Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme
May 16th, 2021
Rafine bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve yetişkin fare kalbine uygulandı. Bu yöntem, genetik bir muhabir stratejisine atfedilen etiketli fibroblast floresan korurken yoğun, otoflüoresan kalp dokusunu temizlemek için tasarlanmıştır.
Bu yeni doku temizleme protokolü, kalpteki belirli hücre tiplerine ve yaralanma koşullarındaki davranışlarına daha doğru bir in vivo bakış sağlamak için mevcut teknolojiyi geliştirir. Bu protokol hızlı ve oldukça basittir. Hücre veya doku lekesi gerektirmeden arka plan dokusu oto floresanından minimum parazitle marca floresanının korunmasına izin verir.
Deneysel farenin ventral yüzeyini temizlemek için% 70 etanol ıslatılmış gazlı bez ped kullanarak başlayın. Xiphoid işleminin yaklaşık üç metre altında üç santimetre enine kesi yapmak için cerrahi makas kullanın ve cildi alttaki karın duvarı dokusundan ayırmak için fareyi karından xiphoid işlemine deglove edin. Deri altı karın duvarı dokusunda, xiphoid işleminin üç santimetre altında iki santimetrelik enine bir kesi yapın ve bu kesiden göğüs kafesinden orta çizgiden dikey bir kesik yapın.
Kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini geriye sabitle. Ve üstün vena kava ve aort içine soğuk PBS enjekte etmek için 27 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Tüm kan kalpten temizlendiğinde, sabitleme işlemine başlamak için üstün vena kava ve aort içine 10 mililitre soğuk% 4 PFA teslim edin.
Tüm fiksatif yanıp söndüğünde, kalbi kesin ve atria, sağ ventrikül ve septum ve sol ventrikülü ayırmak için düz bir bıçak neşteri kullanın. Bir fındık makinesinde dört santigrat derecede bir gecede inkübasyon için kalbi 15 mililitrelik konik bir soğuk % 4 PFA tüpüne yerleştirin. Ertesi sabah, yeni hazırlanmış bir hidrojel çözeltisine% 0.25 fotoğraf başlatıcı çözelti ekleyin ve kalbi hidro jele aktarın.
Konik tüpü, fiziksel rahatsızlık olmadan dört santigrat derecede bir gece inkübasyonu için folyoya sarın. Ertesi sabah, kalbi 15 mililitrelik bir PBS tüpüne dikkatlice aktarmak için forseps kullanmadan önce tüpü 2,5 saat boyunca 37 santigrat derece boncuk banyosunda ısıtın. Kalbi PBS'de bir saat boyunca bir besleyicide 37 santigrat derecede yıkayın ve kalbi aktif bir elektroforezi makinesinin sepetine aktarın.
Kapağı yerine sabitleyin ve aktif elektroforez odası haznesini elektroforez temizleme çözeltisi ile doldurun. Oda dolduğunda, sepeti çözeltiye batırın ve elektroforezi makinesinin kapağını yerine sıkın. Daha sonra elektroforezi makinesini 1,5 saat boyunca 1,5 amper ve 37 santigrat derecede çalıştırın.
Elektroforeziden sonra, opak doku kalmadığından emin olmak için kalbin görsel olarak kontrol edin. Temizlenmiş kalbi 15 mililitrelik ikide üç kez bir saat boyunca taze PBS'de bir besleyicide yıkama başına 37 santigrat derecede yıkayın. Heme oto floresanını azaltmak için kalbi renksizleştirme ajanına batırmadan önce.
48 saat sonra, kalbi pbs'de gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve görüntülemeden önce 48 saat boyunca yeni hazırlanmış RIMS'de kalbi aşındırın. Temizlenmiş kalbin 3D görüntülenmesi için, önce, 3D baskılı bir alt haznenin altına, numunenin görüntülendiği yükseklikte ince bir vakum yağı tabakası yerleştirin. Rezervuarı RIMS ile doldurun ve kabarcıkları çıkarmak için bir pipet ucu kullanın.
Sol ventrikül duvarı yukarı bakacak şekilde kalbi RIMS'e dikkatlice yerleştirin, çözeltiye kabarcık sokulmamalarına dikkat edin. 3D baskılı üst rezervuar parçasının alt yüzeyine bir cam kapak kayması takmak için vakum gresi kullanın ve üst rezervuar kapaklarını kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek alt rezervuarlara yerleştirin. Daha sonra üst rezervuarları gliserol ile doldurun.
Temizlenmiş kalpleri görüntülemek için bir konfokal mikroskop kullanın. Rafine kardiyak doku temizlemeyi 3D görüntüleme ile birleştirmek, kardiyak fibroblastların gelişmiş ayrıntılı bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bu görüntüleme tekniği kullanılarak fibroblastların yoğun bir şekilde paketlendiği ve yaralanmamış kalplerde iğdelenmiş morfolojiye sahip olduğu gözlenir.
İskemi reperfüzyonu yaralanmasından sonra, yaralanmadan sonraki ilk üç gün iskemik bölgede kardiyak fibroblast kaybı görülür. 7. ve 14. 28. güne gelindiğinde, kalbin yaralı bölgelerini çevreleyen kardiyak fibroblast popülasyonu en büyük yoğunluktadır.
Miyokard enfarktüsü yaralanmasından bir buçuk gün sonra, yaralı sol ventrikülde az sayıda fibroblast kalır. Ancak üçüncü güne gelindiğinde, fibroblastlar genişler ve sol ventrikülün çoğunda bulunur. İskemik cerrahinin aksine, anjiyotensin iki ve fenolefrinin birkaç hafta boyunca infüzyonu kalp dokusu kaybına ve duvar incelmesine neden olmaz.
Bunun yerine, fibroblast, rafine edilmiş doku temizleme protokolünü kullanırken görüldüğü gibi sağ el sarmal kasılma deseninin ekseni boyunca hizalanır. Ek olarak, anjiyotensin iki ve fenolefrin tedavisinden sonra, fibroblastlar iskemi reprofüzyonu ve miyokard enfarktüs yaralanması modellerinde gözlenen iğ şeklinin aksine küçük ve yuvarlak görünür. Elektroforetik temizlemenin özellikle yaralanma protokollerinden geçmiş kalplerle çalışırken dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.
Bu protokol, kardiyak fibroblastların in vivo yaralanmaya nasıl tepki verdiklerini değerlendirmek için kullanılabilir. Kalbin yaralanmaya hücresel düzeyde nasıl tepki verdiğini anlamak için farklı floresan belirteçler de kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Yetişkin fare kalbi için özel bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve bu sayede belirli hücre tiplerinin görselleştirilmesi sağlanırken arka plan otofloresansı en aza indirildi. Bu protokol, kardiyak doku çalışmaları için mevcut teknikleri geliştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Kardiyovasküler Biyoloji
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Doku temizleme teknikleri, yoğun biyolojik dokuların görüntülemesinde esastır.
- Otofloresans, görüntüleme çalışmalarında belirli hücresel sinyalleri gizleyebilir.
- Etiketlenmiş hücrelerin floresansının korunması doğru analiz için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler boyama gerektirebilir, bu da süreci karmaşıklaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Hızlı ve basit bir doku temizleme protokolü geliştirmek.
- Kardiyak dokuda fibroblast floresansının görselleştirilmesini iyileştirmek.
- Otofloresansın arka plan girişimini azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare vücudunun karın yüzeyini temizlemek için %70 etanol kullanıldı.
- Kalbe erişmek için cerrahi insizyonlar yapıldı.
- Yeni temizleme protokolü kalp dokusuna uygulandı.
- Marca floresansı boyama olmadan korunuldu.
Ana Sonuçlar
- Yeni protokol, yoğun kardiyak dokuyu etkili bir şekilde temizledi.
- Fibroblast floresansı süreç boyunca korunmuştur.
- Arka plan otofloresansı önemli ölçüde azaltıldı.
- Yöntem, kardiyak hücrelerin daha iyi in vivo görüntülemesine izin verir.
Sonuçlar
- Bu gelişmiş yöntem, kardiyak dokunun çalışmasını geliştirir.
- Kalp hasarı tepkilerini inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sağlar.
- Protokol verimlidir ve ek boyama ihtiyacını en aza indirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding cardiac fibroblast dynamics in three dimensions provides critical insights into fibrosis mechanisms that drive ventricular stiffness and heart failure progression. This refined CLARITY-based tissue clearing approach enables high-fidelity, whole-organ visualization of fibroblast behavior without antibody penetration limitations or fluorescence loss, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. The method offers predictive value by revealing spatially resolved fibroblast responses to ischemic and non-ischemic injury models, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast localization and morphology in intact tissue to clarify pathogenic versus reparative roles in cardiac fibrosis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic fibroblast labeling (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) to spatial phenotypes in healthy and injured hearts.
- Predictive Confidence: Reveals injury-specific fibroblast patterns—such as aligned bands post-angiotensin II/phenylephrine or repopulation from border zones post-ischemia—to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces cleared, fluorescently labeled hearts compatible with confocal imaging for quantitative 3D analysis of fibroblast density, distribution, and morphology.
- Reproducibility: Standardized electrophoresis-based clearing (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) and RIMS equilibration ensure consistent tissue optical properties across experimental groups.
- Scalability: Compatible with multi-sample processing in active electrophoresis chambers, enabling side-by-side comparison of control, ischemic, and hypertensive injury models.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Captures fibroblast responses in models mimicking human ischemic injury (reperfusion) and pressure overload (angiotensin II/phenylephrine), aligning with clinical fibrosis phenotypes.
- Translational Continuity: Tracks fibroblast death, border zone repopulation, and density peaks at day 28 post-ischemia—key temporal windows for antifibrotic intervention testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes pro-fibrotic spindle-shaped fibroblasts in ischemia from small, rounded phenotypes in hypertension, informing target-specific pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved phenotypic data that bridges in vitro findings and functional outcomes in preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of fibroblast activation, migration, and proliferation in 3D tissue context, clarifying pathway-level contributions to fibrosis.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (fibroblast density, alignment, morphology) suitable for high-content analysis in compound screening cascades.
- Analytics: Supports morphometric and spatial statistical analysis of fibroblast networks, enabling comparison across genotypes, injuries, and time points.
- Translational Research: Links fibroblast dynamics to ventricular remodeling timelines, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue clearing and imaging platform applicable to multiple cardiovascular disease models and cell types beyond fibroblasts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibroblast function by preserving native tissue architecture and fluorescent signal integrity.
- Operational Value: Eliminates need for sectioning and staining, reducing workflow variability and increasing throughput for 3D phenotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by revealing on-target fibroblast responses that predict functional outcomes in heart failure models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antifibrotic targets based on spatially validated target engagement and phenotypic modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery, perfusion fixation, and hydrogel-based tissue clearing techniques.
- Dependent on access to active electrophoresis equipment, confocal microscopy, and RIMS/glycerol mounting solutions.
- Necessitates standardization of clearing duration and temperature to prevent over-clearing or autofluorescence in injured tissue.
- Adaptation to other disease models may require optimization of decolorization time to reduce heme-derived background without quenching GFP signal.
- Practical limitation: Long-term imaging stability depends on proper RIMS equilibration to prevent refractive index mismatch and signal degradation.
