Name: Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin, canlı görüntüleme için Drosophila larva beyinlerini fibrin pıhtılarıyla hareketsiz hale getirme yöntemini. Trombin ile polimerizasyon indüklenerek örnek kayması en aza indirilir ve sinirsel süreçler dinamik olarak gözlemlenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Januschke laboratuvarındaki çalışmalar Wellcome trust grants 100031/Z/12/A ve 1000032/Z/12/A tarafından desteklenmektedir. Doku görüntüleme tesisi Wellcome'dan WT101468 hibesi ile desteklenmektedir.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li>
<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html">http://bradbusse.net/sciencedownloads.html</a> (2011).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
<li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879(2012).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tüm D. melanogaster larva beyinlerinin canlı görüntülenmesi, fizyolojik bir bağlama yakın koşullarda asimetrik nöral kök hücre bölünmelerini gözlemleme fırsatı sağlar. Protokolümüzün ilk bölümü larva beyinlerinin diseksiyonu konusundaki yaklaşımımızı tanıtıyor. Daha önce belirtildiği gibi13Hazırlığın kritik bir yönü beyne zarar vermekten kaçınmaktır. Bunun en zorlu yanı, beyni aşırı çekmeden komşu hayal disklerinden ayırmaktır. "Çekmeden kesmeye" yaklaşımımız, bir çift tokanın uçlarıyla bir taşlama hareketi yapmak veya dokular arasındaki bağlantıyı tutan diğer ikips ucu boyunca bir tokmak ucu kaydırmaktır (Şekil 1A) oysa Lerit ve ark. bir diseksiyon pimi ile testere benzeri hareketleri tanımlar. Deneyciye tüm yaklaşımları denemesini ve kendileri için en uygun olanı benimsemesini tavsiye ediyoruz. Ayrıca izole edilmiş beyinleri aktarmak için diseksiyon araçları yerine BSA veya FCS kaplı pipet uçları kullanmanızı öneririz. Kaplama, dokuların plastiğe yapışmasını önler ve dokuların güvenli bir şekilde aktarılmasını sağlarken, aktarım sırasında diseksiyon aracına yapıştıkları için olası bir geçici deformasyona maruz bırakmadan her zaman tamamen daldırmalarını sağlar. Kaplanmış uçlar, aynı anda birkaç beynin transferine izin vermek için başka avantajlara sahiptir, bu da örneklerin belirli bir ortamdaki ikamet süresini kontrol etmek için kritik olduğunda özellikle yararlıdır; diğer dokuların, hatta kırılgan olanların, örneğin yağ kütlelerinin transferi için uygundurlar; daha büyük uçlar kullanarak veya ucun ekstremitesini keserek çok çeşitli farklı numune boyutlarına uyum sağlayabilirler.
Daha sonra, bu protokol, bir kültür yemeğinin kapaklarında larva beyinlerini hareketsiz hale getirmek için Fibrinojen pıhtılaşmasının kullanımını açıklar. Bir beyin bir damla kültür ortamı + Fibrinojen içinde yönlendirilir, daha sonra Trombin ilavesi ile pıhtılaşma indüklendi. Fibrin oluşumu kademelidir ve gerekirse numunenin yönünün ince ayarlanabileceği bir zaman aralığı sağlar (Şekil 2C). Örneğin hafif bir sıkıştırması gerekiyorsa - larva beyinleri durumunda karşı tavsiye ettiğimiz - ayrıca 3.4.4 ve 3.5.2 adımları sırasında pıhtıya az çok numuneye yakın bastırılarak ince bir şekilde ayarlanabilir. Bu Fibrinojen pıhtılaşmasının, beyinlerin gaz geçirgen bir zar ve bir kapak kılıfı arasına monte edildiği Lerit ve ark.'da açıklanan protokole göre pıhtılaşmasının ana avantajı, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneğidir. Protokolümüz üzerinde gaz geçirgen bir membran kullanmanın olası bir avantajı, beyinler pıhtı ve bazı ortamlar tarafından havadan ayrıldığı için yaklaşımımızla daha sınırlı olabilecek numunelerin optimal bir oksijenlenmesini sağlaması olabilir. Bu nedenle, kültür çanağı içindeki kültür ortamı miktarının etkisini değerlendirmemiş olsak da, pıhtıları tamamen daldırırken pıhtıların üstündeki kültür ortamı miktarını sınırlamayı öneriyoruz.
Pıhtıların manipülasyonu deneysel olarak zor ve zaman alıcı olabileceğinden, deneycinin ilk olarak pıhtıları örneksiz manipüle etmeyi uygulamasını öneririz. Kapakta kültür ortamı + Fibrinojen damlasının hacminin modüle edilmesi, Fibrinojen konsantrasyonu veya Trombin hacmi ve konsantrasyonu, hazırlığı kolaylaştırmaya yardımcı olabilir ve protokolü diğer doku türlerine uyarlarken önemli olabilir. Pıhtıları manipüle etme konusunda yeterli deneyime sahip olan birkaç beyin, gerekirse bir pıhtıda hareketsiz hale getirilebilir, ancak oryantasyonun ince ayarını zorlaştırır. Kapakta birkaç pıhtı oluşabilir, örneğin farklı genotiplerin görüntü örneklerine izin verir. Aynı kapak üzerindeki farklı pıhtıları farklı kültür ortamlarına maruz bırakmak da mümkündür, ancak farklı pıhtıları kaplayan kültür ortamı damlalarını asla karıştırmamaya özen gösterilmelidir. Larva beyinleri hareketsiz hale geldikten ve canlı görüntülemeye hazır hale geldikten sonra, aşırı fotodamajdan kaçınmak içinLerit ve ark. Bu önerilere sadece bir sahne inkübatörü ile canlı görüntüleme sırasında beyinleri 25 °C'de tutmak için değil, aynı zamanda görüntüleme başlamadan önce bu aşamayı en az 30 dakika önceden ısıtmak için de ekliyoruz. Elimizde, bunu sistematik olarak yapmamak güçlü bir odak kaymasına neden olur.
İlişkili mikroskopi yapabilmek ve canlı görüntülemeden sonra bir örneği düzeltebilmek ve immün yetisini düzeltmek bazı bağlamlarda avantajlı olabilir. Bununla birlikte, Fibrin pıhtılarını kullanmanın bir sınırlaması, bir beyni zarar vermeden bir pıhtıdan mekanik olarak izole etmenin neredeyse imkansız olmasıdır. Bu sınırlamayı aşmanın olası bir yolu, Plasmin ile Fibrin pıhtılarını bozmak veya Fibrin polimerizasyonuna izin vermek için düğmeleri taklit eden bir peptit eklenerek pıhtı sökülmesine neden olacak yöntemler geliştirmek olabilir28. Fibrin pıhtılarını tipik olarak tek hücreden 200 μM uzun dokuya kadar değişen örneklerde kullanırız, ancak 3 mm genişliğindeki yetişkin bombus arılarından pıhtılarda ve görüntü beyinlerinde de başarılı bir şekilde hareketsiz hale gelebiliriz. Pıhtılarda hareketsiz hale getirilebilen numune boyutunun üst sınırı belirlenmeye devam etmektedir. Benzer şekilde, genellikle hareketsiz örnekleri 4 ila 5 saat boyunca görüntülesek de, nöroblastları birincil kültürde 3 güne kadar başarıyla görüntüledik, bu da pıhtının en azından daha uzun süreli canlılığa engel olmadığını gösteriyor. Aksine, pıhtılar, bu amaç için peristaltik pompalar gibi cihazlara ihtiyaç duymadan, daha uzun süreli görüntüleme için bir gereklilik olan ortamın düzenli olarak değiştirilmesini kolaylaştırabilir. Fibrin pıhtılarının geçirgenlik parametrelerini ölçmemiş olsak da, pıhtıların lifli jel benzeri doğası hücre geçirgen molekülleri tarafından penetrable gibi görünmektedir. Latrunculin A, Colcemid veya 1-NAPP1, HALO etiketli ligandların ve hücre biyolojisinde kullanılan diğer standart boyaların fibrin pıhtısındaki hücrelere sorunsuz bir şekilde ulaştığını ve şimdiye kadar pıhtı tarafından tutulacak moleküllerle karşılaşmadığını, bunun da ampirik olarak test edilmesi gereken bir olasılık olduğunu bulduk.
Sonuç olarak, Fibrin pıhtılarının kullanılması, canlı görüntüleme için canlı dokuları hareketsiz hale getirmek için güvenilir ve nispeten kolay bir uygulama yolu sağlar. Yanal sürüklenmeyi sınırlamadaki kullanışlılığının ötesinde, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneği, D. melanogaster nöroblastlarının asimetrik hücre bölümünü incelemeye yönelik kimyasal genetik yaklaşımımız için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır21. Bu tekniğin, özellikle kimyasal genetik veya örneğin protein kendi kendini etiketleme29içeriyorsa, çok çeşitli farklı dokulardaki çalışmalara faydalı olacağını öngörüyoruz.
MultiHyperStackReg makromuz, ardışık çerçeveleri veya yığın dilimlerini hizalayan TurboReg ImageJ eklentisine ve dönüşümleri diğer yığınlara uygulamaya izin veren MultiStackReg ImageJ eklentisine dayanır. MultiHyperStackReg, bu dönüşümleri hipertacklara (en az dört boyutlu yığınlar) uygulamak için izin verir. MultiHyperStackReg kullanımı, açıkladığımız gibi, çok fazla eylem gerektirir ve oldukça zaman alabilir, ayrıca 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklanan tüm adımları otomatik olarak gerçekleştiren AutoHyperStackReg makrosunu yazdık. Ancak, MultiHyperStackReg aksine, AutoHyperStackReg şu anda bu yığının bir alt bölgeye dayalı bir yığının hizalamasını hesaplama imkanından yoksundur, bulduğumuz bir seçenek bazen tatmin edici bir hizalama için çok önemlidir. AutoHyperStackReg'in başka bir sınırlaması, kullanımının TurboReg ve MultiStackReg tarafından önerilen diğer dönüşümlerle değil, çevirilerle sınırlı olmasıdır, oysa MultiHyperStackReg, kullanıcının ihtiyaç duyması durumunda herhangi bir dönüştürme türüne bir hiperstack için geçerli olabilir. Gelecekteki sürümler bu işlevleri uygulayacak ve GitHub30. Son olarak, dönen linescan makromuz, korteks zaman içinde konumunu veya yönünü değiştirse bile, kortikal sinyalleri zaman atlamalarında hızlı bir şekilde ölçmenin kolay bir yolunu sağlar. İzleme modunun veya takip etmeme modunun analiz için en uygun olup olmadığı kortikal sinyalin kalitesine ve tutarlılığına bağlıdır. Kullanıcının her zaman noktası için korteksin nerede olacağını düşünmesi gerekmediğinden ve zaman içinde büyük konum ve yönelim değişikliklerine uyum sağlayabildiğinden, izleme modunun kullanımı daha kolaydır. Bununla birlikte, kortikal sinyal tüm film boyunca algılama için yeterince güçlü kalırsa uygundur: korteksten başka bir şeyin algılanmaması (örneğin, kortekse yakın parlak bir sitoplazmik bölme) aşağıdaki her zaman noktası için algılamayı tehlikeye atabilir (örneğin, sitoplazmik bölme korteksten uzaklaşır ve kortikal çizgiler onu geri kalan süre boyunca takip edebilir). Algılama, kullanıcı tarafından başlangıçta çizilen çizgiyle sınırlı olduğundan (örneğin, parlak bir sitoplazmik bölme algılamanın birkaç zaman noktası için başarısız olmasına neden olabilir, ancak sitoplazmik bölme algılama bölgesinden uzaklaştıkça, korteksin doğru tespiti devam ederse) bu tuzak yoktur, ancak korteks konumu veya oryantasyonu zaman içinde çok değişirse iyi davranmaz. İzleme modu için geliştirilecek bir sonraki özellik (GitHub30'damevcut olacak), yalnızca belirtilen zaman noktalarını analiz etme ve algılamanın gerçekleştirileceği ve daha sonra kullanıcının en azından sorunlu zaman noktalarından kaçınmasını sağlayacak bir referans zaman noktası (ilk zaman noktası yerine) tanımlama seçeneği olacaktır.

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemi olmaya devam ediyor ve onlarca yıldır birçok disiplinde bilginin ilerletilmesinde başarılı oldu. Özellikle öne çıkmasını sağlayan bir özellik, özellikle canlı görüntüleme için çok uygun olmasıdır. Hücre altı süreçleri veya hücre ve dokuların davranışlarını gerçek zamanlı olarak izleme yeteneği, hücre ve gelişim biyolojisi ile ilgili temel kavramların üretilmesine katkıda bulunmaya devam eder. Bu tür Drosophila örneklerini canlı ve sağlıklı tutmak için farklı gruplar tarafından birçok başarılı protokol geliştirilmiştir. Hayal diskleri 1 ,2, larva beyni3,4,5,6veya yetişkin dişilerin yumurta odaları 7 ,8,9veya yetişkin bağırsak10 gibi sinekten organlar ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir. Canlı görüntüleme için önemli bir zorluk, numunenin mekanik darbelere duyarlı olabilecek numune bütünlüğünden ödün vermeden optimum çözünürlük ve hareketsizlik için görüntüleme yüzeyine yakın tutulmasını sağlamaktır. Drosophila larva beynindeki nöroblastlar veya nöronlar olarak adlandırılan nöral kök hücreleri incelemek için, örneğin, örneklerin görüntüleme yüzeyine yakın tutulması, mühürlü görüntüleme odalarında kültür ortamı ile kaplanarak elde edilebilir11,12,13. Bununla birlikte, bu yaklaşım medya değişimine kolayca izin vermez, böylece manevra için deneysel alanı sınırlar. Alternatif olarak, numuneler hazırlanabilir ve hücrelerin yapışıklıklarını artırmak ve açık kültür yemeklerinde çok noktalı ziyaret mikroskopisine ve genişletilmiş canlı hücre görüntülemesine izin vermek için tedavi edilen kapaklara yerlenebilir, potansiyel olarak medya değişimine izin verir, ancak medya değişimi sırasında örnek sürüklenmesini veya kaybını önlemek için kolay araçlar sağlamaz14,15.
Fibrin pıhtı yöntemi başlangıçta canlı vinç-sinek spermatositleri16 meiosis incelemek için geliştirilmiştir bu sorunların üstesinden gelmek için özel olarak uygundur. Fibrinojen ilgili kültür ortamında çözülür, Thrombin eklenmeden önce bu çözeltinin bir damlasına yerleştirilen ve yönlendirilen numuneler, çözünmeyen bir Fibrin pıhtısının, cam yüzeye yapışan yapışkan lifli bir ağın ve numunelerin kültür ortamına erişimini sağlarken hızlı bir şekilde oluşmasına neden olur. Ortam daha sonra pıhtı veya numune pozisyonuna zarar vermeden değiştirilebilir. Görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi, örneğin, inhibitörlerin orijinal yöntemde olduğu gibi eklenmesi veya yıkama veya nabız kovalama deneyleri için veya hücreleri ve dokuları yerinde tutarken canlı hücre görüntüleme sırasında floresan boyaların eklenmesi gerektiğinde arzu edilir. Fibrin pıhtıları Drosophila dokularının yanı sıra bireysel hücrelerin görüntülenmesi için uygundur13,17. Fibrin pıhtıları, şekilleri veya diğer özellikleri nedeniyle normalde Fibrin pıhtısı içindeki örnek konumunu ve pıhtının şeklini modüle ederek istenen şekilde yönlendirilmeyecek olan örnekleri yönlendirmeye yardımcı olmak için daha fazla kullanılabilir.
Burada mevcut Fibrin pıhtı bazlı görüntüleme yöntemlerimiz hakkında bir güncelleme sunuyoruz ve segmentasyon tabanlı görüntü analizi için araçlar sağlıyoruz ve gelişmekte olan sinek beynindeki nöroblast bölünmelerini incelemek için bu yöntemin kullanımına odaklanıyoruz. Aynı kültür çanağındaki farklı pıhtılarda birden fazla örneği takip etmek için rutin olarak Fibrin pıhtı yöntemini kullanıyoruz. Bu, i) merkezkant davranış veya mRNA lokalizasyonu canlı18,19gibi hücre altı olayların görüntülenmesini sağlar, ii) çok noktalı ziyaret kullanarak aynı görüntüleme ayarları altında farklı genotiplerin farmakolojik tedavisi üzerine örneklerin davranışını izlemek mikroskopi20, iii) enzimlerin akut inhibisyonunun etkilerinin incelenmesi21 ve iv) hedeflenen lazer-ablasyon üzerine hücrelerin fizyolojik ortamlarındaki hücre bölünmesinin yöneliminde meydana gelen değişiklikleri incelemek için sürüklenmeyi en aza indirmek22. Trombin ve Fibrinojen ve Fibrin pıhtısının istenmeyen etkilerinin her örnek için ampirik olarak test edilmesi gerekirken, Bu yöntem prensip olarak canlı hücre görüntüleme ile analiz edilecek her türlü örneği hareketsiz hale getirmek için uygundur ve Drosophila'da nöroblast biyolojisinin5,19,2'ninbirden fazla yönünü incelemek için başarıyla kullanılmıştır. 0 , aynı zamanda kadın mikrop hattı kök hücrelerinin sitosensör projeksiyonlarının dinamikleri23 ve Drosophila dişi yumurta odalarının folikül hücrelerinin akut aPKC inhibisyonu üzerine polaritedeki değişiklikler21.
Zaman atlamalı floresan görüntüleme, bu nicel bilgileri ayıklamak için yöntemler gerektiren karmaşık zaman çözümlenmiş 3D veri kümelerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Burada, Drosophila larva beyinlerinin nöroblastlarında veya birincil hücre kültüründeki bireysel nöroblastlarda kortikal proteinleri ölçmek için geliştirilen hücre korteksinde çok kanallı floresanların yarı otomatik olarak ölçülmesine izin veren hiperstacks ve özel yapım ImageJ makrolarında sürüklenmeyi düzeltmek için kullanılabilecek ImageJ tabanlı24 makronun daha da geliştirilmesini açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Albümin sığır serumu, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, hücre kültürü için uygun</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plazmasından</td> <td>fibrinojenSigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Hücre Kültürü Kabı - 35mm, 23 mm kuyu</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex nokta plakası, dokuz çöküntü ile</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider'in Böcek Ortamı</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından trombin</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

canlı görüntüleme İçin fibrin pıhtıları ile drosophila dokularının hareketsiz hale getirilmesi uygulamaları

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemidir. Sineğin farklı gelişim evrelerinden gelen imaginal diskler, yetişkin dişilerin larva beyni veya yumurta odaları veya yetişkin bağırsağı gibi çeşitli organ ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir, bu da hücre ve gelişim biyolojisi hakkında değerli içgörüler sağlar. Burada, Drosophila larva beyinlerinin diseksiyonu için mevcut protokolümüzü ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve daha sonra Fibrin pıhtılarını kullanarak larva beyinlerini ve diğer dokuları bir cam örtü üzerinde hareketsizleştirmek ve yönlendirmek için mevcut yaklaşımımızı sunuyoruz. Bu hareketsizleştirme yöntemi sadece Fibrinojen ve Trombin'in kültür ortamına eklenmesini gerektirir. Aynı kültür çanağındaki birden fazla numunenin ters mikroskoplarında yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için uygundur, çok noktalı ziyaret mikroskopisinde mikroskop aşamasının hareketlerinden kaynaklanan yanal sürüklenmeyi en aza indirir ve görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesini ve çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, sürüklenmeyi düzeltmek ve zaman atlamalı analizden belirli nicel bilgileri ayıklamak ve işlemek için rutin olarak kullandığımız özel yapım makrolar sunuyoruz.

Drosophila dokularının Fibrin pıhtıları ile hareketsiz hale getirilmesi ve canlı görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi. Adım 2 ' de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra (Şekil 1) ve adım 3 ' te sunulan prosedürü takiben aynı kapaktaki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale geldikten sonra (Şekil 2), GFP etiketli Bazukayı (Baz::GFP) ifade eden larva beyinleri, polarite proteini Par-3'ün sinek ortezi, zaman atlamalı çok konumlu konfokal görüntülemede 30 dakika boyunca görüntülenmiştir. Baz::GFP, küçük ATP analogu 1-NAPP120'nineklenmesiyle atipik protein kinaz C'nin (aPKC) akut inhibisyonunu sağlayan bir alele olan apkcas4ile birleştirilir. 1-NAPP1 bu nedenle 4. Kinaz aPKC'nin vahşi tip bir versiyonunu taşıyan kontrol beyinleri ATP analoguna tepki vermemişken, ek olarak aPKC'nin(apkcas4) analoga duyarlı bir mutasyonu taşıyan beyinler, nöroblastlarda ve soylarında Baz'ın nöroepithelium ve parlak kümelerinde bir kasılma gösterdi (Şekil 6, Video 1). Nöroblastlar zaman atlamalı boyunca bölünmeye devam eder, bu da dokunun sağlıklı kaldığını gösterir ve beyinler kültür orta değişimine rağmen çok az sürüklenme gösterir, bu da iyi hareketsiz olduklarını gösterir. Benzer şekilde,27'de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra, Baz::GFP ifade eden ovarioles aynı kapak üzerindeki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale getirildi ve 8 dakika boyunca görüntülendi, daha sonra 1-NAPP1 uygulaması apkcas4 mutant foliküler hücrelerin kasılmasına neden oldu, ancak kontrollerin değil (Şekil 7, Video 2).
MultiHyperstackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Hem yanal hem de netleme sürüklenmesini gösteren bir hiperstack(Video 3, sol panel) önce yanal sürüklenme için düzeltildi (adım 6.2, Şekil 3, Video 3, orta panel), daha sonra MultiStackReg eklentisi ve MultiHyperstackReg makrosu kullanılarak odak kayması (adım 6.3, Şekil 4, Video 3 , sağ panel) orijinal hiperstack'te gözlenen hareketlerin önemli ölçüde azalmasına neden oldu.
Dönen hatlar kullanılarak kortikal sinyal ölçümü Baz::GFP (yeşil) ve kızılötesi floresan protein (CD4::mIFP, kırmızı) ile etiketlenmiş transmembran protein CD4'ü ifade eden bir nöroblast bir mitoz sırasında görüntülendi. CD4::mIFP sinyali, nöroblastın çeşitli bölgelerindeki korteksi lineskanlarla (adım 7, Şekil 5, Şekil 8A–C)tespit etmek için referans olarak kullanıldı ve Baz::GFP sinyali tespit edilen konumlarda ölçüldü Şekil 8D). Bölünmeleri sırasında, nöroblastlar farklı ve zıt kortikal alanlar oluşturarak geçici olarak polarize oldular: apikal kutup ve bazal kutup. Baz, apikal kutbu tanımlar ve sürekli olarak, Baz::GFP sinyali nöroblastın apikal kutbunda arttı ve bölme sırasında bazal kutupta azaldı (Şekil 8C,D). Korteksin konumu zaman atlamalı boyunca tatmin edici bir şekilde izlendi (Şekil 8C, Video 4). Drosophila çizgileri ve genotipleri Ek Tablo 1–2'debaşvurulmaktadır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Şekil 6: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz larva beyinlerine ATP analogunun uygulanması. (A) Baz::GFP'yi ifade eden iki larva beyninin canlı görüntülenmesi aynı kapakta hareketsiz hale getirilir. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol beyinleri ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKCAS4)analog hassas mutasyonu taşıyan beyinler nöroblastlarda ve soylarında nöroepithelium (ok uçları) ve parlak Baz kümelerinin daralmasını gösterir. 23 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. (B) Nöroepithelium büyütme. Ölçek çubuğu: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Şekil 7: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz yumurta odalarına ATP analogunun uygulanması. Baz::GFP'yi aynı kapak kapağında hareketsiz olarak ifade eden iki yumurta boyunun canlı görüntülenmesi. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol yumurtası odaları ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKCAS4)analog hassas mutasyonu taşıyan yumurta odaları, sonunda yapışan kavşakların belirgin bir şekilde bozulmasına yol açan epitelin (ok uçları) bir daralmasını gösterir. 27 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Şekil 8: Dönen çizgikanlar kullanılarak kortikal sinyalin ölçümü. (A) Baz::GFP (yeşil) ve CD4::mIFP (kırmızı) ifade eden canlı D. melanogaster nöroblast. Siyan çizgileri: ilk tarama hatları, ölçmek için dik olarak çeşitli kortikal bölgelere kadar izlendi. Ölçek çubuğu: 5 μM. (B) Kortikal çizgiler kullanılarak korteksin (koyu mavi çizgi) tanımlanması ve referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı). Siyan çizgisi: korteks algılamadan sonra sinyalin ölçüldüğü "Etrafında ölç" parametresi (burada, 2 piksel) ile tanımlanan alan. Ölçek çubuğu: 2 μm. (C) Siyan: referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı) kullanılarak (A) görüntülenen ilk tarama çizgilerinden dönen linescans yöntemi ile nöroblast bölünmesi sırasında tanımlanan kortikal alanlar. Ölçek çubuğu: 5 μM. Ok: apikal kutup. Ok ucu: bazal direk. (D) Baz ölçümü::GFP sinyal yoğunluğu zaman içinde görüntülenen dönen linescans tarafından tanımlanan karşılık gelen iki bölgede (C). Mitoz sırasında Baz::GFP, nöroblastın apikal kutbunda geçici olarak zenginleşir ve karşı bazal kutuptan tükenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz larva beyinlerine medya değişimi uygulaması, Şekil 6'dasunulan ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz yumurta odalarına medya değişimi uygulaması, Şekil 7'desunulan ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 3: MultiHyperStackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Membran probu PH::GFP'yi ifade eden bir nöroblastın canlı görüntülenmesi. Xy: tek odak düzlemi. Xz: ortogonal reslice. Sol: sürüklenmenin düzeltilmesinden önce. Orta: yanal sürüklenmenin düzeltilmesinden sonra. Sağ: Yanal ve odak sürüklenmesini düzeltdikten sonra, ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 4: Şekil 8,ölçek çubuğu: 5 μm'de sunulan dönen çizgikanlar kullanılarak korteksin algılanmasını, <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">lütfen bu videoyu indirmek için buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Görüntülenmiş Drosophila dokularının genotipleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 2: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 1: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Kodlama Dosyası 2: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 3: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Bu protokol, fibrin pıhtıları kullanılarak numune immobilizasyonunu tanımladı. Numuneler, bir örtü astarının yüzeyinde bir damla fibrinojen içeren kültür ortamına aktarılır, ardından trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir. Bir diseksiyon mikroskobu altında, L3 larvalarını PBS içeren dokuz kuyulu borosilikat cam bir tabağa aktarmak için bir fırça kullanın.Sinek yeminin çoğunu larvalardan ayırmak için karıştırın ve başka bir iyi içeren kültür ortamına aktarın. Vücut uzunluğunun ortasındaki bir larvayı tüm çapı boyunca kavramak için forseps kullanın ve 200 mikrolitre taze kültür ortamı içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarın. Larvaları serbest bırakmayın.Larvayı tüm çapı boyunca ikiye bölmek için, ya penseps uçlarının yanal hareketi ile kavranan alanı zımparalayın ya da larvaları tutan iki forseps ucu arasında başka bir forseps çiftinin bir ucunu kaydırın. Larvaları kütikülünden tutmak için forseps kullanın ve beyni çekmeden kütikülü soymak için başka bir forseps kullanın. Beyinden çıkan sinirler görünene ve beyni ağız kısımlarına bağlayan organlara ulaşılabilene kadar bu işlemi tekrarlayın.Beyinden çıkan sinirleri forseps ile tutarken diğer çift forseps ile beynin ağız kısımlarına olan bağlantısını keserek beyni kütikülün geri kalanından ayırın. Beyni ventral sinir kordonundan çıkan aksonlardan tutun ve çevredeki organları nazikçe beyinden çekerek koparın. Daha sonra diğer forseps çifti ile göz hayal diskleri ile beyin arasındaki bağlantıyı kavrayın ve bu bağlantıyı beyni çekmeden kesin.Beynin diğer dokulardan uygun şekilde temizlendiğinden ve hasar görmediğinden emin olun. Hasar belirtileri gösteriyorsa beyni atın. Pipet ucunu kaplamak için kaplama solüsyonunu bir P20 ile içeri ve dışarı pipetleyin, ardından beyni kaplanmış uçla üç mikrolitre ortamla birlikte aspire edin ve 200 mikrolitre temiz kültür ortamı içeren başka bir kuyucuğa pipetleyin.Yeterli beyin diseke edilene kadar bu işlemi tekrarlayın, bazen diseksiyonların yapıldığı kuyunun kültür ortamını değiştirin. Diseke beyinleri 200 mikrolitre kültür ortamı ve fibrinojen içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarmak için kaplanmış uçlu bir P20 pipeti kullanın. Dokuz mikrolitre kültür ortamı ve fibrinojen ile birlikte bir beyni aspire edin.Ucun ucu hücre kültürü kabının kapak camının alt kısmına neredeyse değecek şekilde, içeriği, kültür ortamı pipet ucundan çıktıktan hemen sonra kapak fişine değecek şekilde pipetleyin. Beyni kültür ortamı ve fibrinojen damlası içinde nazikçe itmek ve konumlandırmak için bir çift forsepsin bir ucunu veya kapalı bir forseps çiftini kullanın. Beynin ventral kısmının görüntülenmesi gerekiyorsa, beyni pıhtı içinde düzgün bir şekilde yönlendirmek için fibrinojen pıhtılaşmasını indükleyin.Beyni damlanın bir tarafına itin. Pipet ucuyla beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve bir mikrolitre trombin ekleyin. Fibrinojenin polimerleşmeye başlaması için bir ila iki dakika bekleyin, bu da damlanın bir tarafında bulanık bir çökelti oluşumuna neden olur, ardından beyni nazikçe itin ve fibrin pıhtısına sokun, ventral tarafın mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun.Fibrin pıhtısına sıkışmamış beynin yan tarafına yakın bir mikrolitre trombin solüsyonu pipetleyin. İkinci fibrin pıhtısının sertleşmesi için iki ila üç dakika bekleyin, ardından beynin deforme olmamasına dikkat ederek kapak kaymasına daha güçlü bir şekilde yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın. Beyin, kapak kaymasından çok uzakta görünüyorsa, fibrin pıhtısını beyne yaklaştırarak yaklaştırın.Beynin dorsal kısmını görüntülemek için fibrin pıhtısını indüklemek için, beyni damlanın merkezine, sırt kısmı kapak kaymasına bakacak şekilde konumlandırın. Bir P2 pipeti kullanarak, pipet ucuyla beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve bir mikrolitre trombin pipetleyin. Fibrinojenin polimerleşmeye başlaması için iki ila üç dakika bekleyin, bu da bulanık bir lifli çökelti oluşumuna neden olur, ardından beynin deforme olmamasına dikkat ederek örtü kaymasına daha güçlü bir şekilde yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın.Ucun ucu pıhtının yaklaşık 0,5 santimetre üzerine yerleştirilmişken, pıhtının üzerine fibrinojen içermeyen 390 mikrolitre kültür ortamını nazikçe pipetleyin. Kültür ortamını pıhtının yanlarına eklemeyin, çünkü bu, onu kapak fişinden ayırabilir. Fazla trombini yıkamak için, tabaktan 300 mikrolitre çıkarın, ardından 300 mikrolitre temiz kültür ortamı ekleyin ve pıhtıların tamamen daldırıldığından emin olun.Odak değişikliklerine neden olan sıcaklık değişikliklerini önlemek için, reaktiflerle birlikte çözeltiyi kültür kabı ile aynı sıcaklıkta tutun. Tabağın kendisini yerinden çıkarmadan kültür kabının kapağını çıkarın. Daha kolay çıkarmak için, görüntülemeden önce 35 milimetrelik tabağın kapağını tabağın üzerine baş aşağı yerleştirin.Bir P1000 pipet ucunu kültür kabının içindeki ortamın yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve pıhtıları ayırabilecek güçlü akılar oluşturmadan yeterli hacimde reaktif çözeltisini nazikçe üzerine bırakın. Çözeltiyi kültür kabı içinde homojenize etmek için, küçük bir miktar çözeltiyi beş kez yavaşça içeri ve dışarı pipetlemek için bir P200 pipeti kullanın. Kültür kabını yerinden çıkarmadan kapağı değiştirin ve görüntülemeye devam edin.GFP etiketli Bazuka eksprese eden fibrin hareketsiz larva beyinlerine bir NAPP1 eklendiğinde, aPKC'nin analog duyarlı bir mutasyonunu taşıyan beyinler, nöral epitelin kasılmasının yanı sıra nöroblastlarda ve bunların soylarında parlak Baz kümeleri gösterdi. Neuroblast, hızlandırılmış süre boyunca bölünmeye devam etti ve bu da dokunun sağlıklı kaldığını gösterdi. Ve beyinler, kültür ortamı değişimine rağmen çok az sapma gösterdi.Benzer şekilde, GFP etiketli Bazuka eksprese eden yumurtalıklara bir NAPP1'in uygulanması, analog duyarlı aPKC mutant foliküler hücrelerin kasılmasını indükledi, ancak kontrollerin kasılmasını indüklemedi. Hem yanal hem de odaklanmış kayma gösteren bir hiper yığın, önce yanal kayma için düzeltildi, ardından odak kayması düzeltildi ve bu da orijinal hiper yığında gözlemlenen hareketlerde önemli bir azalmaya neden oldu. Bu protokolü denerken, pıhtı hala dövülebilir ancak beyni stabil bir şekilde tutacak kadar sağlamken, beyni kısmen polimerize fibrin pıhtısına sokmak önemlidir.Boş pıhtıların manipülasyonunu deneyin ve ne kadar sağlam olduğunu kontrol etmek için polimerize olurken pıhtıyı nazikçe araştırın.

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analizi hazırlama, basit, ucuz ve etkili bir yöntem sunulmuştur. Bizim protokol nem ve gaz değişimi sağlar ve Drosophila embriyo sıkıştırmak değil. Bu yöntem, GFP tabanlı bir stereomikroskopta ya da dik bileşik mikroskop kullanarak Drosophila embriyoların canlı görüntüleme için uygundur.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Öğrenin, canlı görüntüleme için Drosophila larva beyinlerini fibrin pıhtılarıyla hareketsiz hale getirme yöntemini. Trombin ile polimerizasyon indüklenerek örnek kayması en aza indirilir ve sinirsel süreçler dinamik olarak gözlemlenir.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Daha fazla video keşfet