HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi
November 9th, 2020
Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.
Bu yaklaşım, protein bozunmasının hücresel olarak izlenmesine ve bozundurucu bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına izin verir. Bozunma dinamikleri, hücresel bağlamda son derece hassas ve nicel bir şekilde izlenebilir ve bu da temel bozunma parametrelerinin doğru bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. Bu yöntemler, parçalayıcı bileşik aktivitesinin HTS profilinin çıkarılmasına izin vererek, erken terapötik keşif aşamasında triyajı mümkün kılar.
Ayrıca, artan veya azalan endojen hedef seviyelerin modülasyonunu incelemek isteyen herkes için fikir verirler. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda bir araştırma bilimcisi olan Celia Bisbach olacak. Memeli yapışık veya süspansiyon hücrelerini hazırlayarak ve kaplayarak başlayın.
Hücre yoğunluğunu mililitrede 2.22 kez 10 ila 5. hücrelere ayarlayın ve bunları deney ve kontrol koşulu başına en az üç kuyucuk içeren plakalara dağıtın. % 100 DMSO'da 1000x konsantrasyonda seri olarak seyreltilmiş PROTAC veya bozundurucu test bileşik plakaları hazırlayın. Daha sonra hücre kültürü ortamında 10x nihai konsantrasyona seyreltin.
Bileşik olmayan bir DMSO kontrolü oluşturmak için ortama eşit hacimde DMSO ekleyin. Plakadaki hücrelere uygun miktarda 10x bileşiği veya kontrol çözeltisi ekleyin ve plakaları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Son nokta ışıldayan sinyalini ölçmek için, litik tamponun her bir mililitresi için 20 mikrolitre litik substrat ve 10 mikrolitre LgBiT proteini ekleyerek 2x litik algılama reaktifi hazırlayın.
Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere, test edilecek tüm kuyucuklar için yeterli reaktif hazırlayın. Hazırlanan litik tespit reaktifini hücrelere ekleyin ve plakayı bir mikroplaka vorteks karıştırıcı üzerinde 350 RPM'de 10 ila 20 dakika karıştırın. 96 veya 384 kuyulu bir plakayı okuyabilen luminometrede lüminesansı ölçün.
Hücre canlılığı çoğullaması kullanılıyorsa, bunu litik reaktifin eklenmesinden önce yapın. İstenen son nokta ölçümünden 30 ila 40 dakika önce, iki mililitre tahlil tamponuna 10 mikrolitre substrat ekleyerek 6x hücre canlılığı tespit reaktif çözeltisi hazırlayın. Hazırlanan reaktifi kuyucuklara ekleyin ve bir mikroplaka girdap karıştırıcısı üzerinde kısa bir süre karıştırın.
Daha sonra plakayı 37 derecelik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. İstenilen son noktada, floresansı 96 veya 384 kuyu formatında okuyabilen bir cihazda floresanı ölçün. Daha önce tarif edildiği gibi 2x litik reaktif hazırlayın.
Daha sonra reaktifi kuyucuklara ekleyin ve plakayı bir mikroplaka girdap karıştırıcı üzerinde 10 ila 20 dakika karıştırın. Karıştırdıktan sonra, lüminesansı ölçmek için bir luminometre kullanın. Tek konsantrasyon son nokta litik bozunma analizini göstermek için, birkaç CDK hedef proteini endojen olarak HiBiT ile etiketlendi ve pan kinaz sereblon bazlı PROTAC TL12-186 ile muamele edildi.
CDK protein seviyesi farklı zaman noktalarında ölçüldü ve fraksiyonel RLU belirlendi. CDK proteinlerinin protein kaybı açısından doğrudan birbirleriyle nasıl karşılaştırıldığını anlamak için, fraksiyonel RLU'lar toplam bozunma yüzdesi olarak hesaplandı. Kinetik bozunma analizi, BET ailesi üyesi proteinlerin, LgBiT proteinini stabil bir şekilde eksprese eden HiBiT ve HEK293 hücreleri ile endojen olarak etiketlenmesiyle gerçekleştirildi.
Hücreler daha sonra pan-BET PROTAC'ların üç farklı konsantrasyonu ile muamele edildi. Sereblonlu tabanlı dBET6 ve VHL tabanlı ARV-771. Dört farklı moleküler yapıştırıcı bileşiği ile muamele edilmiş LgBiT proteinini stabil olarak eksprese eden Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat hücrelerinin kinetik doz yanıtı bozunma profilleri burada gösterilmektedir.
Bileşikler arasında ve konsantrasyon serileri arasında bozunma tepkisinde önemli farklılıklar gözlenir. Bileşiklerin bozunmasını ve sıralama sırasını kantitatif olarak değerlendirmek için, bozunma oranı, bozunma maksimumu ve Dmax50 değerleri dahil olmak üzere temel bozunma parametrelerini hesaplamak için doz yanıt profilleri kullanıldı. Hücre canlılığı multipleks deneyleri, test edilen konsantrasyonlar için hücre canlılığında herhangi bir kayıp göstermedi.
Bu protokoldeki en önemli adımlar, DMSO kontrolüne normalizasyon yoluyla fraksiyonel RLU veya yüzde bozulmanın belirlenmesidir. Bu protokolü takiben, belirli bir proteinin kaybının hücresel sağlığı veya işlevi nasıl etkileyebileceğini anlamak için fenotipik bir test yapılabilir. Ek olarak, bu HiBiT hücre hatları, NanoBRET teknolojisini kullanarak protein etkileşimlerini veya küçük molekül bağlanmasını incelemek için de kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak canlı hücrelerde protein bozunma kinetiğini nicel olarak tespit etmek için bir yöntem özetlemektedir. Degradasyon parametrelerinin hesaplanması için hız ve Dmax gibi detaylı talimatlar sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Protein bozunması
- CRISPR/Cas9 teknolojisi
Arka Plan
- Protein bozunmasını anlamak, hücre sağlığı için kritik öneme sahiptir.
- CRISPR/Cas9, genetik modifikasyonların hassas bir şekilde yapılmasını sağlar.
- Bozulmayı izlemek, tedavi keşfine yardımcı olabilir.
- Niteliksel yöntemler, bozulma çalışmalarının doğruluğunu artırır.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde protein bozunmasını izlemek için bir protokol geliştirmek.
- Degrader bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağlamak.
- Endojen protein seviyelerinin modülasyonu hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Memeli hücrelerinin belirli yoğunluklarda hazırlanması ve yerleştirilmesi.
- PROTAC bileşiklerinin test için seri seyreltilmesi.
- Bozulmayı ölçmek için ışık yayılımı saptama reaktiflerin kullanılması.
- Lüminans verilerinden bozulma parametrelerinin hesaplanması.
Ana Sonuçlar
- Canlı hücrelerde protein bozunma kinetiğinin başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Bileşikler arasında bozulma tepkimelerindeki önemli farklılıkların tanımlanması.
- Bozulma hızlarının ve maksimum bozulma değerlerinin kantitatif değerlendirilmesi.
- Deneyler sırasında hücre canlılığında herhangi bir kayıp gözlenmedi.
Sonuçlar
- Bu protokol, protein bozunması dinamiklerinin çalışmasını kolaylaştırır.
- Protein kaybının hücresel fonksiyonlar üzerindeki etkisini değerlendirmek için uygulanabilir.
- HiBiT etiketli hücre hatları, protein etkileşimlerinin çalışmasında yararlıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
