelirteç uyumuyla Parkinson hastalığı ile ilişkili α-synuclein patolojisini modellemek için primer embriyonik fare orta beyin dopamin nöronlarını kullanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: α-synuclein inklüzyonlarının oluşum ve eliminasyon mekanizmalarının çalışılmasını kolaylaştırarak risk ayarlı ilerleme kararlarına bilgi sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Tutarlı fenotipik okumalar aracılığıyla keşif aşamasındaki hedef modülasyonunu preklinik değerlendirmeye bağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, farmakolojik ve genetik pertürbasyon çalışmalarıyla olan uyumluluğu sayesinde, hedef hipotez testinden lider bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Dopamin nöronlarında α-synuclein birikiminin kontrollü indüksiyonunu ve miktarını belirlemeyi sağlayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmalarını destekler.
- Tarama: Orta ve yüksek kapasiteli formatlarda güvenilir bileşik değerlendirmesi için temel teşkil eden analiz hazırbulunuşluğu, tekrarlanabilirlik ve kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilir, istatistiksel okumalar üreten otomatik görüntüleme ve CellProfiler tabanlı analiz sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilişkili nöronal modeller ve biyobelirteç uyumlu son noktalar (pS129 α-synuclein) aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tek seferlik bir teknik yerine, α-synuclein modülasyon çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturarak projeler genelinde yatırım getirisini (ROI) maksimize eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenilirliği, α-synuclein patolojisindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması ve hedef risklerinin minimize edilmesi.
- Operasyonel Değer: Nöronal kültür ve görüntüleme iş akışlarının standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Geliştirme/durdurma (go/no-go) kararlarında iyileşme, tarama kampanyalarında sermaye verimliliği ve nörodejenerasyon programlarında geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Patolojik protein birikiminin kantitatif modülasyonuna dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Kontaminasyonu önlemek için primer nöronal hücre kültürü, steril teknik ve önceden oluşturulmuş fibrillerin kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Tarafsız nicelleştirme için yüksek içerikli görüntüleme altyapısına ve otomatik analiz araçlarına (örneğin, CellProfiler) bağımlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için kültür koşullarının, fibril hazırlığının ve görüntüleme parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Primer fare orta beyin dopamin nöronlarının ötesindeki diğer nöronal modellere veya genetik arka planlara genişletilirken adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Pratik sınırlamalar arasında, fenotip hassasiyetini korurken spesifik olmayan toksisiteyi önlemek için fibril konsantrasyonunun ve maruziyet süresinin dikkatle optimize edilmesi gerekliliği yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Primary Embryonic Midbrain Culture Plate Preparation
1:53
Primary E13.5 Embryonic Midbrain Culture Setup
4:32
Seeding with Pre-Formed Fibrils (PFFs) and Semi-automated Immunofluorescence Imaging
6:21
High-Content Image Analysis
7:42
Results: Representative Midbrain Culture Characterization and Analysis
9:13
Conclusion
