HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi
9 Kasım 2020
Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.
Bu yaklaşım, protein bozunmasının hücresel olarak izlenmesine ve bozundurucu bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına izin verir. Bozunma dinamikleri, hücresel bağlamda son derece hassas ve nicel bir şekilde izlenebilir ve bu da temel bozunma parametrelerinin doğru bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. Bu yöntemler, parçalayıcı bileşik aktivitesinin HTS profilinin çıkarılmasına izin vererek, erken terapötik keşif aşamasında triyajı mümkün kılar.
Ayrıca, artan veya azalan endojen hedef seviyelerin modülasyonunu incelemek isteyen herkes için fikir verirler. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda bir araştırma bilimcisi olan Celia Bisbach olacak. Memeli yapışık veya süspansiyon hücrelerini hazırlayarak ve kaplayarak başlayın.
Hücre yoğunluğunu mililitrede 2.22 kez 10 ila 5. hücrelere ayarlayın ve bunları deney ve kontrol koşulu başına en az üç kuyucuk içeren plakalara dağıtın. % 100 DMSO'da 1000x konsantrasyonda seri olarak seyreltilmiş PROTAC veya bozundurucu test bileşik plakaları hazırlayın. Daha sonra hücre kültürü ortamında 10x nihai konsantrasyona seyreltin.
Bileşik olmayan bir DMSO kontrolü oluşturmak için ortama eşit hacimde DMSO ekleyin. Plakadaki hücrelere uygun miktarda 10x bileşiği veya kontrol çözeltisi ekleyin ve plakaları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Son nokta ışıldayan sinyalini ölçmek için, litik tamponun her bir mililitresi için 20 mikrolitre litik substrat ve 10 mikrolitre LgBiT proteini ekleyerek 2x litik algılama reaktifi hazırlayın.
Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere, test edilecek tüm kuyucuklar için yeterli reaktif hazırlayın. Hazırlanan litik tespit reaktifini hücrelere ekleyin ve plakayı bir mikroplaka vorteks karıştırıcı üzerinde 350 RPM'de 10 ila 20 dakika karıştırın. 96 veya 384 kuyulu bir plakayı okuyabilen luminometrede lüminesansı ölçün.
Hücre canlılığı çoğullaması kullanılıyorsa, bunu litik reaktifin eklenmesinden önce yapın. İstenen son nokta ölçümünden 30 ila 40 dakika önce, iki mililitre tahlil tamponuna 10 mikrolitre substrat ekleyerek 6x hücre canlılığı tespit reaktif çözeltisi hazırlayın. Hazırlanan reaktifi kuyucuklara ekleyin ve bir mikroplaka girdap karıştırıcısı üzerinde kısa bir süre karıştırın.
Daha sonra plakayı 37 derecelik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. İstenilen son noktada, floresansı 96 veya 384 kuyu formatında okuyabilen bir cihazda floresanı ölçün. Daha önce tarif edildiği gibi 2x litik reaktif hazırlayın.
Daha sonra reaktifi kuyucuklara ekleyin ve plakayı bir mikroplaka girdap karıştırıcı üzerinde 10 ila 20 dakika karıştırın. Karıştırdıktan sonra, lüminesansı ölçmek için bir luminometre kullanın. Tek konsantrasyon son nokta litik bozunma analizini göstermek için, birkaç CDK hedef proteini endojen olarak HiBiT ile etiketlendi ve pan kinaz sereblon bazlı PROTAC TL12-186 ile muamele edildi.
CDK protein seviyesi farklı zaman noktalarında ölçüldü ve fraksiyonel RLU belirlendi. CDK proteinlerinin protein kaybı açısından doğrudan birbirleriyle nasıl karşılaştırıldığını anlamak için, fraksiyonel RLU'lar toplam bozunma yüzdesi olarak hesaplandı. Kinetik bozunma analizi, BET ailesi üyesi proteinlerin, LgBiT proteinini stabil bir şekilde eksprese eden HiBiT ve HEK293 hücreleri ile endojen olarak etiketlenmesiyle gerçekleştirildi.
Hücreler daha sonra pan-BET PROTAC'ların üç farklı konsantrasyonu ile muamele edildi. Sereblonlu tabanlı dBET6 ve VHL tabanlı ARV-771. Dört farklı moleküler yapıştırıcı bileşiği ile muamele edilmiş LgBiT proteinini stabil olarak eksprese eden Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat hücrelerinin kinetik doz yanıtı bozunma profilleri burada gösterilmektedir.
Bileşikler arasında ve konsantrasyon serileri arasında bozunma tepkisinde önemli farklılıklar gözlenir. Bileşiklerin bozunmasını ve sıralama sırasını kantitatif olarak değerlendirmek için, bozunma oranı, bozunma maksimumu ve Dmax50 değerleri dahil olmak üzere temel bozunma parametrelerini hesaplamak için doz yanıt profilleri kullanıldı. Hücre canlılığı multipleks deneyleri, test edilen konsantrasyonlar için hücre canlılığında herhangi bir kayıp göstermedi.
Bu protokoldeki en önemli adımlar, DMSO kontrolüne normalizasyon yoluyla fraksiyonel RLU veya yüzde bozulmanın belirlenmesidir. Bu protokolü takiben, belirli bir proteinin kaybının hücresel sağlığı veya işlevi nasıl etkileyebileceğini anlamak için fenotipik bir test yapılabilir. Ek olarak, bu HiBiT hücre hatları, NanoBRET teknolojisini kullanarak protein etkileşimlerini veya küçük molekül bağlanmasını incelemek için de kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak canlı hücrelerdeki protein degradasyon kinetiğinin kantitatif olarak tespit edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Hız ve Dmax gibi degradasyon parametrelerinin hesaplanması için ayrıntılı talimatlar sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Protein yıkımı
- CRISPR/Cas9 teknolojisi
Arka Plan
- Protein yıkımını anlamak, hücresel sağlık için kritik öneme sahiptir.
- CRISPR/Cas9, hassas genetik modifikasyonlara olanak tanır.
- Yıkımın izlenmesi, terapötik keşiflere yardımcı olabilir.
- Kantitatif yöntemler, yıkım çalışmalarının doğruluğunu artırır.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde protein yıkımını izlemek için bir protokol geliştirmek.
- Yıkıcı bileşiklerin yüksek kapasiteli taramasını mümkün kılmak.
- Endojen protein seviyelerinin modülasyonuna dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Memeli hücrelerin belirli yoğunluklarda hazırlanması ve ekilmesi.
- Testler için PROTAC bileşiklerinin seri dilüsyonu.
- Degradasyonu ölçmek için lüminesans deteksiyon reaktiflerinin kullanımı.
- Lüminesans verilerinden degradasyon parametrelerinin hesaplanması.
Temel Sonuçlar
- Canlı hücrelerde protein degradasyon kinetiğinin başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Bileşikler arasında degradasyon yanıtlarında anlamlı farklılıkların belirlenmesi.
- Degradasyon hızlarının ve maksimum degradasyon değerlerinin kantitatif değerlendirmesi.
- Deneyler sırasında hücre canlılığında herhangi bir kayıp gözlemlenmemiştir.
Sonuçlar
- Bu protokol, protein degradasyon dinamiklerinin incelenmesini kolaylaştırır.
- Protein kaybının hücresel fonksiyonlar üzerindeki etkisini değerlendirmek için uygulanabilir.
- HiBiT etiketli hücre hatları, protein etkileşimlerini çalışmak için kullanışlıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili hücresel bağlamlarda hedeflenmiş protein degradasyonunun kantitatif ve yüksek kapasiteli değerlendirilmesine olanak tanıyarak, degrader bileşiklerin erken aşama ayıklanmasını destekler. Hedef proteinlerin endojen ekspresyonunu ve regülasyonunu koruyarak, öncü bileşik optimizasyonunda öngörüsel güven sağlar ve keşif süreçlerindeki mekanistik belirsizlikleri azaltır. Bu yaklaşım, bileşik kaynaklı hedef degradasyonunu ölçülebilir fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek "devam/dur" kararlarına doğrudan veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef protein kaybının doğal hücresel ortamlarda doğrudan ölçümü yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fizyolojik regülasyon altında degradasyon kinetiği ve potansiyelini nicelleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Lider bileşiklerin önceliklendirilmesi için degradasyon hızı, Dmax ve DC50 parametreleri oluşturarak portföy ayıklamayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: CRISPR ile mühendisliği yapılmış HiBiT hücre hatları, hedef degradasyonunun lüminesans okuması için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir sistemler sağlar.
- Multipleksleme Kapasitesi: Tarama sırasında spesifik hedef etkilerini sitotoksisiteden ayırmak için hücre canlılığı analizleriyle uyumludur.
- Ölçeklenebilirlik: 96 veya 384 kuyucuklu formatlarda lüminesans sinyal tespiti, degrader bileşik kütüphanelerinin yüksek verimli profillenmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Endojen protein ekspresyonunu ve regülasyonunu koruyarak, in vivo hastalık modelleriyle olan ilgiyi artırır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef degradasyonun fonksiyonel hücresel fenotiplerle korelasyonuna izin vererek, biyobelirteçlerle uyumlu ilerleme kararlarını destekler.
- Öngörücü Güven: Kantitatif degradasyon profillemesi, ilgili hücresel arka planlarda hedef etkileşimini doğrulayarak geç evre başarısızlık riskini azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef belirlemeden sonra ve ön madde optimizasyonundan önce erken keşif iş akışlarına entegre edilerek, bileşik taramaları için degrade edilebilir hücre sistemleri sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücrelerdeki hedef protein degradasyonunun gerçek zamanlı veya uç nokta ölçümüne olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Degrader bileşik kütüphanelerinin yüksek kapasiteli değerlendirmesi için analize hazır, kantitatif çıktılar (hız, Dmax, DC50) sağlar.
- Analitik: Bileşikler arası karşılaştırmaya ve hedef etkileşimine dayalı sıralamaya izin veren normalize edilmiş degradasyon metrikleri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Multiplex canlılık analizleri aracılığıyla hedef degradasyonunu fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek riski ayarlanmış ilerleme süreçlerine bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: HiBiT etiketli hücre hatları, farklı proteinleri veya degradasyon mekanizmalarını hedefleyen birden fazla proje genelinde yeniden kullanılabilir varlıklar olarak hizmet eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef modülasyonunda öngörülebilir güven sağlar, mekanistik belirsizliği azaltır ve fonksiyonel hedef doğrulamasını mümkün kılar.
- Operasyonel Değer: Tarama kampanyaları genelinde analiz standardizasyonunu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Devam/durdur karar kalitesini artırır, sermaye verimliliğini geliştirir ve geç evre biyolojik riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Kantitatif degradasyon profillerine dayanarak degrader öncü bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirmesini ve ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- CRISPR/Cas9 genom düzenleme ve klonal hücre hattı geliştirme konularında uzmanlık gerektirir.
- 96 veya 384 kuyucuk formatında saptama yapabilen lüminesans plak okuyuculara bağımlıdır.
- Kuyucuklar arasında hücre ekim yoğunluğunun ve reaktif hazırlığının standardize edilmesini gerektirir.
- Adaptasyon hususları arasında, hedef proteinlerin değişken endojen ekspresyon seviyeleri ve hücre altı lokalizasyonları yer alır.
- Pratik kısıtlamalar arasında, yüksek miktarda bulunan veya hızlı devir yapan hedef proteinlerdeki sinyal dinamik aralık kısıtlamaları bulunur.
