Name: Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin, canlı Pseudomonas aeruginosa hücrelerinde FLIM-FRET ile dengesiz donor-akseptor oranlarında protein-protein etkileşimlerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, doğal hücresel ortamdaki moleküler etkileşimleri incelemek için kritik bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Ludovic Richert'i FLIM veri toplama ve FLIM kurulumunun teknik bakım ve geliştirmesi konusundaki değerli yardımlarından dolayı kabul ediyoruz. Bu çalışma Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) bağışları ile finanse edilmiştir. VN Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906) tarafından finanse edilmektedir. YM, Institut Universitaire de France'a (IUF) destek ve araştırmaya yardımcı olmak için ek süre sağladığı için müteşekkirdir. IJS ve JG, Strazburg İlaç Dağıtım Enstitüsü'nü mali desteğinden ötürü kabul ediyorlar.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions%3A+Progress%2C+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions.</a> Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).</li>
<li>Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+protein+dynamics+of+the+siderophore+pyoverdine+pathway+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).</li>
<li>Ringel, M. T., Brüser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+pyoverdines%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of pyoverdines.</a> Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).</li>
<li>Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+siderophore+biosynthesis+among+fluorescent+Pseudomonads+and+new+insights+into+their+complex+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization.</a> Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+detecting+protein-protein+interactions+in+living+cells%3A+principles%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress.</a> Science China Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDay%2C+RN+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22">Springer Series in Chemical Physics</a>. 111, 249-276 (2015).</li>
<li>Bastiaens, P. I. H., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+Spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).</li>
<li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).</li>
<li>Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+CFP%2FYFP+and+GFP%2FmCherry+Pairs+to+Donor+Photobleaching+on+FRET+Determination+by+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Leray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+of+a+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscope+for+fret+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements.</a> Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).</li>
<li>Elson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+including+single-shot+acquisition+with+a+segmented+optical+image+intensifier%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier.</a> New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).</li>
<li>Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM-FRET+for+Cancer+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">FLIM-FRET for Cancer Applications.</a> Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 8, 393-399 (2011).</li>
<li>Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+sequence+of+the+pvdA+gene+encoding+the+pyoverdin+biosynthetic+enzyme+L-ornithine+N5-oxygenase+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).</li>
<li>Imperi, F., Visca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+pyoverdine+biogenesis+machinery+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+A+membrane-associated+%27siderosome%27%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'.</a> FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).</li>
<li>Gasser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+FRET-FLIM+and+single+molecule+tracking+reveal+the+supra-molecular+organization+of+the+pyoverdine+bio-synthetic+enzymes+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).</li>
<li>Rietsch, A., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+type+III+secretion+gene+expression+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).</li>
<li>Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).</li>
<li>Godet, J., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+protein-protein+interactions+with+large+differences+in+protein+expression+levels+using+FLIM-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007(2019).</li>
<li>El Meshri, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nucleocapsid+domain+in+HIV-1+gag+oligomerization+and+trafficking+to+the+plasma+membrane%3A+A+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bh+TCSPC+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">The bh TCSPC Handbook.</a> Scanning. , 1(2010).</li>
<li>Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+HIV-1+protein+oligomerization+by+FLIM+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy.</a> Springer Series in Chemical Physics. , 111(2015).</li>
<li>Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+based+analysis+of+FRET+images+recorded+using+spectrally+resolved+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).</li>
<li>Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescence+lifetime+estimation+with+modified+phasor+approach+and+Laguerre+deconvolution%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003(2017).</li>
<li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+protein-protein+interactions+using+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+High-Throughput+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+to+Detect+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions.</a> Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).</li>
<li>Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+biomarker+screening+by+FLIM-FRET+for+combination+therapy+in+ER%2B+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer.</a> Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+lifetime+imaging+techniques%3A+A+review+on+challenge+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+fitting+based+FRET-FLIM+analysis+approaches+applied+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Stringari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+microscopy+distinguishes+different+metabolic+states+of+germ+cells+in+a+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).</li>
<li>Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.</a> Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).</li>
<li>Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nuclear+wide+chromatin+compaction+by+phasor+analysis+of+histone+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+in+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data.</a> Data in Brief. 30, 105401(2020).</li>
<li>Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrimm%2C+JB+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. 113, Elsevier Inc. (2013).</li>
<li>Li, L., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+of+Small-Molecule+Fluorogenic+Probes+for+Bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging.</a> Biochemistry. 59, 216-217 (2020).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Net-FLICS%3A+fast+quantitative+wide-field+fluorescence+lifetime+imaging+with+compressed+sensing+-+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach.</a> Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).</li>
<li>Smith, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fit-free+analysis+of+fluorescence+lifetime+imaging+via+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+compressive+macroscopic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+-+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging.</a> Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

FLIM-FRET, yoğunluk tabanlı FRET görüntülemeye göre bazı önemli avantajlar sunar. Floresan ömür, floroforun içsel bir parametresi. Sonuç olarak, ne ışık uyarma yoğunluğu floroforların yerel konsantrasyonları bağlı değildir. Floresan ömrü ayrıca fotoğraf beyazlatma dan da kötü etkilenir. Özellikle lokal protein konsantrasyonlarının hücre altı bölmeleri veya bölgeleri boyunca son derece heterojen olabileceği hücrelerde PPI'ların kanıt edilmesi ilginçtir. FLIM-FRET, hem proteinlerin hem de proteinlerin ifade düzeyleri düşük...

Protein-protein etkileşimleri (PPI) hücrelerde çeşitli anahtar süreçleri kontrol1. PPI rolleri protein bileşimi, yakınlık fonksiyonları vehücrelerdekonumları 2 dayalı farklıdır. PPI'lar farklı teknikler ile araştırılabilir3. Örneğin, co-immünopresid, ppis tanımlamak veya onaylamak için yaygın olarak kullanılan nispeten basit, sağlam ve ucuz bir tekniktir. Ancak, etkileşimhalinde olan proteinlerin ifade düzeyleri düşük olduğunda veya etkileşimler geçici veya yalnızca belirli ortamlarda ilgili olduğunda PPI'ların incelenmesi zor olabilir. P. aeruginosa pyoverdine yolunun farklı enzimler arasında meydana gelen PPIs incelenmesi genel demir ko-faktörlü baskı fur baskı hücre4ifade edilecek pyoverdine yolunun tüm proteinlerin ifade sağlamak için rahatlamış olduğunu gerektirir4 ,5,6. Yolun tüm proteinleri için bu ortak düzenleme hücrede zamanında ifadeler onların etkileşimlerini teşvik etmesi bekleniyor sonuçları. Boyut, doğa, ifade düzeyleri ve bu metabolik yolun protein sayısı açısından çeşitlilik, yeniden yapılı sistemlerde çalışmayı zorlaştırır6. Bu nedenle hücresel ortamlarında PPI'ları keşfetmek, proteinlerin biyolojik işlevlerini kendi yerel bağlamlarında daha iyi anlamak için çok önemlidir.
Floresan dahil olmak üzere sadece birkaç yöntem canlı hücrelerde PPI keşfetmek sağlar7. Ölçülebilen farklı floresan parametreleri arasında, floresan ömrü (yani, bir florofor bir foton yaymadan önce heyecanlı durumda kalır ortalama süre) muhtemelen canlı hücrelerde keşfetmek için en ilginç parametrelerden biridir. Bir florofor floresan ömrü çevresine son derece duyarlıdır ve FLIM bu nedenle florofor çevresi ile ilgili kimyasal veya fiziksel bilgi sağlayabilir8. Bu förster rezonans enerji transferi varlığı içerir (FRET) bir floresan kısa bir mesafede bulunan floresan bir "kabul" varlığında oluşabilir "donör". Enerji transferi, donör floresan süresinin(Şekil 1A)önemli ölçüde kısalmasıyla sonuçlanır ve floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Mikroskobu'nu (FLIM) canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini doğrudan araştırmak için güçlü bir yaklaşım haline getirir. FLIM ayrıca etkileşimlerin7,8hücrelerinde nerede gerçekleştiği hakkında uzamsal bilgi sağlayabilir. Bu yaklaşım, etkileşen iki ortağın floroforlarıyla etiketlemenin mümkün olduğu durumlarda PPI'ları araştırmak için son derece güçlüdür.
FRET gerçekleşmesi için - iki floroforlar arasındaki mesafe kritik koşullar8gereklidir ,9. İki florofor 10 nm'den fazla birbirlerinden uzak olmamalıdır. Bu nedenle, flim-FRET deneyleri tasarlarken, vericinin ve floresan kabul edenin etkileşim kompleksinde birbirine yakın bir konuma sahip olmasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Bu kısıtlayıcı gibi görünse de, FRET'in uzaklık bağımlılığı, FRET geçiren iki etiketli proteinin fiziksel olarak etkileşime girmesini sağladığından gerçek bir avantajdır(Şekil 1A). Kolocalizasyon deneylerinde ÜFE hakkında net cevaplar almadaki güçlükler (iki kolokalize protein mutlaka etkileşime girmeyebilir) bu nedenle FLIM-FRET kullanılarak bir sorun değildir.
<img alt="FRET diyagramı; floresan spektroskopisi; donör-alıcı; uyarılma-emisyon eğrileri; spektral örtüşme." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: FLIM-FRET analiz prensibi. FLIM-FRET çok boyutlu görüntünün her pikseli, bu belirli konumda kaydedilen floresan bozunma hakkında bilgi içerir (#counts = t kanalında algılanan fotonların sayısı). (A) FLIM görüntünün klasik gösterimi genellikle sahte renkli bir yaşam boyu kodlanmış 2B görüntüdür (solda). Donörün ortalama floresan ömründe bir azalma - renk skalasında ki bir değişiklikten de görüldüğü gibi - FRET'nin varlığında görülebilir ve bu mekansal alanda PPI varlığı hakkında bilgilendiricidir. (B) FRET'in oluşabilmesi için donör emisyon spektrumu ile kabul eden emilim spektrumu arasında çakışma gereklidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
FRET için ikinci bir gereklilik donörün emisyon spektrumu ve kabul edenin emilim spektrumunun8 ile çakışmasıdır (Şekil 1B). Donörün floresan uyarma kabul edenin doğrudan floresan uyarma çok az katkıda dalga boylarında olmalıdır. Tüm florofor kombinasyonları mümkün değildir ve ayrıca FLIM-FRET yorumlarını kolaylaştırmak için monokonsenyel floresan bozunan donörleri tercihen kullanmanızı tavsiye ediyoruz10. Floresan proteinlerin birkaç çift popüler eGFP-mCherry çift11 de dahil olmak üzere bu gereksinimleri karşılamak (mevcut floresan protein FRET çiftleri paletüzerinde bir inceleme içinbkz 12,13).
FLIM-FRET, Bir FLIM görüntüsünün her pikselinde bir FRET donörünün floresan ömür boyu çürümesini ölçmeye olanak sağlar (Şekil 1A). Floresan yaşam süresini belirlemek için, kazanım ve analizde farklılık gösteren iki temel teknik vardır: frekans-etki alanı (FD)14 ve zaman-etki alanı (TD). TD FLIM daha yaygındır ve gating yöntemleri 15 dahil olmak üzere farklı olası algılama yapılandırmaları ile birlikte darbeli bir aydınlatma kullanılarak gerçekleştirilir15, çizgi kamera16 veya zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC) teknikleri8. Hem FD hem de TD teknikleri için floresan ömrü doğrudan ölçülmez, ancak yaşam sürelerini veya etkileşimlerin varlığını tahmin etmek için ölçülen verilerin analizini gerektirir. TCSPC teknikleri için, en yaygın olarak kullanılan analiz, artıkların ağırlıklı toplamını en aza indiren en az kare yinelemeli yeniden kıvrımlar kullanarak bozunmaların tek veya çok üstel fonksiyonlarla donatılmasına dayanır.
Son olarak, FLIM-FRET hem tek foton hem de multifoton uyarma kullanılarak gerçekleştirilebilir. En son odak düzleminin dışında otomatik floresan ve fotohasarı azaltmak gibi çeşitli avantajları vardır. Kalın 3Dnumunelerde8 çalışıyorsa multifoton uyarmalar da daha uzun bir uyarma derinliği sağlar. Aksine, floresan proteinlerin iki foton emilimi kesitleri sınırlı olarak tek foton uyarma genellikle daha verimli17.
Burada, ppis kritik özelliklerini ortaya çıkarmada tekniğin kalitesini ve sağlamlığını göstermek için kopyaların çok farklı sayıda ifade iki etkileşim protein (PvdA ve PvdL) belirli bir durumda canlı P. aeruginosa PPIs FLIM-FRET ölçümleri için bir protokol öneriyoruz. PvdA ve PvdL proteinleri pyoverdine biyosentezinde rol oynarlar. PvdA bir L-ornitin N5-oxygenaz ve hidroksilasyon (PvdA) ve formilasyon (PvdF) tarafından L-ornithine L-N5-formyl-N5-hidroksiincenin sentezler18. PvdL, dört modülden oluşan ribozomal olmayan bir peptit sentezi (NRPS) enzimidir. İlk modül mistik asit inyaklasını katalizler. İkinci modül, L-Glu'nun aktivasyonunu ve yoğunlaşmasını mistik-coA'ya katalizler. Daha sonra, üçüncü modül daha sonra D-Tyr izomerize bir L-Tyr amino asit yoğunlaştırır. Son olarak, dördüncü modül bir L-Dab (Diaminobutyric asit) amino asit bağlar acylated tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6oluşturmak için . PvdL böylece pyoverdine öncülüüç ilk amino asitlerin sentezinden sorumludur. PvdL ile PvdA protein etkileşimi şaşırtıcı, PvdL aksine, L-N5-formyl-N5-hidroksyorltin için özel bir modül taşımaz. Bu etkileşim, piradenin öncüsentezinden sorumlu tüm enzimlerin büyük geçici ve dinamik çok enzimli komplekslerde düzenlendiğini göstermektedir19,20.
Bu raporda, etkileşen iki eGFP ve mCherry etiketli proteinleri doğal olarak ifade eden bakteri suşlarının nasıl inşa edilebildiğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ayrıca, etkili FLIM-FRET hücre görüntülemesi için numune hazırlama ve koşulları da açıklıyoruz. Son olarak, karmaşık FLIM-FRET verilerinin basit yorumu için gelişmiş görselleştirme olanakları sağlayan yeni geliştirilen bir araç da dahil olmak üzere görüntü analizi için adım adım öğretici öneriyoruz. Bu raporla, sadece maceracı değil, çoğu biyologu FRET-FLIM'in yerel hücresel ortamda ppis'lerle ilgili sorularını doğrudan ele alabilecek erişilebilir ve güçlü bir teknik olduğuna ikna etmek istiyoruz.

<table><tbody><tr><td>525/50 nm bant geçiren filtre</td><td>F37-516, AHF, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm kısa geçiren filtre</td><td>F75-680, AHF, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat (NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polimeraz 5U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Fiber bağlantılı çığ foto-diyot</td><td>SPCM-AQR-14-FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller (Kalınlık No. 1.5, 20 kez; 20mm</td><td>Örgü cam</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kaliteli DNA polimeraz Phusion 2U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Lizojeni et suyu (LB)</td> <td>Millipore</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat Heptahidrat (MgSO4 . 7H2O)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları (25 kez; 75mm)</td> <td>Örgü cam</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plazmid</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Dibazik (K2HPO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik (KH2PO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Süksinat (Disodyum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCImage, SPCM yazılımı</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril aşılama döngüsü</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz 1U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>TCSPC modülü</td><td>SPC830, Becker & Hickl, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti: Safir lazer</td><td>Insight DeepSee, Spectra Fizik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüpleri 50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı bakterilerde protein-protein etkileşimlerinin flim-fret Ölçümleri.

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein etkileşimleri (PPI) hücrelerdeki çeşitli önemli süreçleri kontrol eder. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ile birlikte floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) canlı hücrelerde PPI'lar hakkında doğru bilgi sağlar. FLIM-FRET, FLIM görüntüsünün her pikselinde bir FRET donörünün floresan ömür boyu çürümesini ölçmeye ve PPI'lar ve bunların uzamsal hücresel organizasyonları hakkında nicel ve doğru bilgi sağlamaya dayanır. Burada, PPI'lerin kritik özelliklerini ortaya çıkarırken tekniğin kalitesini ve sağlamlığını göstermek için son derece farklı kopya numaralarıyla ifade edilen iki etkileşim proteinin in canlı Pseudomonas aeruginosa'da PPI'ları izlemek için uyguladığımız FLIM-FRET ölçümleri için ayrıntılı bir protokol öneriyoruz. Bu protokol, ÜFE karakterizasyonu için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak açıklar - karmaşık FLIM-FRET verilerinin basit bir yorumu için gelişmiş görselleştirme olanakları sağlayan son geliştirilen araçları kullanarak son analize kadar bakteriyel mutant yapılardan başlayarak.

Farklı bakteriyel suşlar için ölçülen floresan ömürlerinin ampirik kümülatif dağılım fonksiyonları (ecdf) Şekil 8'degösterilmiştir. FRET oluşursa, ekdfler daha kısa ömürlü yaşam sürelerine doğru kaydırılır(Şekil 8A,8B). İki proteinin etkileşimi iki floroforarasında uzun bir mesafeyle sonuçlandığında, HIÇBIR FRET oluşabilir(Şekil 8C). Bu durum, FLIM'deki iki ortak arasındaki etkileşimin olmamasından ayırt edilemez. B...

Burada FLIM-FRET ölçümleri kullanılarak canlı Pseudomonas aeruginosa'da çok farklı ifade edilmiş iki protein arasındaki protein-protein etkileşimlerini karakterize eden bir protokol uyguluyoruz. Protokol, bakteri gerinim konstrüksiyonları, bakteri immobilizasyonu, görüntüleme ve görüntüleme sonrası veri analizi rutinlerini içermektedir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FİlM-FRET, şüpheli veya tahmin edilen protein-protein etkileşimlerini doğrulamayı mümkün kılan güçlü bir tekniktir. Bu protokolde, belirli durumlarda dengesiz donör ve alıcı miktarları olan verileri analiz etmenin bir yolunu sıyoruz. FİlM-FRET canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri hakkında bilgi verebilir.Doğal hücresel ortamda kisisel-protein etkileşimlerini araştırmak önemlidir, özellikle floresan protein endojen düzeyde ifade edildiğinde. P.aeruginosa, E.coli TOP10 ve E.coli yardımcı bakteri her büyüyen başlayın LB beş mililitre antibiyotik olmadan 30 derece santigrat gece sallayarak. Ertesi gün, kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün ve 1,5 mililitrelik mikrotüpte eşit miktarda P.aeruginosa, E.coli TOP10 ve E.coli yardımcısını karıştırın.Tüpü 9, 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatant'ı atın ve 50 mikrolitre LB'de peleti yeniden askıya alın. Önceden ısıtılmış LB agar üzerinde karışımın bir nokta plaka ve 37 santigrat derece beş saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, steril bir aşı lama döngüsü ile nokta kazıyın ve LB bir mililitre resuspend. Plaka 100 mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram ve mililitre gentamycin başına 30 mikrogram içeren LB agar bu bakte

flim-fret-measurements-protein-protein-interactions-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Video, floresan proteinler, bir donör eGFP ve alıcı mCherry ile etiketlenmiş sitoplazmik proteinleri eksprese eden canlı bakterilerde protein-protein etkileşimini belirlemek için FLIM-FRET görüntüleme tekniğini açıklar. Kombine teknik ayrıca etkileşen proteinlerin miktarının belirlenmesine de izin verir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu için FLIM-FRET Görüntüleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Öğrenin, canlı Pseudomonas aeruginosa hücrelerinde FLIM-FRET ile dengesiz donor-akseptor oranlarında protein-protein etkileşimlerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, doğal hücresel ortamdaki moleküler etkileşimleri incelemek için kritik bilgiler sağlar.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Daha fazla video keşfet