Name: Anevrizma Hiperlipidemi Fare Modelinde Yağ Kırmızı O-Boyalı Bütün Aort Lezyonlarının Görüntülenmesi ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Keşfedin, hiperlipidemik farelerde aterosklerotik lezyonları nitel ve nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, genetik faktörlerin ve yeni tedavilerin değerlendirilmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, kısmen, NIH hibesi P30AR070253 (P.-Y.C.) ve HL135582 (MS) kapsamında sağlanan Ortak Biyoloji Konsorsiyumu Microgrant tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan fareleri korudukları için R. Webber ve L. Coon'a minnettarız.

mT/mG (stok no. 007676) ve Apoe-/- (stok no. 002052) fareleri Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı. Myh11-CreERT2 fareleri Stefan Offermanns'ın bir hediyesiydi (Jackson Laboratuvarı'ndan stok numarası 019079 olarak temin edilebilir). Tgfbr2fl/fl fareleri Harold L. Moses'tan (Vanderbilt Üniversitesi) elde edildi. Tüm hayvan prosedürleri, Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak gerçekleştirildi.
1. Fareler
<ol><li>MYH11-CreERT2; mT / mGf / f üretin; Apoe-/- ve MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- daha önce tarif edildiği gibi fareler7. Mutant suşları C57BL/6J arka planına on nesilden fazla bir süredir yetiştirin. NOT: Myh11-CreERT2 Cre fare hattı, düz kas hücrelerinin vasküler homeostaz ve vasküler patolojideki rolünü incelemek için güçlü bir araç sağlar. Cre aleli Y kromozomuna yerleştirilir; Bu nedenle, dişi fareler bu yapıyı ifade etmez.</li>
</ol>2. Fare genotipleme, tamoksifen indüksiyonu ve yüksek kolesterol yüksek yağlı diyet beslenmesi
<ol><li>Fare kulağı DNA ve PCR analizini kullanarak fare genotiplemesi gerçekleştirin. Fare kulağı DNA'sı, üreticinin talimatlarına göre kan ve doku DNA izolasyon kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak izole edilmelidir. PCR primerleri Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
	<li>6 haftalık MYH11-CreERT2;mT/mGf/f'de 5 gün boyunca tamoksifen enjeksiyonu ile Cre-Lox rekombinasyonunu 1 mg/gün i.p.'de indükleyin; Apoe-/- ve MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- erkek fareler.</li>
	<li>8 haftalık erkek fareleri (tamoksifen tedavisinden 2 hafta sonra) 16 hafta boyunca HCHF diyetine (% 40 kcal yağı,% 1.25 kolesterol,% 0 kolik asit) yerleştirerek aterosklerozu indükleyin.</li>
</ol>3. Reaktifler ve diseksiyon aleti hazırlama
<ol><li>Stok Yağı Kırmızı O çözeltisi preparatı: 100 mL izopropil alkol içinde 1 g Yağ Kırmızı O çözün.</li>
	<li>Çalışma Yağı Kırmızı O çözeltisi hazırlama: 24 mL stok Yağ Kırmızı O çözeltisini 16 mL dH2O ile karıştırın. seyreltilmiş Yağ Kırmızı O'yu 0,45 μm steril şırınga filtreleri ile filtreleyin (çözelti sadece 1-2 saat boyunca iyidir).</li>
	<li>% 60 izopropil alkol preparatı: 60 mL izopropil alkolü 40 mL dH2O ile karıştırın.</li>
	<li>1x DPBS preparatında% 4 formaldehit: 30 mL 1x DPBS'de 10 mL% 16 formaldehit seyreltin.</li>
	<li>Tüm diseksiyon aletlerini %70 etanol ile temizleyin (Şekil 1).</li>
</ol>4. Ötenazi (Şekil 2A)
<ol><li>Ötanaziden önce farenin ağırlığını ölçün.</li>
	<li>İntraperitoneal ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile fareyi ötenazi yapın (her mililitre 10 mg / mL ketamin ve 2 mg / mL ksilazin içerir).</li>
	<li>Fareyi sırtüstü pozisyona getirin (göbek tarafı yukarı bakacak şekilde).</li>
</ol>5. Göğüs ve karın boşluğunun açılması ve kalp perfüzyonu (Şekil 2B)
<ol><li>10 mL 1x DPBS ile 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın. 25 G iğneli kapak. Şırınga kalbi yıkamak için kullanılacaktır.</li>
	<li>Cildi cımbızla tutun (Stil 5) ve karın tabanından boynun üstüne kadar ince makasla kesin.</li>
	<li>Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını açın.</li>
	<li>Sternumu cımbızla kaldırın (Stil 5) ve diyaframı kesin, ardından göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.</li>
	<li>Kalbin sağ atriyumunda küçük bir kesi yapın.</li>
	<li>Apikal sol ventrikül ponksiyonundan yavaşça 10 mL 1x DPBS enjekte ederek perfüze edin. İyice perfüze edildikten sonra, karaciğer ve böbrek açık kahverengi renkte olur.</li>
	<li>Malzemeyi emmek için dokunmamış bir sünger kullanarak yabancı kan ve sıvının göğüs boşluğunu temizleyin.</li>
</ol>6. Aort ve dalların izolasyonu (Şekil 2C)
<ol><li>Organları (yani akciğer, karaciğer, dalak ve gastrointestinal ve üreme organları) çıkarın ve kalp, böbrek ve aortu yerinde sağlam bırakırken cımbız (Stil 5) ve ince makas kullanarak klavikulayı kesin. NOT: Kalbi veya herhangi bir büyük kan damarını yırtmadığınızdan emin olun.</li>
	<li>Fareyi bir stereomikroskop altına yerleştirin.</li>
	<li>Brakiyosefalik arter, karotis arterler, subklavian arterler, renal arterler, ortak iliak arterler ve femoral arterleri içeren aort ve aort dallarını cımbız (Stil 4) ve yay makası kullanarak disseke eder. NOT: Aort dallarını parçalara ayırırken dehidrasyonu önlemek için aortu ıslak, dokunmamış bir süngerle örtün.</li>
	<li>Aort ve aort dallarının etrafındaki adventitial yağ ve bağ dokusunu cımbız (Stil 4) ve yay makası kullanarak dikkatlice disseke edin ve çıkarın. NOT: Anevrizma hiperlipidemi faresinde inflamasyon belirgin olduğundan, adventitiyi çıkarmak zordur. Aort ve aort dallarını yırtmamaya veya kesmemeye dikkat edin. Bu adım pratik ve sabır gerektirir.</li>
</ol>7. Kalp ve aortun sabitlenmesi (Şekil 2D,E)
<ol><li>DPBS'nin 1 katında 10 mL% 4 formaldehit içeren 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın. 25 G iğneli kapak. DİKKAT: Formaldehit tehlikelidir. Bu kimyasalla çalışmadan önce MSDS'yi okuyun. Eldiven ve güvenlik gözlüğü takın ve seyreltme çözümlerini bir duman başlığı içinde üretin. NOT: %4 formaldehit çözeltisi zamanla bozulur. Fiksasyon için taze yapılmış% 4 formaldehit kullanmak önemlidir.</li>
	<li>Vasküler ağacı apikal sol ventrikül ponksiyonu yoluyla yavaşça 10 mL% 4 formaldehit enjekte ederek sabitleyin. NOT: Formaldehit fiksasyonu, hücre kültürü, FACS analizi ve tek hücreli RNA dizileme analizi gibi çeşitli aşağı akış uygulamalarına müdahale eder. Aort bu uygulamalardan herhangi biri için kullanılacaksa bu adımı atlayın.</li>
	<li>Malzemeyi emmek için herhangi bir yabancı sıvının göğüs boşluğunu dokunmamış bir süngerle temizleyin.</li>
	<li>Kalbi cımbızla tutarak (Stil 4) ve mikro diseksiyon yay makası kullanarak kalbi aorttan ayırın. NOT: Bu adımdan sonra en face Oil Red O boyama işlemini gerçekleştirmek için aortun ex vivo yerine in situ olarak kesilmesi ve bölüm 8'e geçilmesi önerilir. Bu, en yüz aortunun düz durmasını kolaylaştırır.</li>
	<li>Aortu ve majörünü karotis arterin 1 mm üstünden femoral arterin sonuna kadar cımbız (Stil 4) ve yay makası kullanarak izole edin ve eksize edin.</li>
	<li>Kabı bir balmumu Petri kabına veya 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve aortu kaplayana kadar 1x DPBS ile doldurun. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>8. Yağ Kırmızı O boyama ve açılmamış bütün aortun görüntülenmesi (Şekil 3)
<ol><li>Minutien pimleri kullanarak kabı bir balmumu Petri kabına sabitleyin (Şekil 3A).</li>
	<li>Gemiyi 1x DPBS ile bir kez durulayın.</li>
	<li>Petri kabına 25 mL taze Yağ Kırmızı O çözeltisi dökün (Şekil 3B). NOT: (1) İzopropanol tehlikeli ve yanıcı bir sıvıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. (2) Yağ Kırmızı O çözeltisi kolayca çökelebilir. Çökelmiş parçacıklar sonraki boyamaya müdahale edebilir. Kullanmadan önce Yağ Kırmızısı O çözeltisini 0,45 μm'lik bir filtreden filtreleyerek çökeltiyi çıkarmak önemlidir. (3) Taze Yağ Kırmızı O çözeltisi hazırlamak ve kullanılmayan herhangi bir çözeltiyi atmak en iyisidir. (4) Kırmızı O Yağına ek olarak, Sudan IV, lipitlerin, trigliseritlerin ve lipoproteinlerin boyanması için kullanılan başka bir kimyasal bileşiktir. Bununla birlikte, Yağ Kırmızı O yavaş yavaş Sudan IV'ün yerini almıştır, çünkü Yağ Kırmızı O tarafından üretilen kırmızı renk daha yoğundur ve bu nedenle yağın görülmesini çok daha kolay hale getirebilir.</li>
	<li>Aortu oda sıcaklığında (RT) 60 dakika bekletin. Yağ Kırmızı O, lipit bakımından zengin plak kırmızısını boyar ve plak içermeyen diğer alanları soluk renkte bırakır.</li>
	<li>RT'de% 60 izopropanol ile 20 dakika boyunca bir kez yıkayın. NOT: Aşırı durulama plağı lekeleyebilir.</li>
	<li>İzopropanolü çıkarmak için aortu 3x dH2O ile 5 dakika durulayın.</li>
	<li>Bir stereomikroskop altında, cımbız (Stil 4) ve yay makası (Şekil 3C, D) kullanarak aort çevresindeki tüm perivasküler yağ dokusunu nazikçe temizleyin. NOT: Boyama sonrası aort ve dallarının etrafındaki tüm perivasküler yağ dokusunun temizlenmesi önemlidir, çünkü Yağ Kırmızısı O boyalı perivasküler yağ dokusu yanlış arka plan oluşturabilir ve plak morfometrisine ve plak alanı miktarına müdahale edebilir. Aort duvarının bir kısmını çıkarmadığınızdan emin olun. Balmumu kabını, temizlik sırasında lekeli aortu kaplayana kadar dH2O ile doldurun. Bu adım pratik ve sabır gerektirir.</li>
	<li>Gemiyi temiz, cam mikroskop slaytına aktarın.</li>
	<li>Işık mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak dijital mikrograflar edinin. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri, tercihen etiketli görüntü dosyası biçiminde (TIFF) kaydedin (Şekil 3E). NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Aortun kurumasını önlemek için, kabı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve aortu kaplayana kadar 1x DPBS ile doldurun. 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>9. En yüze aort montajı (Şekil 4, Şekil 5)
<ol><li>Gemiyi bir balmumu Petri kabına aktarın ve aortu kaplayana kadar 1x DPBS ile doldurun.</li>
	<li>Bifurkasyonlardan 1-2 mm sonra abdominal aorttaki karotis, aort arkının subklaviyen arterlerini ve iliak arterleri ayırın. Renal arterleri keser. (Şekil 4A)</li>
	<li>Aort preparatını iç eğrilik boyunca (Şekil 4B1) ve tek başına iliak arterleri (Şekil 4B2) mikro diseksiyonlu yay makası ile uzunlamasına keserek açın.</li>
	<li>Aort kemerinin üç dalını (yani manominat, sol ortak karotid, sol subklaviyen arter) daha büyük eğrilik boyunca, mikro diseksiyonlu yay makası ile iç eğriliğin taban seviyesine (x-mark) (Şekil 4B3-B8) kadar kesin.</li>
	<li>Aortu düz (lümen tarafı yukarı bakacak şekilde) minütien pimli bir balmumu kabına sabitleyin ve kurumasını önlemek için aortu kaplayana kadar 1x DPBS uygulayın (Şekil 4C). NOT: (1) Yuvarlanmış aortu düz yapmak ve gerilmeden yüzüne sabitlemek önemlidir. Bu adım aterosklerozun ciddiyetine bağlı olarak birkaç gün sürecektir. (2) Apoe-/- veya Ldlr-/- hayvanlarından gelen aortlar için, aort düzlüğünün 24 saat boyunca sabitlenmesi önerilir. (3) Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	<li>Cam mikroskop slaytlarını %70 etanol ve hassas görev silecekleri ile temizleyin (Şekil 5A).</li>
	<li>Aortu temiz bir cam mikroskop slaydına aktarın ve başka bir temiz cam mikroskop slaydına 15 damla optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği koyun (Şekil 5B).</li>
	<li>OCT bileşiği olan cam mikroskop slaytını aort üzerine dikkatlice yerleştirin ve slaytta hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin (Şekil 5C).</li>
	<li>Slaytları örnek adlarla etiketleyin (Şekil 5D). NOT: Monte edilmiş en yüz aort kızakları, nem odasında 4 °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir.</li>
</ol>10. En face aortun görüntülenmesi ve lezyon miktarının belirlenmesi (Şekil 6)
<ol><li>Işık mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak dijital mikrograflar edinin. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri, tercihen etiketli görüntü dosyası biçiminde (TIFF) kaydedin (Şekil 6A).</li>
	<li>En yüzün boyanmış tüm aortunun görüntülerini ImageJ yazılımı ile donatılmış bir bilgisayara aktarın.</li>
	<li>ImageJ'de, "Serbest seçim" aracını seçin ve "Alt" tuşuna (Windows PC için) veya "Shift" tuşuna (Mac için) basarken tüm Yağ Kırmızısı O lekeli plağı manuel olarak (yoğun kırmızı noktalar) daire içine alın. Ardından, sonuç penceresinde lezyon alanlarını görüntülemek için "Analiz Et" menüsünde "Ölç" ü tıklayın (Şekil 6B solda). NOT: Aterosklerotik lezyonların nicelleştirilmesinde birkaç tuzak vardır: (1) adım 8.7'den itibaren aort bağlı kalan herhangi bir küçük lekeli adventitial yağ parçası yanlış arka plan verebilir ve plak nicelemesine müdahale edebilir; (2) aort duvarının bir kısmının çıkarılması veya aortun 6.4 ve 8.7. adımlardan zarar görmesi plak miktarının ölçülmesine müdahale edebilir; (3) montajdan sonra aortta oluşan kabarcıklar ve kıvrımlar (adım 9.8) plak miktarına müdahale edebilir; ve (4) aterosklerotik plak bir 3D fenomendir ve 2D düzlemde yapılan ölçümler plağın gerçek boyutunu yansıtmayabilir. En yüz aort plak alanının analizine ek olarak, aort kökündeki, brakiyosefalik arterdeki, yükselen aorttaki ve abdominal aorttaki plak boyutunun ayrı ayrı analiz edilmesi önerilir8.</li>
	<li>Aortun dış kenarlık çizgisini daire içine alın ve sonuç penceresinde aort alanını görüntülemek için "Analiz" menüsünde "Ölç" ü tıklayın (Şekil 6B sağda).</li>
	<li>Tüm ölçümleri bir Excel dosyasına aktarın.</li>
	<li>Plak alanının toplam aort alanından oranını hesaplayın ve değeri toplam Yağ Kırmızı O yüzey alanının yüzdesi olarak normalleştirin.</li>
	<li>8–10 Apoe-/- ve 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe farelerinde plak alanı oranını hesaplayın. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun (Şekil 6C).</li>
	<li>Plak alanı verilerinin başka bir fare grubuna kıyasla oranının istatistiksel analizi için eşleştirilmemiş bir Öğrenci t-testi gerçekleştirin. Ortalama değerlerdeki farklılıkları p < 0.05'te anlamlı olarak düşünün.</li>
</ol>

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71, 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258, 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).</li>
<li>Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+reprogramming+in+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms.</a> Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).</li>
<li>Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+Red+O+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining+for+Quantification+of+Atherosclerosis+Burden+in+Mouse+Aorta+and+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li>
<li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Apolipoprotein E (Apoe) ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan fareler, aterosklerozun gelişimini ve tedavisini incelemek için yararlıdır. Araştırmacılar, genetik ve terapötik manipülasyonların, tüm aortun Yağ Kırmızı O boyamasını kullanarak aterosklerozla ilişkili hastalıkların başlaması, ilerlemesi ve regresyonu üzerindeki etkisini değerlendirebilirler9. Aort Yağı Kırmızı O boyama ve lezyon miktarının belirlenmesi ateroskleroz araştırmalarında altın sta...

ABD'de önde gelen bir mortalite nedeni olan koroner arter hastalığına genellikle arteriyel duvarların içinde plak birikmesine yol açan bir süreç olan ateroskleroz neden olur1. Hiperlipidemiye eğilimli Apee ve Ldlr eksikliği olan fareler, ateroskleroz ve komplikasyonlarının araştırılmasında ve tedavilerin geliştirilmesinde merkezidir2,3,4,5. Aterosklerotik lezyonların en face aorttan nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde genetik manipülasyonun etkisini değerlendirmek için önemli bir son nokta analizidir. Ayrıca, aterosklerotik hastalığın başlamasını, ilerlemesini ve regresyonunu etkilemek için tasarlanmış yeni tedavilerin incelenmesine yardımcı olur. Aterosklerotik lezyonlar aort ve dallarının herhangi bir yerinde oluşabilir (yani, göğüsteki brakiyosefalik, karotis ve subklaviyen arterlerin yanı sıra diyaframın altındaki böbrek, yaygın iliak ve femoral arterler)6. Ateroskleroz yükünün kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi ve uygun tedavi, farklı yerlerdeki hastalık yükünün değerlendirilmesini gerektirir ve bu da genellikle göz ardı edilen bir zorluktur.
Bu protokol, açılmamış bir bütün aort ile başlayıp yüz hazırlığına kadar ilerleyen aterosklerotik lezyonların kapsamlı bir analizinin tek bir farede nasıl yapılacağını açıklar. Açılmamış bütün aort Yağı Kırmızı O boyaması, tüm aort ve dallarındaki lipit yüklü plakların hızlı, kalitatif bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, en yüz hazırlığı fare aortundaki aterosklerotik lezyon dağılımının nicel bir değerlendirmesini sağlar.
Teknik, Apoe-/- hiperlipidemik arka plan üzerinde düz kas hücresine özgü TGFβR2 delesyonuna sahip 8 haftalık fareleri kullanır (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; bundan böyle TGFβR2iSMC-Apoe fareleri olarak anılacaktır) ve çöp arkadaşı Apoe-/- kontrolleri (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; bundan böyle Apoe-/- fareler olarak anılacaktır). Hayvanlar, çalışma materyalleri olarak yüksek kolesterollü yüksek yağlı bir diyette (HCHFD) 16 hafta boyunca tutulur7. Çalışma sonlandırma sırasında, açılmamış bütün aortlar, lipid yüklü plakların kalitatif değerlendirmesi için Yağ Kırmızı O ile boyanır ve görüntülenir (tüm ana dallar dahil). Aortlar en yüz hazırlığı ile kesilir ve tüm aterosklerotik lezyonlar görüntülenir ve ölçülür. Bu protokol, Apoe-/- veya Ldlr-/- hiperlipidemi fare modellerinde aterosklerotik lezyon gelişimini incelemek için kullanılabilir ve genel aortla ilişkili vasküler biyoloji uygulamalarına genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tüpü</td><td>DENVILLE</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>%16 Formaldehit</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>VWR</td><td>RC2546.70-5</td><td>Diseksiyon aletlerini temizlemek için</td></tr><tr><td>Siyah diseksiyon mumu</td><td>CR Scientific</td><td>C3541</td><td></td></tr><tr><td>Mısır yağı</td><td>Sigma</td><td></td><td>Tamoksifen</td>DNeasy Kan için C8267</tr><tr><td>Çözücü & Doku kiti</td><td>QIAGEN</td><td>69506</td><td>Fare kulağından DNA'yı izole etmek için</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat tamponlu salin (1X DPBS), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14059-11</td><td>Fare derisini kesmek ve göğüs kafesini açmak için</td></tr><tr><td>Fisherbrand Ekonomi Düz Cam Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek kolesterol yüksek yağlı diyet</td><td>Araştırma Diyetleri</td><td>D12108</td><td>Ateroskleroz Görüntülemeyi indüklemek için</td></tr><tr><td> yazılım</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>Resim J</td><td>Aort lezyonu miktar tayini</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>VWR</td><td>JT9079-5</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Cam mikroskop slaytlarını temizlemek için</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Mikro Diseksiyon Yaylı Makas</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5602</td><td>Kalp ile aortu ayırmak ve aort ve aort dallarını</td></tr> <tr><td>kesip açmak içinMikroskop kontrol yazılımı</td><td>Olympus</td><td>DP Kontrol Cihazı</td><td>Aort görüntüleme için</td></tr><tr><td>Minutien pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>İğne-25G</td><td>BD</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Dokumasız Sünger</td><td>McKesson</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızısı O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td>Ateroskleroz lezyonlarını boyamak için</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc Steril Şırınga Süper Membranlı Filtreler</td><td>VWR</td><td>28143-312</td> Çalışan Yağ Kırmızı <td>O çözeltisini filtrelemek için</td></tr><tr><td>Bahar Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15021-15</td><td>Aortu incelemek ve temizlemek için</td></tr><tr><td>İstatistiksel yazılım</td><td>GraphPad</td><td>Prism 8</td><td>Statik analiz</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td>Aort diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Aort görüntüleme için</td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>Cre-loxP rekombinasyonunu indüklemek için</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Bileşiği, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız Stil 4 Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>0302-4-PO</td><td>Fare derisini kesmek ve göğüs kafesini açmak için</td></tr><tr><td>Cımbız Stil 5</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>0302-5-PO</td><td>Parçalamak ve temizlemek için aort damarı</td></tr></tbody></table>

anevrizma hiperlipidemi fare modelinde yağ kırmızı o-boyalı bütün aort lezyonlarının görüntülenmesi ve analizi

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe) veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan hiperlipidemik fareler, ateroskleroz araştırması için en sık kullanılan iki modeldir. Çeşitli genetik faktörlerin ve farklı hücre tiplerinin aterosklerotik lezyon oluşumu üzerindeki etkisini incelemek ve yeni tedavilerin gelişimini test etmek için kullanılırlar. Tüm aortun izolasyonu, eksizyonu ve Yağ Kırmızı O boyalı aterosklerotik lezyonların miktarının belirlenmesi aterosklerotik yükü değerlendirmek için kullanılan temel morfometrik yöntemlerdir . Bu protokolün amacı, Oil Red O ile fare aortlarındaki aterosklerotik lezyonları diseke etmek, perfüzyon-fix, izole etmek, boyamak, görüntülemek ve analiz etmek için optimize edilmiş, adım adım cerrahi bir yöntemi tanımlamaktır. Aterosklerotik lezyonlar tüm aort ağacının herhangi bir yerinde oluşabildiğinden, tüm bu aort Yağı Kırmızı O boyama yöntemi, tüm aorttaki lipit yüklü plakları ve tüm dalları tek bir farede değerlendirme avantajına sahiptir. Yağ Kırmızı O boyamasına ek olarak, taze izole edilmiş bütün aortlar çeşitli in vitro ve in vivo deneyler ve hücre izolasyonları için kullanılabilir.

Bu protokolde, TGFβR2iSMC-Apoe farelerdeki aterosklerotik lezyonlar HCHF diyetinde 4 ay sonra analiz edildi7. Yaygın ateroskleroza ek olarak, bu fareler daha önce bildirildiği gibi hem torasik hem de abdominal aort anevrizmaları geliştirdi. Apoe-/- farelerle karşılaştırıldığında, TGFβR2iSMC-Apoe farelerinin aort duvarları ciddi ateroskleroz göstererek lezyonların diseksiyonunu zorlaştırdı (Şekil 2C, D, E). Ek olarak, a...

Bu protokol, farelerde aterosklerotik yükü analiz etmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü farklı hayvanlardaki aterosklerotik lezyonların bolluğunu, yerini ve boyutunu karşılaştırmak için kullanabilirler.

Anevrizma Hiperlipidemi Fare Modelinde Yağ Kırmızı O-Boyalı Bütün Aort Lezyonlarının Görüntülenmesi ve Analizi

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

ApoE ve diğer hiperlipidemik fare tiplerinde aterosklerotik lezyonların miktarının belirlenmesi, çeşitli genetik faktörlerin ve yeni tedavilerin değerlendirilmesinde anahtardır. Protokolümüz, aterosklerotik yükün tek bir farede kalitatif ve kantitatif olarak analizi için adım adım talimatlar sağlar. Aterosklerozu indükledikten 16 hafta sonra, kalbi perfüze etmeden önce, 10 mililitre DPBS ile 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve 25 gauge iğne takın.Deneysel farenin karın derisini cımbızla kaldırın ve cildi karın tabanından boynun üstüne kadar kesmek için ince makas kullanın. Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını açın ve diyaframa erişmek için sternumu kaldırmak için cımbızı kullanın. Diyaframı kesin ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.Daha sonra, kalbin sağ atriyumunda küçük bir kesi yapın ve DPBS'nin tüm hacmini apikal sol ventrikül ponksiyonuna yavaşça enjekte edin. Karaciğer ve böbrek açık kahverengi renge dönecektir. Tüm salin perfüze edildiğinde, herhangi bir yabancı kan ve sıvının göğüs boşluğunu temizlemek için dokunmamış bir sünger kullanın.Göğüs boşluğu silindikten sonra, deneysel olmayan organları çıkarın ve klavikulayı cımbız ve ince makasla

imaging-analysis-oil-red-o-stained-whole-aorta-lesions-an-aneurysm

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kardiyovasküler hastalığın hayvan modellerinden arteriyel lezyonların ex vivo analizi klasik olarak histolojik ve immünohistokimyasal tekniklere dayanır. Bunlar 3 boyutlu lezyonlarda 2 boyutlu ölçümler sağlar. Bu el yazması, optik projeksiyon tomografisi kullanılarak 3 boyutlu kantitatif analiz için arteriyel lezyonların oluşumunu açıklamaktadır.

Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizle birlikte aort sinüsünün ve çıkan aortun hassas kesitini kullanarak fare modellerinde aterosklerotik lezyonları ölçmek ve karakterize etmek için prosedürleri açıklıyoruz.

Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

Bu video kemirgen arterlerde intimal plak iki kalkınma modelleri gösterir ve miyointimal hiperplazi ve ateroskleroz farklılıkları vurgulamaktadır.

Farelerde Ateroskleroz Karşı miyointimal hiperplazide uyaran: İki Geçerli Modellerinin An Introduction

Hayvan modelleri kronik inflamasyon gelişimine katkıda konak ve patojen spesifik mekanizmaları tanımlarken paha biçilmez araçlardır olduğu kanıtlanmıştır. Burada, lokal ve sistemik inflamasyon bölgelerinde ilerlemesini değerlendirmek için insan patojeni Porphyromonas gingivalis ve detay metodolojileri ile ağızdan enfeksiyondan bir fare modeli tarif eder.

Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

ApoE- / - fareler aldosteron sürekli bir sürüm boyunca aterojenik bir diyet ile beslenen aort kökünde ateroskleroz ikna etmek için bir protokol açıklar. Plak kompozisyon karakterize yöntemleri de açıklanmaktadır.

Apolipoprotein E-eksik farelerde Mineralocorticoid reseptörlerinin etkinleştirmesi üzerinden aterosklerotik plaklar indüksiyon

Biz hayvan diseksiyon, doku gömme, kesit, Boyama, ve brachiocephalic arterler analizini sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları hücresel bileşimi karakterize etmek için standart bir protokol öneriyoruz atheroprone düz kas hücre soy izleme fare.

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Ateroskleroz murine modelleri, moleküler düzeyde patojenik yolları araştırmak için yararlı araçlardır, ancak lezyon gelişimi için standartlaştırılmış bir ölçmek gerektirir. Bu protokol, aort kökü, Aort kemer ve brachioksefalik arter dahil olmak üzere ana arter damarlarında lezyon boyutunu belirlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır.

Fareler içinde ateroskleroz ölçümü

Burada, murin aortunu üç boyutlu (3D) olarak görüntülemek için optimize edilmiş doku temizleme protokolleri sunuyoruz. Aterosklerozda adventiti ve aterosklerozda periferik sinir sisteminin aterosklerotik plaklarla anatomik yakınlığını tanımlamak amacıyla immün boyama, optik temizleme ve görüntüleme için son teknoloji prosedürleri betimliyoruz.

Aterosklerozda Aort Dokularının Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, aterosklerozun mekanizmaları ve ilerlemesi hakkında daha derinlemesine araştırmaları kolaylaştırmak için aterosklerotik plakların kantitatif analizi için kapsamlı bir metodoloji sağlar.

Atrosklerotik Fare Modelinde Aort Ark ve Kök Lezyonlarının İzolasyonu ve Analizi

Kemik metastazı deneysel bir fare modeli lusiferaz meme tümör hücreleri ifade intrakardiyak teslim edildikten sonra kurulmuştur. Biyoparlaklık ve mikro BT görüntüleme ile tümör gelişimi ve osteolitik lezyon sonuçlandı boyuna takip edildi.

Biyoparlaklık ve Micro CT Görüntüleme Tümör Metastazlari ve osteolitik Lezyonlar İzleme

Keşfedin, hiperlipidemik farelerde aterosklerotik lezyonları nitel ve nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, genetik faktörlerin ve yeni tedavilerin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Anevrizma Hiperlipidemi Fare Modelinde Yağ Kırmızı O-Boyalı Bütün Aort Lezyonlarının Görüntülenmesi ve Analizi

Daha fazla video keşfet