Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi
16 Ocak 2021
Bu makalede, seyrek matris ekranlarda yeni kristalleşme koşulları oluşturmak için mikrotohumlama kullanarak I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) ile türemiş protein kristalleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Tepsiler sıvı dağıtım robotları kullanılarak veya elle kurulabilir.
Bu, bir protein kristalinin büyümesini optimize etmek için tasarlanmış bir kristalizasyon protokolüdür ve aynı zamanda proteini bir phasing molekülü ile türeterek x-ışını kristalografisi ile bir proteinin yapısını belirler. Tamamen yeni bir proteinin x-ışını kristal yapısını belirlemek için, kristalizasyon koşulları kaliteli kristaller üretmek için optimize edilebiyir. Tamamen yeni bir protein söz konusu olduğunda, türev leştirilmiş bir kristal üretmek için ağır atomların kristalin içine sokulması gerekir.
X-ışını kırınım verileri türemiş kristalden toplanır ve x-ışını kristal yapısı oluşturmak için hesaplamalı olarak çözülmesi gerekir. Kristalizasyon ve türetme hem zahmetli süreçlerdir. Bu darboğazları gidermek için, aynı anda bu hedeflerin her ikisine de ulaşabilen optimize edilmiş bir tarama prosedürü tasarladık.
Bu protokol, rastgele mikrotohum matris taraması olarak bilinen daha önce geliştirilmiş bir teknik kullanır. Kristaller veya kristal çökelti tamamen bağımsız koşullarda kristal büyümesini başlatmak için kullanılabilir mikrotohumlar içine ezilir. Aynı zamanda, kristalizasyon durumuna I3C adı verilen bir phasing molekülü sıyoruz.
Bu molekül, yapının tek bir dalga boyu anormal tartışma phasing tarafından çözülmesini sağlayan büyük bir anormal sinyal sağlar. Kristal yapıların deneysel boyutlandırmasına aşina olmayan kullanıcılar için, I3C'den gelen anormal sinyali kullanacak şekilde uyarlayan yapı çözümünün kısmen otomatikleştirilmesi için kullanıcı dostu bir yazılım hattı saiyoruz. İlk adım bir I3C stok oluşturmaktır.
Mikrosantrifüj tüpüne 120 miligram I3C ölçün. Mikrosantrifüj tüpüne 200 mikrolitre iki molar lityum hidroksit ekleyin. Tüpün 40 ila 60 derecede ısıtılması ve girdapların çözülmesiteşvik edilmesi için kullanılabilir.
Lityum I3C çözeltisinin tek azı lı stoku kahverengi olmalıdır. Protein stoğuna I3C'yi tanıtmak için iki yöntem kullanılabilir. Lityum I3C doğrudan protein stoğuna eklenebilir.
I3C 30 mikrolitre 3.75 mikrolitre protein 150 mikrolitre beş ve 14 milimolar arasında bir konsantrasyon vermek için eklenebilir. Bazı proteinler I3C yüksek konsantrasyonlarda temas üzerine çökelti olabilir. Bu durumlarda, lityum I3C tampon 10 ila 80 milimolar arasında son konsantrasyon için örnek protein eşleşen bir protein seyreltme tampon eklenebilir.
Protein numunesi 150 mikrolitre protein seyreltme tampon 150 mikrolitre ekleyin. Kristalleri ezmek için bir cam sonda bir cam Pasteur pipet yapılır. Mavi alev üzerinde bir Bunsen brülör ile, ortasına doğru Pasteur pipet ısı.
Bir çift cımbız kullanarak Pasteur pipetinin uçlarını 0,3 milimetreden daha az ince çapa çekin. Bu noktada pipet ayırmak ve cam sondabitirmek için pipet ucunu yuvarlak alev bu segment tutun. Bu cam pipet nasıl görünmesi gerektiğini bir örnektir.
Kristal ezilmeler de kendi bir mikrotohum stok yapmak için bir alternatif olarak üçüncü taraf satıcılardan sipariş edilebilir protein kristalleri veya kristal çökelti kadar ezerek oluşturulur. Buz üzerine beş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Bir ışık mikroskobu altında, feda edilebilir en iyi morfoloji kristalleri veya kristal çökelti seçin.
96 iyi kristalizasyon tepsileri için plastik sızdırmazlık bandı keserek kuyuyu açın. Damla tepsileri asılı için, kapak kayma cımbız kullanılarak kaldırılabilir ve düz bir yüzeye ters. 70 mikrolitre rezervuar çözeltisini mikrosantrifüj tüplerinden birine aktarın ve buz üzerinde soğutun.
Kalan tüpleriçin, ona rezervuar çözeltisi 90 mikrolitre aktarın ve soğumaya buz dönmek. Yeterli rezervuar hacmi mevcutsa kristalizasyon haznesi uygun reaktifler karıştırılarak yapılabilir ve bunun yerine kullanılabilir. Cam sondası kullanarak kristalizasyon damla kristalleri çalkalayın iyice ezmek.
Kristal veya kristal malzeme görünmeden ilerleme mikroskop altında izlenebilir. 70 mikrolitre rezervuar çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüpüne sıvının tümünü damladan aktarın. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.
2-3 mikrolitre karışımı kuyuya geri aktarın ve yukarı ve aşağı boru lar ekleyerek kuyuyu durulayın. Karışımı mikrosentrifüge tüpüne geri aktarın. Bu durulama adımı bir kez daha tekrarlanmalıdır.
Mikrosentrifuge tüp mikrotohumları erime önlemek için bu noktadan ileri soğuk tutulmalıdır. Aşırı ısınmayı önlemek için tüpü düzenli olarak buz üzerinde soğutma yaklaşık üç dakika boyunca dört derece maksimum hızda tüp girdap. soğutulmuş rezervuar çözeltileri arasında 10 mikrolitre sırayla aktararak tohum stokunun 10 seri seyreltmebiri olun.
Tohum stok seyreltmeleri arasında tüp girdap olmalıdır. Hemen kullanılmayacak tohum stokları, eksi 80 derece ultra soğuk dondurucuda saklanmalıdır. Bir 96 iyi rasgele mikrotohum matris ekran bir sıvı dağıtım robotu kullanılarak kurulabilir.
Robota tohum stoğunu, I3C ve kristalizasyon ekranı ile takviye edilmiş protein stok çözeltisini yerleştirin. Robot kullanarak kristalizasyon ekranından 96 kuyu tepsisine 75 mikrolitre aktarın. Kristalizasyon damla bir mikrolitre ve rezervuar için 74 mikrolitre ekleyin.
I3C ile desteklenen bir mikrolitre proteini kristalizasyon damlasına aktarın. 0,1 mikrolitre tohum stokunun kristalizasyon damlasına aktarılması. Sızdırmazlık bandı kullanarak plakayı kapatın.
Asılı damla ekranlar 24 iyi asılı damla kristalizasyon tepsileri kurulabilir. Asma damla kuyularının kenarlarını yağlayın. 500 mikrolitre kristalizasyon çözeltisini rezervuara aktarın.
Bir cam kapak slayt merkezi yakınında kristalizasyon çözeltisi bir mikrolitre damla yerleştirin. Bu damla için, lityum I3C ve tohum stok 0.1 mikrolitre ile desteklenen protein bir mikrolitre ekleyin. Kapak kaydırağını ters çevirin ve kapak kaydırağını yağa doğru iterek kristalizasyonu iyice kapatın.
Asılı damla ve sızdırmazlık damla tepsileri kristaller oluşturmak için izin vermek için sabit bir sıcaklıkta kuluçka ya. Kristal büyümesi için düzenli olarak mikroskop altında kontrol edilmelidir. Kırınım verileri elde edildikten, entegre edildikten ve yazılı protokolde açıklandığı gibi ölçeklendirildikten sonra, Faz problemini çözmek ve proteini modellemek için Auto-Rickshaw otomatik kristal yapı belirleme boru hattı kullanılabilir.
Otomatik Çekçek açılış sayfasında devam et düğmesini tıklatın. Kurumsal e-postanızı Auto-Rickshaw web formuna girin ve Auto-Rickshaw'ı çalıştırmaya devam etmek için tıklayın. Homoloji moto şablonu olmayan proteinler için Auto-Rickshaw'Un SAD protokolünü gelişmiş modda çalıştırın.
Gerekli parametreleri girin. Molekül tipi olarak proteini seçin. Angstroms veri toplama dalga boyu girin.
Yani ben de iyot atomlarını göstermek için alt yapı elemanı olarak kullanıldım. I3C'nin phasing molekülü olduğunu belirtmek için I3C alt yapı türünü seçin. Alt yapı belirleme yöntemi olarak sub_direct'yi seçin.
Monomer başına beklenen alt yapıların sayısı olarak üç seçin. Alt yapı aramasının rezervasyon kesimi olarak birini girin. Bu, Otomatik Çekçek'in uygun çözünürlük kesimini otomatik olarak belirlemesine olanak tanır.
Matthews katsayısına göre tek bir monomer, veri kümesinin uzay grubu ve asimetrik birimdeki molekül sayısını girin. İhtiyaçlarınıza uygun uygun x-ışını verilerinin uygun yayma düzeyini seçin. Anormal verileri boş bir ayar dosyası olarak girdi.
Protein dizinizi SEQ, PIR veya TXT dosyası olarak girin. Kurumsal e-posta adresinizi girin. Sonuçlar size verilen e-posta adresine gönderilen bir web bağlantısı üzerinden teslim edilir.
Auto-Rickshaw, alt yapıyı doğrulayan kararlı alt yapısını kullanarak yapıyı çözemezse, sorun giderme yapısı çözümüne yardımcı olabilir. Ağır atom siteleri listesini Auto-Rickshaw sonuçları sayfasından indirin. Ağır atom bölgeleri olarak adlandırılan bir köprüdür.
Bu ağır atom siteleri ile bir metin dosyası indirecektir. Dosyanın dosya uzantısını txt'den pdb'ye değiştirin. Pdb dosyasını Coot'ta açın.
Komşu asimetrik birimlerden gelen tüm ağır atomları görmek için simetriyi açın. Asimetrik birimler arasında da dahil olmak üzere ağır atomlar arasındaki mesafeleri ölçün. I3C altı angstrom bir yan uzunluğu ile eşkenar üçgen olarak görünür.
Bu boyutlara sahip bir üçgenin varlığı, bu ağır atomların yerleşimlerinin doğru olduğunu gösterir. Otomatik Çekçek çalıştırılan alt yapı yanlışsa, diğer Otomatik Çekçek ayarları yazılı protokolde belirtildiği gibi sınanabilir. I3C RMMS yöntemi Hampton Research'ün HT ekranında tavuk yumurtası akı lysozyme ve bakteriyofaj P68'den Orf11 lysin proteininin etki alanı kullanılarak iki protein üzerinde test edildi.
I3C veya mikrotohum olmadan kontrol ekranına karşılık gelen her protein için tam ekran, mikrotohum ekli ekran, I3C ile ekran ve son olarak I3C ve mikrotohum ile ekran kuruldu. Kristal ekrana I3C eklenmesi kristalizasyon isabet sayısını artırmak için görünmüyor. Tavuk yumurtası beyaz lysozyme ile, koşullar sayısı 31'den 26'ya düştü.
Orf11 etki alanı ile tek bir hit durum kontrol ekranında bulundu. Ekrana I3C eklenmesi de aynı koşullarda tek bir hit verdi. Kuyuya mikrotohum eklenmesi, sırasıyla tavuk yumurtası beyaz lızme ve Orf11 etki alanı için 2,1 ve altı kat artışla sonuçlanan isabet koşullarının sayısında önemli bir artışa yol açtı.
Bu sonuç, RMMS'yi test etmek le diğer çalışmalarla tutarlıdır. En önemlisi, i3C ve mikrotohum bir ekrana ekleyerek de tavuk yumurtası beyaz lysozyme ve Orf11 etki alanı için 2.3 ve yedi kat artış gösteren kontrol ekranına göre isabet koşulları nın sayısını artırdı. Bu, I3C RMMS yönteminin türev kristaller için verimli bir şekilde yeni koşullar üretebileceğini göstermektedir.
Bu koşullardan elde edilen kristaller hasat edilebilir ve kristal yapısını çözmek için kullanılabilir. Tavuk yumurtası beyaz lysozyme Orf11 etki alanının yapısı, I3C RMMS ekranı ile başarılı bir türetme gösteren I3C'den gelen anormal sinyal kullanılarak, Otomatik Çekçek boru hattında SAD kademeli olarak çözülebilir. Biz phasing molekülÜ I3C ile türev yüksek kaliteli kristaller üretmek için basit ve verimli bir protokol sunduk.
Bu ekranların sayısını ve kristal işleme adımları en aza indirir, ve böylece yeni proteinler ilerken yapısal biyologlar için özel ilgi çekicidir. Tohum stok uyraması sırasında yapılan farklı tohum stok seyreltmelerini test ederek kristal boyutunu optimize etmenizi şiddetle tavsiye ediyoruz. Ve bu adım ilk ekranlar yapıldıktan sonra tamamlanır.
I3C yaygın olarak kullanılabilir ve satın almak için ucuz ve bu nedenle bu yöntemin en yapısal biyoloji laboratuvarları ulaşabileceği nde olduğuna inanıyoruz.
Genel Bakış
Bu makale, protein kristallerinin büyümesini optimize ederken onları x-ışını kristalografisi için I3C ile türevlendiren bir kristalizasyon protokolü sunar. Yöntem, kristalizasyon koşullarını geliştirmek için rastgele mikrotohum matris taraması kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein kristalizasyonu
- X-ışını kristalografisi
- Strüktürel biyoloji
Arka Plan
- Kristalizasyon, protein yapılarını belirlemek için gereklidir.
- X-ışını kristalografisinde fazlama için ağır atomlarla türevlendirme gereklidir.
- Geleneksel yöntemler emek yoğun ve zaman alıcı olabilir.
- Mikrotohumlama teknikleri kristalizasyon sonuçlarını iyileştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Protein kristalizasyonu ve türevlendirme için optimize edilmiş bir protokol geliştirmek.
- X-ışını yapı tayini için fazlama molekülü olarak I3C'yi tanıtmak.
- Yapı çözümü için kullanıcı dostu bir yazılım boru hattı sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- I3C stok çözeltilerinin hazırlanması.
- Mikrotohum oluşturmak için protein kristallerinin ezilmesi.
- Sıvı dağıtım robotları kullanarak kristalizasyon ekranlarının kurulması.
- Kristal büyümesinin izlenmesi ve koşulların optimize edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Türevlendirilmiş protein kristallerinin başarılı bir şekilde üretilmesi.
- Mikrotohumlama ile iyileştirilmiş kristalizasyon koşulları.
- X-ışını kristalografisinde fazlama için I3C'nin etkili kullanımı.
- Yapı çözme sürecinin bazı bölümlerinin otomasyonu.
Sonuçlar
- Protokol, protein kristalizasyonunun verimliliğini artırır.
- Mikrotohumlama, elde edilen kristallerin kalitesini önemli ölçüde iyileştirir.
- I3C, yapısal belirleme için etkili bir fazlama maddesi olarak işlev görür.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
