Name: Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class Iin Stabilitesi ve Yapısı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Öğrenin, heterologöz β2-mikroglobulin ile yarasa MHC sınıf I stabilitesini ve yapısını incelemek için E. coli dönüşümü ve kristalizasyon tekniklerini kullanarak hibrit komplekslerin işlevselliğini değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Nan-jing Üniversitesi farmasötik biyoteknoloji devlet anahtar laboratuvarının açık fonu tarafından desteklendi (Grant no. KF-GN-201905), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81971501 hibeleri). William J. Liu, NSFC'nin Mükemmel Genç Bilim Adamı Programı (81822040) ve Pekin Yeni Yıldız Bilim ve Teknoloji Planı (Z181100006218080) tarafından desteklenmektedir.

1. İfade yapılarının hazırlanması
<ol><li>MHC sınıfı I genlerinin dizilerini (tahmin edilen genler dahil) NCBI veritabanından yarasalardan alın.</li>
	<li>İmmüno Polimorfizm Veritabanı (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) ve UniProt veritabanından (www.uniprot.org) daha yüksek memeli MHC I ağır zincir dizileri alın.</li>
	<li>Çözünür MHC kompleksleri elde etmek için, sitozolizik ve transmembran bölgelerini çıkarmak için dizileri mutasyona uğratın.</li>
	<li>Ptal-N*01:01 yarasasının ectodomainlerini kodlayan genleri klonla (GenBank no. KT98792919) (kalıntılar 1–277) ve yarasa β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (kalıntılar 1–98) pET-28a vektörlerine (Novagen, Pekin, Çin), sırasıyla.</li>
	<li>Modifiye edilmiş bir pET-28a vektörün NcoI ve EcoR1 siteleri arasına optimize edilmiş (Escherichia coliiçin) diziler eklendi.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi insan β2m ifade plazmidleri inşa edin20.</li>
</ol>2. Peptit sentezi
<ol><li>Peptit tahmini<ol>
<li>Daha önce açıklandığı gibi10, Ptal-N* 01:01'e bağlanabilecek peptitleri taramak için, yarasa ile ilişkili virüsler hendra virüsünün (HeV) protein gövdelerini kullanarak aday peptitleri tahmin edin. Çevrimiçi sunucudan yapısal modele dayalı yüksek benzeşimli peptitler elde etmek için, NetMHCpan 4.0 sunucusu (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 ve Rosetta FlexPepDock22 seçilen peptit fraksiyonunda potansiyel bağlamayı öngördü. Buna ek olarak, BIMAS dahil olmak üzere diğer yazılım ve veritabanları, Immune Epitope Veritabanı (IEDB), NetCTL 1.2 ve SYFPEITHI de kullanılabilir, bunların hepsi peptit-MHC sınıfı I bağlayıcı benzeşimin tahminini, antijen işleme (TAP) taşıma verimliliği ile ilişkili taşıyıcıyı, proteazomal C-terminal bölünmesini ve peptit-HLA sınıfı I moleküllerinin okumalarında yarım kez ayrışma süresini bütünleştirir.</li>
		<li>Yüksek bağlayıcı peptitleri tahmin etmek için hem NetMHCpan hem de Rosetta FlexPepDock sunucusunu kullanın. NOT: Ne yazık ki, üretilen tahminler deneysel verilerle eşleşmedi. Bu, mevcut MHC bağlayıcı peptit tahminlerinin, farklı bir peptit bağlama şekline sahip olabilecek yarasalar gibi insan olmayan ve fare olmayan memeliler için uygun olmadığını gösterebilir. Bu nedenle, yüksek benzeşimli peptitler elde etmek için kapsamlı analiz için çeşitli tahmin yazılımlarını ve deneysel sonuçları birleştirmemiz gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peptitlerin hazırlanması ve korunması<ol>
<li>Özel peptitler oluşturmak yerine, özel hizmet sağlayıcılar kullanın. Daha yüksek bağlayıcı puana sahip peptit tahmin araçlarını izleyerek ticari olarak tüm peptitleri satın alın. Peptit saflığı HPLC ve kütle spektrometresi ile %95 olarak belirlendi.</li>
		<li>Satın alınan tüm peptitleri −80 °C'de dondurularak kurutulmuş toz olarak saklayın ve kullanmadan önce dimetil süloksit (DMSO) içinde çözün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. İçerme organlarının saflaştırılması
<ol><li>E. coli dönüşümü
	<ol>
<li>Yarasa MHC I Ptal-N * 01:01 H zinciri içeren 10 ng plazmid veya2m'β insan β veya yarasayı100μL BL21 (DE3) E. coli'yedönüştürün. 30 dakika buzda yıkan.</li>
		<li>90 s için 42 °C'de ısı şoku, ardından 2 dakika buzda yıkanma.</li>
		<li>3.1.2 adımına 800 μL lysojeny suyu ekleyin (LB: maya özü, tripon ve NaCl; Malzeme Tablosunabakın) ve 20 dakika boyunca 37 °C'de sallanan bir platformda dakikada 200 dönüşte (rpm) sallayın.</li>
		<li>Önceki yapılarla aynı olan ilgili antibiyotik direncini (ampisilin: 100 ng/mL) içeren plakaya 100 μL bakteri süspansiyonu uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşı kültürleri<ol>
<li>Yakın zamanda dönüştürülmüş tek bir bakteri klonunu antibiyotik ortamı (ampisilin: 100 ng/mL) ile 3 mL LB'ye ve 37 °C'de kültüre çevirirken, bakterileri aktive etmek için sallanan bir platformda 200 rpm'de titreyin. Kültürler, ertesi sabah indüksiyona hazır olmak için gece geç saatlerde aşılanabilir.</li>
		<li>Bir gece önceden, aktif bakteri stoğunun 500 μL'lik kısmını antibiyotik ortamı (ampisilin: 100 ng/mL) ile 50 mL LB'ye aktarın ve 200 rpm'de titreyerek 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Bir sonraki aşıyı hazırlarken kolaylık sağlamak için, kalan aktif bakteri stoğunu bir sonraki hazırlık gerekinceye kadar −80 °C'de 1 mL aliquots (500 μL%40 gliserol ile 500 μL kültür) içinde dondurun.</li>
		<li>Büyük miktarlarda rekombinant protein üretmek için bakteriyel preparatı antibiyotik ortamı (ampisilin: 100 ng/mL) ile 2 L LB'ye 1:100 oranında aktarın, 200 rpm'de titrerken 37 °C'de kuluçkaya yatırın. 600 nm'de 0.6 absorbansına kadar kültür elde edilir. Protein ekspresyonunun indüksiyonu için şişeye 1 mM izopropil-1-tiyo-β-D-galaktopyranoside (IPTG) (farklı MHC'ler için IPTG konsantrasyonunu, çoğunlukla 0,1 mM-1 mM arasında değişir) ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hasat bakterileri<ol>
<li>Bakterileri 4 °C'de 20 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüj şişelerine ve santrifüje aktarın. Bundan sonra tüm adımlar 4 °C'de yapılmalıdır.</li>
		<li>Bakterileri 60 mL fosfat tampon salininde (PBS) yeniden canlandırın ve ifade edilen rekombinant proteini ultrasonik hücre bozucu ile serbest kalındırın. NOT: Genel olarak, bu makinede belirlediğimiz program ultrasonik 6S, aralık 12S, 300 W, 99 kez).</li>
	</ol></li>
	<li>İçerme organlarının saflaştırılması<ol>
<li>Sonicated bakteri süspansiyonu 30 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti uygun bir yıkama tamponu hacminde yeniden biriktirin (%0,5 Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>10-20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj. Süpernatantı atın ve inklüzyon gövdelerini resüspensyon tamponunda (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) yeniden biriktirin. dahil etme gövdelerinin saflığını test etmek için SDS-PAGE için 20 μL'lik bir numuneyi (resüspenzyon tamponundaki inklüzyon gövdeleri) çıkarın.</li>
		<li>Kalan hazırlığı 10-20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın. İçerme gövdelerini içeren peleni tartın ve 30 mg/mL'lik son konsantrasyona çözünme tamponu (6 M Gua-HCl, %10 gliserin, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) ekleyin. İçerme gövdeleri çözünme tamponunda çözünene kadar 4 °C'de manyetik bir karıştırıcı kullanarak yavaşça karıştırın.</li>
		<li>Santrifüj 10-20 dk için 12.000 x g. Çökeltmeyi atın. İçerme gövdelerini −20 °C veya −80 °C'de saklayın. NOT: İnklüzyon cisimlerinin saflaştırılmasına devam etmeden önce, rekombinant proteinin indüksiyonunun ve ekspresyonunun başarılı olduğunu onaylayın. Her kültürden (IPTG indüksiyonundan önce ve sonra alınan) örnekleri bir protein jeli üzerinde çalıştırın; %15 SDS-PAGE (SDS-PAGE konsantre sakız: H2O, %30 akrilamid, 1 M Tris-HCl pH 6.8, %10 SDS, %10 APS ve TEMED; SDS-PAGE ayırma jeli: H2O, %30 akrilamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, %10 SDS, %10 APS ve TEMED; Bkz. Malzeme Tablosu ) β için2m, H zinciri için% 10 SDS-PAGE.</li>
	</ol></li>
</ol>4. MHC kompleksinin yeniden katası
NOT: Yeniden katlanan inklüzyon cisimlerinin verimliliği, elde edilen proteinin verimini etkileyecektir. Katlama polimerizasyon ile rekabet eder, bu nedenle genellikle düşük protein konsantrasyonlarında yeniden katlamanın en başarılı yöntem olduğu kabul edilir. Bu makalede, inklüzyon organları konsantrasyonu 30 mg / mL'dir.
<ol><li>Yeniden katlama arabelleği hazırlayın.<ol>
<li>Proteine bağlı olarak yeniden katlama tamponunun bileşimini değiştirin. Örneğin, pH, iyonik mukavemet, redoks koşulları ve ligandların varlığı yeniden katlama sonuçlarını etkileyecektir. En yaygın olanı, 50-500 mM'lik NaCl konsantrasyonuna sahip nötr bir pH'da Tris veya HEPES tabanlı tamponlar kullanmaktır, ancak bu aynı zamanda hedef proteine de bağlıdır. Bu makalede kullanılan yeniden katlama arabelleği formülü aşağıdadır.</li>
		<li>Katlanır tamponu 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-2Na ile hazırlayın.</li>
		<li>Tamponu 250-300 mL'lik bir şişede 4 °C'ye soğutun ve ardından 5 mM azaltılmış glutatyon (GSH) ve 0,5 mM oksitlenmiş glutatyon (GSSG) ekleyin. İçerme gövdelerini ve peptitleri eklemeden önce 4 °C'de manyetik bir karıştırıcı kullanarak 10-20 dakika daha yavaşça karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MHC H zincirinin enjeksiyonu ve seyreltilmesi veβ 2m NOT: Yeniden katlamanın yapıldığı sıcaklık değişebilir, ancak genellikle toplamayı en aza indirmek için 4 °C en iyisidir. Proteinleri yeniden katlamak için seyreltme kullanıyoruz.<ol>
<li>1 mL şırıngadan bir iğne kullanarak, sırasıyla iki yeniden katlama tamponuna (her biri 1 litre)1mL hβ 2 m inklüzyon cisimleri veya bβ2m inklüzyon cisimleri enjekte edin. Hızlı ve verimli seyreltme elde etmek için kuvvetlice dönen karıştırma çubuğunun yanına enjekte edin. β2m nispeten kolay yeniden katlar ve H zincirinin yokluğunda bile sabit kalır.</li>
		<li>β2m yeniden katlama çözeltisinde çözüldükten sonra, DMSO'daki peptitleri (5 mg / mL) çözün ve yeniden katlama çözeltisine hızlı bir şekilde 200 μL enjekte edin. H zincirini eklemeden önce 10-20 dakika yavaşça karıştırın.</li>
		<li>H zincirini β2m boyunca yukarıda açıklanan prosedürle enjekte edin. H zinciri çok dengesizdir; bu nedenle, enjeksiyon sırası oldukça önemlidir. Sırasıyla hβ 2 m veya bβ 2 m ile iki farklı yeniden katlama tamponuna (her biri 1 litre)3mL H zincir inklüzyoncisimlerienjekte edin. Tüm protein miktarının tek uygulaması yerine küçük aliquotların ardışık enjeksiyonu, yeniden katlanmış MHC'nin verimini arttırır. Yeniden katlamanın 8-10 saat boyunca 4 °C'de devam etmesine izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yeniden katlanmış protein konsantrasyonu<ol>
<li>Yeniden katlama proteinlerinin konsantrasyonu için 10 kDa MMCO membranlı basınçlı bir odada ultrafiltrasyon kullanın. Bu yöntem uygundur ve arabellek değişimi ile birleştirilebilir. Odaya değişim tamponu (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) ekleyin ve 30-50 mL'lik son hacme konsantre edin.</li>
		<li>Yeniden katlama çözeltisini bir santrifüj tüpüne aktarın, çökeltmeleri gidermek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün.</li>
		<li>Süpernatant'ı dikkatlice aktarın ve ~1 mL'lik son hacme daha fazla konsantre olun.</li>
		<li>10-20 dakika boyunca 12.000 xg'da santrifüj. Süpernatantı steril bir tüpe aktarın ve proteinleri 10/300 GL boyut dışlama sütunu kullanarak arındırın.</li>
		<li>Örnekleri zirvede toplayın ve SDS-PAGE (%15 poliakrilamid jel) kullanarak analiz edin.</li>
		<li>MHC karmaşık tepe noktasını toplayın ve 15 mg/ mL'lik son konsantrasyona konsantre olun.</li>
		<li>Kristalizasyon için kompleksi 7,5 mg/mL ve 15 mg/mL'ye seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kristalizasyon, veri toplama ve işleme
<ol><li>Oturma damlası buharı difüzyon tekniğini kullanarak karmaşık MHC ve peptidin kristalizasyonunu gerçekleştirin.</li>
	<li>Ptal-N*01:01/peptit komplekslerini ticari kristal kitlerle (örneğin, Kristal Ekran kiti I/II, Dizin Ekran kiti, PEGIon kiti I/II ve PEGRx kiti) tarayın.</li>
	<li>Elde edilen çözeltiyi kapatın ve 4 veya 18 °C'de 100 μL rezervuar çözeltisine karşı dengeleyin.</li>
	<li>Kültürdeki kristal büyümesini 3 gün, 1 hafta, 2 hafta, 1 ay, 3 ay ve 6 ay boyunca gözlemleyin. Kristal plakadaki her damlanın kristalleri olup olmadığını görmek için bir mikroskop kullanın. NOT: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) kristaller 0.2 M NaCl, 0.1 M Bis-Tris (pH 5.5) ve %25 (w/v) polietilen glikol 3.350 mg/mL konsantrasyonda gözlendi. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) kristaller 0.1 M HEPES, pH 7.0, %2 w/v polietilen glikol 3.350'de 7.5 mg/mL konsantrasyonda gözlendi.</li>
	<li>Kriyojenik koruma için kristalleri% 20 gliserol içeren bir depolama çözeltisine aktarın ve ardından 100 K gazlı azot akışında hızla soğutun.</li>
	<li>Şanghay senkrotron radyasyon tesisinin (Şanghay, Çin) bl19U ışın hattından X-ışını kırınım verilerini toplayın.</li>
</ol>6. Yapı belirleme ve analizleri
<ol><li>Yüksek çözünürlüklü yapısal verilerle, Denzo programını ve HKL2000 yazılım paketini (https://hkl-xray.com/) kullanarak koleksiyonun gücünü işleyin ve ölçeklendirin 23.</li>
	<li>Protein Veri Bankası'nda (PDB) daha iyi bir başlangıç modeli seçtikten sonra, CCP424'te Phaser MR programı ile moleküler değiştirme kullanarak yapıları belirleyin (http://www.ccp4.ac.uk/). Kullanılan model Protein Data Bank (PDB) kod 5F1I ile yapı koordinatlarıydı.</li>
	<li>İlk eklem iyileştirmesi için rafine X-ray modelini kullanın. Phenix rafine tek başına ve ortak modları tek başına X-ışını ve eklem nötron ve X-ışını arıtma için kullanın.</li>
	<li>Her arıtma turundan sonra, modeli Coot 25'teki (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/) Fo − Fc ve2Fo − Fc pozitif nükleer yoğunluk haritaları ile manuel olarak kontrol edin. Bu, suların ve belirli D atomlarının uygun şekilde yerleştirilmesini kolaylaştırır. Yapıların tüm figürleri PyMOL (http://www.pymol.org/) tarafından oluşturulmuştur.</li>
</ol>

<ol><li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li>
<li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen%2C+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li>
<li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li>
<li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li>
<li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha%28alpha%29+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li>
<li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li>
<li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li>
<li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li>
<li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436(2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B%2A17%3A+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I%3A+crystal+structures+of+Mamu-A%2A01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A%2A02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li>
<li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8%2B+T+cell+epitopes+and+host+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li>
<li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88%2A50801%3A+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N%2A01801%3A+a+host+strategy+to+present+featured+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li>
<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li>
<li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A%2A0301+and+HLA-A%2A1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li>
<li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetMHCpan%2C+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosetta++FlexPepDock+ab-initio%3A+simultaneous+folding%2C+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934(2011).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+two+H-2Db%2Fglycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li>
<li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017(2018).</li>
<li>McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432(2012).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Search+Results%22%5BJournal%5D)">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250(2019).</li>
<li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CLUSTAL_X+windows+interface%3A+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li>
<li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESPript%2FENDscript%3A+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek bir şeyi yok.

Farklı taksondan heterolog ikame yoluyla hibrit bir protein kompleksinin inşası, MHC I ve ligandlarında olduğu gibi homolog kompleks mevcut olmadığında fonksiyonel ve yapısal araştırmalar için ortak bir stratejidir. Bununla birlikte, metodoloji ve teknoloji ile ilgili sınırlı bir özet vardır. Burada bβ 2 m veya hβ 2 m ile stabilize edilen yarasa MHC I, Ptal-N*01:01'in yapısı analiz edildi. Ptal-N*01:01'e 2m'lik β bağlayıcı anahtar amino asitlerin yarasa ve insan arasında korunduğu bulunmu...

Başlıca histocompatibility complex (MHC) tüm omurgalılarda bulunur ve enfeksiyöz patojenlere karşı hücre aracılı bağışıklığı belirleyen bir gen kümesidir. MHC sınıfı I, hücresel bağışıklığa aracılık etmek ve bağışıklık düzenlemesine katılmak için CD8+ T hücrelerinin yüzeyindeki T hücre reseptörlerine (TCR) virüs enfeksiyonu üzerine üretilen viral bileşenler gibi endojen peptitler sunar1. Peptitlere bağlı MHC I'in yapısal bir çalışması, CD8+ T hücre immün yanıtlarının değerlendirilmesinde ve aşı geliştirilmesinde hayati roller oynayan MHC I moleküllerinin peptit bağlama motifleri ve sunum özellikleri hakkında bilgi sağlar.
MHC I molekülerinin Bjorkman ve ark.2tarafından ilk kristalizasyonu ve yapısal belirlenmesinden bu yana, MHC I moleküllerinin kristal yapı analizi, peptitlerin MHC I moleküllerine nasıl bağlandığı anlayışını büyük ölçüde teşvik etti ve ışık zincirlerinin ağır zincirler ve peptitlerle etkileşimini anlamaya yardımcı oldu. Bir dizi takip çalışması, ışık zincirini kodlayan genlerin MHC ile ilişkili olmamasına rağmen, ışık zincirinin MHC I moleküllerinin montajı için önemli bir protein olduğunu belirtti3,4. Birden fazla yüzeyde MHC sınıf I moleküllerinin üç alanıyla etkileşime girer. Işık zinciri olmadığında, MHC sınıfı I molekülleri antijen sunan hücrelerin yüzeyinde doğru bir şekilde ifade edilemez ve immünolojik işlevlerini uygulamak için TCR ile etkileşime giremez.
MHC I, ağır bir zincir (H zinciri) ve ışık zincirinden (yani,β 2mikroglobulinden (β2m)) oluşur ve uygun bir peptit5'ebağlanarak monte edilir. H zincirinin hücre dışı segmenti α1, α2 ve α3 etki alanlarından oluşur6. α1 ve α2 etki alanları peptit bağlama oluğunu (PBG) oluşturur. β2m zincir, MHC I'deki montaj kompleksinin yapısal bir alt birliği olarak hareket eder ve kompleksin konformasyonunu stabilize eder ve MHC I H zinciri için7, 8,9katlanan moleküler bir refakatçidir. Bir dizi çalışma, MHC I H zincirlerinin yarasa (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus makak (Primatlar) gibi çeşitli memelilerden olduğunu göstermiştir. (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, fare (Rodentia) (H-2Kd)14,15, köpek (Etobur) (DLA-88 * 50801)16, sığır (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 ve at (Peris)sodactyla) (Eqca-N*00602 ve Eqca-N*00601)18 heterologöz β2m (Tablo 1) ile birleştirebilir. Bu melez moleküller genellikle yapısal ve fonksiyonel çalışmalarda kullanılır. Bununla birlikte, hibrid MHC I'in heterolog β2m ile fonksiyonel ve yapısal çalışması için metodoloji henüz özetlenmiş değildir. Bu arada, farklı taksonlar arasındaki2m β değişim için yapısal temel belirsizliğini koruyor.
Burada MHC I ekspresyonu, yeniden katlama, kristalizasyon, kristal veri toplama ve yapı belirleme prosedürü özetlenmiştir. Ek olarak, farklı türlerden β2 m'likpotansiyel ikameleri, homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen MHC'nin yapısal uyumu karşılaştırılarak analiz edilir. Bu yöntemler kanser ve bulaşıcı hastalıkta daha fazla MHC I yapısal çalışması ve CD8+ T hücre immün yanıt değerlendirmesi için yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>10 kDa MMCO membran</td><td>Merck milipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>%30 Akrilamid</td><td>LABLEAD</td><td>A3291-500ml*5</td><td></td></tr><tr><td>5 kez; Protein SDS Yükleme</td><td>Novoprotein</td><td>PM099-01A</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa kesme</td><td>Merck millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Inalco</td><td>1758-9314</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) suşu</td><td>TIANGEN</td><td>CB105-02</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP</td><td>219605580</td><td>Uygun eldiven ve göz/yüz koruması kullanın. Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım alınız.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td>Eldiven ve gözlük havalandırmalı bir mutfakta giyilmeli ve çalıştırılmalıdır. Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım alınız.</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGT515500</td><td></td></tr><tr><td>Gliserin</td><td>HUSHI</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>GSH</td><td>Amresco</td><td>0399-250G</td><td></td></tr><tr><td>GSSG</td><td>Amresco</td><td>0524-100G</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin hidroklorür</td><td>Amresco</td><td>E424-5KG</td><td></td></tr><tr><td>h & beta; 2m</td><td>laboratuvarımız</td><td></td><td>Zhang, S. ve ark. İki HIV türevi peptit kompleksi tarafından ortaya çıkarılan HLA-A * 0301 ve HLA-A * 1101 tarafından çapraz alel sunumunun yapısal temeli. Mol İmmünol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Inalco</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin Hidroklorür</td><td>Amresco</td><td>0877-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Protein İşaretleyici</td><td>Fermentas</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Boao Rui Jing</td><td>A112130</td><td></td></tr><tr><td>Superdex Artışı 200 10/300 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo</td><td>17919</td><td>Eldiven ve gözlük havalandırılan bir mutfakta takılmalı ve çalıştırılmalıdır.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biyocetvel</td><td>RH30056-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Oksoit</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Maya özütü</td><td>Oksoit</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

heterologöz β2-microglobulin ile yarasa major histocompatibility complex class i'in stabilitesi ve yapısı

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Başlıca histocompatibility complex (MHC), bulaşıcı hastalık ve tümör gelişimine karşı antijen peptit sunumunda ve T hücre immün yanıtlarında önemli bir rol oynar. Farklı türlerden heterolog β2mikroglobulin (β 2 m)ikameile karmaşık olan hibrit MHC in vitro stabilize edilebilir. Bu, 2 m'lik homolog β mevcut olmadığında, memelilerin MHCI'iniincelemek için mümkün bir araçtır. Bu arada,2m ikamesi β memelinin peptit sunumunun önemli ölçüde etkilenmediği belirtilmiştir. Bununla birlikte, heterolog β2mikroglobulin (β2m) ile karmaşık hale gelen hibrit MHC'nin metodolojisi ve teknolojisi ile ilgili sınırlı özetleme vardır. Burada MHC I çalışmasında heterolog β2m ikame fizibilitesini değerlendirme yöntemleri sunulmuştur. Bu yöntemler, ifade yapılarının hazırlanmasıni içerir; dahil etme organlarının saflaştırılması ve MHC kompleksinin yeniden katlandırılması; protein termosabilme kabiliyetinin belirlenmesi; kristal tarama ve yapı tespiti. Bu çalışma MHC I'in işlevini ve yapısını anlamak için bir öneri sağlar ve ayrıca enfeksiyöz hastalık ve tümör immünoterapisi sırasında T hücre yanıtı değerlendirmesi için de önemlidir.

Önceki çalışma, HeV türevi HeV1 (DFANTFLP) peptidinin Ptal-N * 01:0110 , 19tarafından sunulduğunubildirmiştir. Burada bu peptidin 2m (bβ2 m) homolog yarasa β Ptal-N*01:01'e veheterolog insan β2</fon...

Protokol, farklı türlerden potansiyel β 2 mikroglobulin (β 2m)ikameyoluyla stabil majör histocompatibility complex (MHC) sınıfı I elde etmek için deneysel yöntemleri açıklar. MHC I'in homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen yapısal karşılaştırması araştırılmıştır.

Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Bu çalışmada, metodolojiyi özetlemek ve heterolog beta-2 mikroglobulin ile karmaşık hale gelen hibrit bir MHC sınıfının fizibilitesini değerlendirmek için model olarak Bat MHC Class I'i kullandık. Önceki çalışmalar, memeli B2M ikamesinin peptit sunumını önemli ölçüde etkilemediğini göstermiştir. Aslında, hibrid MHC Sınıfı I, orijinal moleküle benzer bir yapıyı ve işlevi etkinleştirebilir.Bu teknikler, bulaşıcı hastalık ve tümör immünoterapisi sırasında doku yanıtı değerlendirmesi için MHC I'in fonksiyonel ve yapılandırılmış çalışmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. E.coli kültür dönüşümü için, 100 mikrolitre eşitlenmiş süspansiyona yarasa veya insan MHC Sınıf I beta iki mikroglobulin hidrojen zinciri içeren 10 nanogram plazmid ekleyin ve süspansiyonu 30 dakika boyunca buzda yıkayın. Kuluçkanın sonunda, ısı bakterileri 42 santigrat derecede 90 saniye boyunca şok eder ve kültürü iki dakika boyunca buz banyosuna geri döndürür.Daha sonra kültüre 800 mikrolitre lysojeny suyu ekleyin ve süspansiyonu 37 santigrat derecede 20 dakika sallanan bir platformda ve dakikada 200 dönüş sallayın. Kuluçkanın sonunda, bakterilerin 100 mikrolitresini uygun bir antibiyotiğe dirençli kültür bıçağına yayın. Ertesi sabah, yakın zamanda dönüştürülmüş tek bir bakteri klonu seçin ve klonu antibiyotik ortamı ile üç mililitre LB ile aşıla.Kültürü 12 ila 16 saat boyunca 37 santigrat derecede sallanan platforma yerleştirin. Ertesi sabah, aktif bakteri stoğunun 500 mikrolitresini antibiyotik ortamı ile 50 mililitre LB'ye aktarın ve bakterileri bir gecede sallanan inkübatöre geri verin. Kalan aktif bakteri stoğunu 500 mikroliter aliquot'a bölün ve eksi 80 santigrat derece depolama için her bir aliquot'ı% 40 gliserrol'ün 500 mikroliter hacmine ekleyin.Büyük miktarlarda rekombinant protein üretmek için, ertesi sabah bakteriyel süspansiyonu bir ila 100 oranında antibiyotik ortamı ile iki litre LB'ye aktarın ve 600 nanometrede 0.6 absorban elde edilene kadar kültürü sallanan inkübatöre geri verin. Daha sonra, trans genin ekspresyonunun teşviki için kültüre bir milimolar IPTG ekleyin. Dört ila altı saat indüksiyondan sonra, bakteri kültürünü santrifüjleme için şişelere aktarın ve bakteri hücresi peletlerini şişe başına 60 mililitre PBS'de yeniden askıya alın.Daha sonra ifade edilen rekombinant proteini ultrasonik hücre bozucu tarafından 99 kez, altı saniye ve sonikasyon başına 300 Watt'ta 12 saniyelik bir aralıkla serbest. dahil vücut saflaştırma için sonicated bakterileri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri iki ek santrifüj için uygun bir yıkama tamponu hacminde yeniden askıya alın. İkinci yıkamadan sonra, dahil etme gövdelerini ve yeniden süspansiyon tamponu yeniden askıya alın ve dahil etme gövdesi saflığını test etmek için SDS sayfası için numunenin 20 mikroliter aliquot'ını ayırın.Kalan numuneyi santrifüj edin ve pelet içeren dahil etme gövdesini tartın. Mililitre tampon başına 30 miligramlık dahil etme gövdesinin son konsantrasyonuna peletlere çözünme tamponu ekleyin. Ve çözeltiyi dört santigrat derecede yavaşça karıştırmak için manyetik bir karıştırıcı kullanın, ta ki inklüzyon kütleleri çözünme tamponunda çözünene kadar.Çökeltmeleri attıktan sonra, içerme gövdelerini eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. MHC karmaşık yeniden katlama için, beş milimoler azaltılmış glutatyon ve 250 ila 300 mililitrede 0,5 milimoler oksitlenmiş glutatyon ekleyin, dört santigrat derecelik bir yeniden katlama tamponu. Ve çözeltiyi 10 ila 20 dakika boyunca dört santigrat derecede manyetik bir karıştırıcıda yavaşça karıştırın.MHC hidrojen zinciri ve beta iki mikroglobulin seyreltme için, dahil etme gövdesini bir mililitre şırıngaya yükleyin ve hızlı ve verimli bir seyreltme elde etmek için bir mililitre hacimli dahil etme gövdesi çözeltisinin tamamını karıştırma çubuğunun yakınındaki bir litre yeniden katlama tamponuna enjekte edin. Daha sonra, mililitre peptit başına beş miligramı dimetil sülfooksit içinde çözün ve az önce gösterildiği gibi yeniden katlama çözeltisine hızlı bir şekilde 200 mikrolitre peptit enjekte edin. 10 ila 20 dakika yavaş karıştırdıktan sonra, üç mililitre H zincirli inklüzyon gövdesini yeni bir litre hacimli yeniden katlama tamponuna enjekte edin ve yeniden işlemenin sekiz ila 10 saat boyunca dört santigrat derecede devam etmesine izin verin.Yeniden katlanmış protein konsantrasyonunu belirlemek için, 10 kilodalton çoklu bakır oksidaz zarı olan basınçlı bir odaya değişim tamponu ekleyin ve tamponu 30 ila 50 mililitre hacme konsantre edin. Yeniden katlama çözeltisini bir santrifüj tüpüne aktarın ve çökeltmeleri santrifüjleme ile çıkarın. Süpernatı dikkatlice odaya aktarın ve tamponu yaklaşık bir mililitrelik son hacme daha fazla konsantre edin.Santrifüjleme ile son kirleticileri çıkarın ve süpernatı steril bir tüpe aktarın. Proteinleri arındırmak, örnekleri zirvede toplamak ve SDS sayfasını kullanarak analiz etmek için on üç yüz GL boyutu dışlama sütunu kullanın. MHC karmaşık tepe noktasını toplayın ve proteini mililitre başına 15 miligramlık son konsantrasyona konsantre edin.Daha sonra kompleksi mililitre konsantrasyonu başına 7,5 miligrama seyreltin. Oturma damlası buharı difüzyon tekniğini kullanarak karmaşık MHC ve peptidin kristalizasyonunu gerçekleştirmek için, numunenin 0,8 mikrolitresini ticari bir kristal tahtaya ekleyin ve kartı kapatın. Numune çözeltisini dört veya 18 santigrat derecede 100 mikrolitre rezervuar çözeltisine karşı dengeleyin ve önümüzdeki altı ay boyunca kristal büyümesini düzenli olarak gözlemlemek için bir mikroskop kullanın.Kriyojenik koruma için, deneyin sonunda, numuneleri 100 derece Kelvin gazlı azot akışında hızla soğutmadan önce kristalleri% 20 gliserol içeren bir depolama çözeltisine aktarın. Ardından standart protokollere göre x-ray kırınım verilerini toplayın. Kristal komplekslerinin yapısını belirlemek için, HK L 2000 yazılım paketindeki Denzo programındaki yüksek çözünürlüklü yapısal x-ışını kırınım verilerini açın ve protein veri bankasında bir başlangıç modeli seçin.Proteinin yapısını belirlemek için CCP4'teki Phaser MR Programı'ndaki verileri açın ve ilk eklem iyileştirmesi için rafine x-ray modelini kullanın. Daha sonra phoenix rafine tek başına ve ortak modları x-ray tek başına arıtma için kullanın, ve x-ışını arıtma için ortak nötron. Her arıtma turundan sonra, modeli Fo-Fc ve Coot'taki 2Fo-Fc pozitif nükleer yoğunluk haritaları ile manuel olarak kontrol edin.Bu temsili deneylerde, Hendra Virüsü türetilmiş Hendra Virüsü Bir peptidin homolog yarasa beta iki mikroglobulin ve heterolog insan beta iki mikroglobulin ile MHC Sınıf I hidrojen zincirlerine bağlanma kapasiteleri değerlendirildi. Her iki analizde de beta iki mikroglobulin ışık zinciri ile yeniden doyma yoluyla yüksek çözünürlüğe sahip kristaller oluşmuştur. Beta iki mikroglobulin yokluğunda, bu kompleksler oluşmaz.MHC Sınıf I hidrojen zinciri Hendra Virüs bir, insan beta iki mikroglobulin yapısı, insan beta iki mikroglobulin korunmuş kalıntılar H31, D53, W60, ve Y63 insan beta iki mikroglobulin, peptit bağlayıcı oluk alt ile temas yapmak ve Q8, Y10, R12, ve 24 kalıntılar, alfa üç etki alanına bağlı beta iki mikroglobulins karşılık gelir. Genel yarasa ve insan yapılarında, hidrojen zincirlerinin bir ila 184'lü kalıntılarının ortalama kök ortalama kare derivasyonu, karbon alfa atomunun tüm süperpozisyonlarının altında 0,248'dir ve bu iki kompleks arasında hiçbir fark olmadığını gösterir. Peptit hizalamasının yapısı, hendra virüsünün bu iki kompleksteki bir peptit onaylarının oldukça benzer olduğunu göstermektedir.Dizi hizalaması ayrıca beta iki mikroglobulinin farklı türlerden amino asitlerinin yüksek oranda korunmuş olduğunu göstermektedir. Rakip kompleksleri yüksek raporlama verimliliği ile sunmak önemlidir. Bu nedenle, uygun beta iki mikro globulin seçmek ve son derece saflaştırılmış inklüzyon cisimleri kullanmak çok önemlidir.Bu protokol, diğer türlerde potansiyel beta iki mikroglobulin ikameleri yoluyla kararlı MTC I kompleksi elde etmek için kullanılabilir ve var olmak için MTC I yapısı ve işlevidir. Bu çalışmalardan elde edilen veriler, enfeksiyöz hastalık ve tümör immünoterapileri sırasında T hücre yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir.

stability-structure-bat-major-histocompatibility-complex-class-i-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Burada, insan lökosit antijenleri tarafından sunulan T hücresi reseptörü ve tümör antijenleri arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz; bu yöntemler arasında protein üretimi, X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel T-hücresi deneyleri yer alır.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Bu protokol, embriyonik fare beyninden birincil hipokampal nöronları kültleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Kültürlü nöronların hücre dışı yüzeyinde majör histocompatibility complex class I'in ekspresyolü daha sonra akış sitometrik analizi ile değerlendirilir.

Birincil Murine Hipokampal Nöronlarda Majör Histocompatibility Complex Class I'in Akış Sitometrisi ile İfadesinin Değerlendirilmesi

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Burada, spesifik bir modifikasyon için zenginleştirilmiş mikrotübüller elde etmek için spesifik mikrotübül modifiye edici enzimlerden yoksun veya içerebilen memeli hücrelerinden endojen tübülin çıkarmak için bir protokol tarif ediyoruz. Daha sonra, ekstrakte edilen mikrotübüllerin, kriyo-elektron mikroskobu için ızgaralar hazırlamak üzere saflaştırılmış mikrotübül bağlayıcı proteinlerle nasıl dekore edilebileceğini açıklıyoruz.

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Burada, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusunun diseksiyonu ve histolojik ve gen ekspresyon analizlerinin yapılması için pratik bir prosedür sunuyoruz.

Murin Supraklaviküler Kahverengi Yağ Dokusunun Diseksiyonu, Histolojik İşlemi ve Gen Ekspresyon Analizi

Öğrenin, heterologöz β2-mikroglobulin ile yarasa MHC sınıf I stabilitesini ve yapısını incelemek için E. coli dönüşümü ve kristalizasyon tekniklerini kullanarak hibrit komplekslerin işlevselliğini değerlendirin.

Heterologöz β₂-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı

Daha fazla video keşfet