Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Bu protokol, fibrin pıhtıları kullanılarak numune immobilizasyonunu tanımladı. Numuneler, bir örtü astarının yüzeyinde bir damla fibrinojen içeren kültür ortamına aktarılır, ardından trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir. Bir diseksiyon mikroskobu altında, L3 larvalarını PBS içeren dokuz kuyulu borosilikat cam bir tabağa aktarmak için bir fırça kullanın.

Sinek yeminin çoğunu larvalardan ayırmak için karıştırın ve başka bir iyi içeren kültür ortamına aktarın. Vücut uzunluğunun ortasındaki bir larvayı tüm çapı boyunca kavramak için forseps kullanın ve 200 mikrolitre taze kültür ortamı içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarın. Larvaları serbest bırakmayın.

Larvayı tüm çapı boyunca ikiye bölmek için, ya penseps uçlarının yanal hareketi ile kavranan alanı zımparalayın ya da larvaları tutan iki forseps ucu arasında başka bir forseps çiftinin bir ucunu kaydırın. Larvaları kütikülünden tutmak için forseps kullanın ve beyni çekmeden kütikülü soymak için başka bir forseps kullanın. Beyinden çıkan sinirler görünene ve beyni ağız kısımlarına bağlayan organlara ulaşılabilene kadar bu işlemi tekrarlayın.

Beyinden çıkan sinirleri forseps ile tutarken diğer çift forseps ile beynin ağız kısımlarına olan bağlantısını keserek beyni kütikülün geri kalanından ayırın. Beyni ventral sinir kordonundan çıkan aksonlardan tutun ve çevredeki organları nazikçe beyinden çekerek koparın. Daha sonra diğer forseps çifti ile göz hayal diskleri ile beyin arasındaki bağlantıyı kavrayın ve bu bağlantıyı beyni çekmeden kesin.

Beynin diğer dokulardan uygun şekilde temizlendiğinden ve hasar görmediğinden emin olun. Hasar belirtileri gösteriyorsa beyni atın. Pipet ucunu kaplamak için kaplama solüsyonunu bir P20 ile içeri ve dışarı pipetleyin, ardından beyni kaplanmış uçla üç mikrolitre ortamla birlikte aspire edin ve 200 mikrolitre temiz kültür ortamı içeren başka bir kuyucuğa pipetleyin.

Yeterli beyin diseke edilene kadar bu işlemi tekrarlayın, bazen diseksiyonların yapıldığı kuyunun kültür ortamını değiştirin. Diseke beyinleri 200 mikrolitre kültür ortamı ve fibrinojen içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarmak için kaplanmış uçlu bir P20 pipeti kullanın. Dokuz mikrolitre kültür ortamı ve fibrinojen ile birlikte bir beyni aspire edin.

Ucun ucu hücre kültürü kabının kapak camının alt kısmına neredeyse değecek şekilde, içeriği, kültür ortamı pipet ucundan çıktıktan hemen sonra kapak fişine değecek şekilde pipetleyin. Beyni kültür ortamı ve fibrinojen damlası içinde nazikçe itmek ve konumlandırmak için bir çift forsepsin bir ucunu veya kapalı bir forseps çiftini kullanın. Beynin ventral kısmının görüntülenmesi gerekiyorsa, beyni pıhtı içinde düzgün bir şekilde yönlendirmek için fibrinojen pıhtılaşmasını indükleyin.

Beyni damlanın bir tarafına itin. Pipet ucuyla beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve bir mikrolitre trombin ekleyin. Fibrinojenin polimerleşmeye başlaması için bir ila iki dakika bekleyin, bu da damlanın bir tarafında bulanık bir çökelti oluşumuna neden olur, ardından beyni nazikçe itin ve fibrin pıhtısına sokun, ventral tarafın mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun

Fibrin pıhtısına sıkışmamış beynin yan tarafına yakın bir mikrolitre trombin solüsyonu pipetleyin. İkinci fibrin pıhtısının sertleşmesi için iki ila üç dakika bekleyin, ardından beynin deforme olmamasına dikkat ederek kapak kaymasına daha güçlü bir şekilde yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın. Beyin, kapak kaymasından çok uzakta görünüyorsa, fibrin pıhtısını beyne yaklaştırarak yaklaştırın.

Beynin dorsal kısmını görüntülemek için fibrin pıhtısını indüklemek için, beyni damlanın merkezine, sırt kısmı kapak kaymasına bakacak şekilde konumlandırın. Bir P2 pipeti kullanarak, pipet ucuyla beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve bir mikrolitre trombin pipetleyin. Fibrinojenin polimerleşmeye başlaması için iki ila üç dakika bekleyin, bu da bulanık bir lifli çökelti oluşumuna neden olur, ardından beynin deforme olmamasına dikkat ederek örtü kaymasına daha güçlü bir şekilde yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın.

Ucun ucu pıhtının yaklaşık 0,5 santimetre üzerine yerleştirilmişken, pıhtının üzerine fibrinojen içermeyen 390 mikrolitre kültür ortamını nazikçe pipetleyin. Kültür ortamını pıhtının yanlarına eklemeyin, çünkü bu, onu kapak fişinden ayırabilir. Fazla trombini yıkamak için, tabaktan 300 mikrolitre çıkarın, ardından 300 mikrolitre temiz kültür ortamı ekleyin ve pıhtıların tamamen daldırıldığından emin olun.

Odak değişikliklerine neden olan sıcaklık değişikliklerini önlemek için, reaktiflerle birlikte çözeltiyi kültür kabı ile aynı sıcaklıkta tutun. Tabağın kendisini yerinden çıkarmadan kültür kabının kapağını çıkarın. Daha kolay çıkarmak için, görüntülemeden önce 35 milimetrelik tabağın kapağını tabağın üzerine baş aşağı yerleştirin.

Bir P1000 pipet ucunu kültür kabının içindeki ortamın yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve pıhtıları ayırabilecek güçlü akılar oluşturmadan yeterli hacimde reaktif çözeltisini nazikçe üzerine bırakın. Çözeltiyi kültür kabı içinde homojenize etmek için, küçük bir miktar çözeltiyi beş kez yavaşça içeri ve dışarı pipetlemek için bir P200 pipeti kullanın. Kültür kabını yerinden çıkarmadan kapağı değiştirin ve görüntülemeye devam edin.

GFP etiketli Bazuka eksprese eden fibrin hareketsiz larva beyinlerine bir NAPP1 eklendiğinde, aPKC'nin analog duyarlı bir mutasyonunu taşıyan beyinler, nöral epitelin kasılmasının yanı sıra nöroblastlarda ve bunların soylarında parlak Baz kümeleri gösterdi. Neuroblast, hızlandırılmış süre boyunca bölünmeye devam etti ve bu da dokunun sağlıklı kaldığını gösterdi. Ve beyinler, kültür ortamı değişimine rağmen çok az sapma gösterdi.

Benzer şekilde, GFP etiketli Bazuka eksprese eden yumurtalıklara bir NAPP1'in uygulanması, analog duyarlı aPKC mutant foliküler hücrelerin kasılmasını indükledi, ancak kontrollerin kasılmasını indüklemedi. Hem yanal hem de odaklanmış kayma gösteren bir hiper yığın, önce yanal kayma için düzeltildi, ardından odak kayması düzeltildi ve bu da orijinal hiper yığında gözlemlenen hareketlerde önemli bir azalmaya neden oldu. Bu protokolü denerken, pıhtı hala dövülebilir ancak beyni stabil bir şekilde tutacak kadar sağlamken, beyni kısmen polimerize fibrin pıhtısına sokmak önemlidir.

Boş pıhtıların manipülasyonunu deneyin ve ne kadar sağlam olduğunu kontrol etmek için polimerize olurken pıhtıyı nazikçe araştırın.