Name: Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Keşfedin, domuz kornea doku eksplant modeli kullanarak Herpes Simpleks Virüs-1 antivirallerinin etkinliğini değerlendirme yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, in vitro bulguların klinik uygulamalara aktarılmasını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH hibeleri (R01 EY024710, RO1 AI139768 ve RO1 EY029426) tarafından D.S. A.A.'ya verilen F30EY025981 hibesi ile desteklendi. Çalışma, Park Ambalaj şirketi, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609'dan elde edilen porcine korneaları kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu çalışmada kullanılan tüm porcine dokusu üçüncü taraf bir özel kuruluş tarafından sağlanmıştır ve hayvan elleçlemelerinin hiçbiri Chicago'daki Illinois Üniversitesi personeli tarafından yapılmamıştır.
1. Malzemeler
<ol><li>
Reaktif
	<ol>
<li>Plak tahlil için aşağıdaki reaktifleri kullanın: toz metilselüloz, Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM), fetal sığır serumu (FBS), penisilin ve plak tahlil için streptomisin (P/S).</li>
		<li>Plak tahlil için kristal mor çözeltisi hazırlamak için kristal mor tabletler ve etanol (moleküler biyoloji sınıfı) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vero hücre büyüme ortamı - DMEM tüm medya
	<ol>
<li>Doku kültürü başlığının içindeki DMEM medya şişesini açın. Serolojik pipet kullanarak şişeden 55 mL medya çıkarın ve atın. DMEM'e 50 mL P/S FBS ekleyin. 4 °C'de soğutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plak tahlil medya - %5 metilselüloz medya stoğu
	<ol>
<li>2,5 g metilselüloz tozunun 500 mL'lik cam şişenin içinde karıştırma mıknatısı ile ölçün ve otoklavlayın. Şişe oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 50 mL FBS ve 5 mL P/S içeren 500 mL DMEM tüm medyayı alın ve metilselüloz içeren cam şişeye ekleyin.</li>
		<li>Manyetik bir karıştırıcı kullanarak 2 gün boyunca 4 °C'de karıştırın. 4 °C'de soğutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ekscised porcine kornea için medya hazırlığı
	<ol>
<li>Doku kültürü başlığının içinde minimum esansiyel ortam (MEM) şişesi açın. Serolojik pipet kullanarak şişeden 10 mL MEM atın.</li>
		<li>Medyaya 5 mL insülin transferin-selenyum (ITS) ve 5 mL antimykotik-antibiyotik (AA) ekleyin ve 4°C'de soğutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kristal menekşe ustası ve çalışma stoğu:
	<ol>
<li>Kristal mor stok çözeltisini yapmak için, suya% 20 etanol 100 mL'ye 1 g kristal mor tozu ekleyin. Bu stok (%1 w/v kristal menekşe) karanlık bir yerde saklandığında bir yıla kadar saklanabilir ve kullanılabilir.</li>
		<li>Bundan bir çalışma stoğu yapmak için, 350 mL suya 50 mL orijinal stok çözeltisi ekleyin. 500 mL çalışan kristal mor çözelti (%0,1 w/v kristal mor) yapmak için bu çözeltiye 100mL etanol ekleyin. NOT: Bu çözümlerin her ikisinin de karanlıkta saklanması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Prosedür
<ol><li>Porcine kornealarının tüm gözlerden izolasyonu17
	<ol>
<li>Porcine gözlerini uygun bir satıcıdan aldıktan sonra, Şekil 1'debelirtildiği gibi doku işlemede bir gecikme varsa buz üzerinde saklayın.</li>
		<li>Vitreus mizahının dökülmesinden kaynaklanan kazaların yanı sıra kirlenmeyi önlemek için bu işlem sırasında kişisel koruma ekipmanlarının kullanıldığından ve giyildiğinden emin olun.</li>
		<li>Temizlemek ve dezenfekte etmek için çalışma alanını% 70 etanol ile püskürtün. Çalışma alanının sabit olduğundan emin olmak için, Şekil 2'debelirtildiği gibi bir tezgah kapağı ve bantlayın.</li>
		<li>Gazlı bez üzerine gözenekli gözler yerleştirin (Şekil 3). 50 mm gazlı bez kullanarak, tek elleŞekil 4B'degösterildiği gibi gözenekli gözlerin arka bölümünü ( Şekil 4A ) tutun.</li>
		<li>30 G'lik bir iğne ile, gözün epitel yüzeyinin yaklaşık merkezinde dikkatlice tek bir dürtme yapın ve stromaya zarar olmadığından emin olun (Şekil 5). Dürtme, stromal tutulumu önlemek için epitel (~100-200 μm) ile sınırlanmalıdır.</li>
		<li>Keskin bir sterilize bıçak kullanarak, korneadan 1 mm uzaklıktaki sklera üzerinde küçük bir kesi yapın. Elin hızlı ve pürüzsüz bir döner hareketi kullanarak vitreus mizahının sızmamasını sağlamak için korneanın kenarını kesin (Şekil 6A). Korneayı kornea-sklera kenarında düz bir cımbızla tutarak, bıçağı kullanarak gözün kalan bağlama zarlarını kesin (Şekil 6B).</li>
		<li>Korneayı alın ve 2 mL kornea ortamı ile kaplanmiş 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin. Kornea yukarı bakacak şekilde yerlendirilmelidir, Şekil 7A-D, Şekil 8'debir dizi adımda gösterilmelidir.</li>
		<li>Kornea yüzeyindeki enkaz alanına 17 GFP'lik 5 x10 5 plak şekillendirme ünitesi (PFU) içeren 5 μL virüs çözeltisi ekleyin. Enfekte porcine korneaları içeren 12 kuyu plakasını 72 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.</li>
		<li>% 10 çamaşır suyu ile deneyde kullanılmayan ve biyolojik tehlike torbalarında güvenli bir şekilde atılan ek gözleri püskürtün.</li>
	</ol></li>
	<li>Görsel -leştirme NOT: Virüs, ilaçların eklenmesinden önce her gün görselleştirilmelidir.<ol>
<li>Stereo mikroskobu ve LED ışık kaynağını açın ve korneaları görüntülemeden önce makine lambasının ısınmasını sağlar. Kornea plakasını çözeltiyi bozmadan enstrümana dikkatlice taşıyın. Filtreyi, numunelere bakmak için GFP (380-460 nm) kullanılacak şekilde değiştirin. Görüntü yakalamak için pozlama süresini 500 ms olarak ayarlayın.</li>
		<li>İlk olarak, kornea plakasını stereoskopun altına yerleştirin ve görüntüleri 7,5x'lik en düşük büyütmede yakalayın. Bunu, tüm viral yayılma ve dendrit oluşumunun net bir şekilde görselleştirilmeleri için bir dizi artan büyütme görüntüsüyle (örneğin, 15x, 25x, 35x) takip edin</li>
		<li>Enfekte korneaları doku kültürü inkübatörüne geri verdiğinden ve çekilen tüm görüntüleri kaydettiğinden emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Virüs enfeksiyonu nicelemesi NOT: İlaç tedavisinin etkisini analiz etmek için her gün porcine kornealarından gelen virüs titreleri değerlendirilmelidir.<ol>
<li>Virüsü ölçmek için, tohum Vero hücreleri 5 x 105 hücre yoğunluğunda, bu deneyde olduğu gibi 6 kuyulu bir plaka kullanıyorsanız. Bunu enfeksiyondan bir gün önce yap. Plakalı hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırarak virüs nicelemesi için birleştiğinden emin olun.</li>
		<li>Birden fazla mikrosantrifüj tüpüne Aliquot 500 μL serumsuz ortam. Serumsuz ortam dolu tüplere batırılmış steril pamuk uçlu çubuk yerleştirin. Pamuklu çubukların kullanımdan önce en az 5 dakika batırılıp ıslatılması gerekir.</li>
		<li>Alttaki medyayı bozmadan, enfekte porcine kornea plakasını bir biyogüvenlik kabinine taşıyın. Islak pamuklu çubukları kullanarak, aşırı basınç uygulamadan enfekte porcine korneanın merkezinden 5 mm çapında saat yönünde 3 devir ve saat yönünün tersine 3 devir yapın.</li>
		<li>Pamuklu çubuğu serumsuz ortam dolu mikrosantrifüj tüpüne geri yerleştirin ve saat yönünde ve saat yönünün tersine 5 kez döndürün. Pamuklu çubuğun metal ucu tamamen mikrosantrifüj tüpüne sığacak şekilde kısa kesilmelidir ve kapak kapatılabilir.</li>
		<li>Sürünmüş pamuk ucunu içeren mikrosantrifüj tüpünü bir girdap makinesine ve girdabına 1 dakika boyunca yüksek hızda yerleştirin.</li>
		<li>Bu numuneler üzerinde bir plak tahlili ile virüs nicelemesi gerçekleştirin. NOT: Bu niceleme adımının enfeksiyon sonrası 2, 4 ve isteğe bağlı olarak 6 gün sonra gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plak tahlili ile virüs nicelemesi NOT: Bir plak tahlilini gerçekleştirmek için, Vero hücrelerini 6 kuyu plakasına büyütüp tabaklamak ve tahlil başlamadan önce hücrelerin% 90 birleştirilmesini sağlamak. Bu hücrelerin 75 cm2 şişesi bir araya gelen kullanın. Aşağıdaki tüm adımların bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmesi gerekir.<ol>
<li>Vero hücrelerinin birleştiği monolayerini, kültür ortamını epire ettikten sonra 10 mL taze fosfat tampon salin (PBS) ile şişede yıkayın. İlk yıkama solüsyon setini arzu ettikten sonra yıkama adımını PBS ile bir kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Hücre monolayerine %0,05 Trypsin'in 1 mL'sini ekleyin. Şişeyi 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çıplak gözle, hücrelerin şişenin iç yüzeyinden ayrıldığından emin olun. Değilse, şişeyi tekrar incelemeden önce 5 dakika daha bekleyin. Hücreler ayrılmış gibi göründüğünde, hücrelerin şişe yüzeyinden tamamen yerinden çıktığından emin olmak için monolayer'a 9 mL tüm ortam ekleyin.</li>
		<li>Tüm hücreleri tüm medya ile birlikte şişeden toplayın ve 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
		<li>Plak tahlil için kullanılan 6 kuyu plakasının her kuyusu için santrifüj tüpünden 300 μL kullanın. 6 kuyu plakasının her bir kuyusunun her bir kuyusunun her bir kuyusunun 2 mL tamamının üzerine yerleştirin. Plakaları bir gecede inkübatörde bırakın, böylece her kuyuda bir eşken olur.</li>
		<li>Bir plak tahlilini gerçekleştirmek için, virüsün ölçülmesi öncesinde numunelerin seri seyreltilmesinin yapılması gerekir.</li>
		<li>10-8'likbir seyreltme ulaşana kadar serumsuz ortam kullanarak mikro santrifüj tüplerinde virüsün 101 kat seyreltilmesini gerçekleştirin. 10-3 seyreltmede, 6 kuyu plakasından hücreler üzerindeki büyüme medyasını epire ettikten sonra seyreltmenin 1 mL'lik kısmını plakalı hücrelerin monolayerine aktarın, bu enfeksiyon adımı olacaktır. Enfekte plakayı 2 saat boyunca 37 °C inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Mevcut enfeksiyon medyasını aspire edin, hücreleri kaplamak için PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve 6 kuyuya da kuyu başına 2 mL metilselüloz yüklü ortam ekleyin. 72 saat boyunca veya plak oluşumu görülene kadar kuluçkaya yatırın. Plaklar hücre monolayerinde hücreler arasında küçük boşluklar oluşumu ile tanımlanabilir.</li>
		<li>Duvarı kılavuz uç olarak kullanarak her kuyunun köşesine yavaşça 1 mL metanol ekleyin. 6 kuyu plakasını oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre monolayerini rahatsız etmeden veya karıştırmadan her kuyunun içeriğini plakadan yavaşça emiş.</li>
		<li>Tüm hücrelerin kapsanmasını sağlamak için 6 kuyu plakasının her kuyusuna 1 mL kristal mor çalışma çözeltisi ekleyin. 6 kuyu plakasını 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın. Kristal mor çözeltiyi aspire ederek atın ve kuyuları emici bir kağıt tabakası üzerinde kurutun.</li>
		<li>Başlangıç çözeltisinde toplam virüs içeriğini ölçmek için plak sayısını en yüksek seyreltme kuyusunda sayın. Viral titreyi doğrulamak için işlemi iki kez tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
<li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li>
<li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Adaptation+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li>
<li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li>
<li>Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis%3A+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li>
<li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+infection+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li>
<li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li>
<li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li>
<li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li>
<li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22CEN+Case+Report%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li>
<li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+nephrotoxicity%3A+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention%2C+detection%2C+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li>
<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması ve rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.

Önceki araştırmalar BX795'in HSV-1 enfeksiyonuna karşı antiviral ajan olarak umut verici bir role sahip olduğunu göstermiştir; TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1)16'yıinhibe ederek. Hem TBK1 hem de otofaji, insan kornea epitel hücrelerinde gösterildiği gibi HSV-1 enfeksiyonunu inhibe etmeye yardımcı olmuştur. BX795'in 10μM konsantrasyonda antiviral aktivite ile maksimum derecede etkili olduğu ve hem batı leke analizi hem de anahtar viral proteinlerin viral plak analizi kullanılarak, BX795'in TFT<sup cla...

Oküler enfeksiyonlardan muzdarip insanlar genellikle görme kaybına maruz1. Dünya çapında yüksek seroprevalans ile, HSV enfekte bireyler kornea skarlaşmasına, stromal keratit ve neovaskülarizasyona yol açan tekrarlayan göz enfeksiyonlarından muzdariptir2,3,4,5. HSV enfeksiyonlarının da daha az sıklıkta, ensefalit ve sistemik morbidite6,7,8gibi immün sistemik olarak tedavi edilmemiş hastalar arasında bir dizi ciddi duruma neden olduğu gösterilmiştir. Acyclovir (ACV) ve nükleozid analogları gibi ilaçlar HSV-1 enfeksiyonunu frenlemede ve hatta yeniden etkinleştirmeyi kontrol etmede tutarlı bir başarı göstermiştir, ancak bu ilaçların uzun süreli kullanımı böbrek yetmezliği, fetal anormallikler ve gelişen viral suşlara karşı ilaç direncinin ortaya çıkmasını kısıtlamama ile ilişkilidir9,10,11,12,13. HSV-1 oküler enfeksiyonlarla ilişkili karmaşıklıklar, daha önce monolayerler ve insan kornea hücrelerinin 3D kültürleri kullanılarak in vitro ve murine veya tavşan oküler enfeksiyonları kullanılarak in vivo olarak çalışılmıştır. Bu in vitro modeller HSV-1 enfeksiyonlarının hücresel biyolojik bileşenleri hakkında önemli veriler sağlarken, kornea dokusunun karmaşık karmaşıklığını taklit edemezler ve virüsün dendritik yayılımını aydınlatmak için çok az şeyyaparlar 14. Buna karşılık, in vivo sistemler HSV-1 enfeksiyonu sırasında kornealarda enfeksiyon yayılımını ve immün aktivasyon yanıtlarını göstermede daha anlayışlı olsalar da, deneyleri göz ardı etmek için eğitimli araştırmacılara ve hayvan bakımı için büyük tesislere ihtiyaç duydukları uyarısıyla birlikte gelirler.
Burada HSV-1 enfeksiyon kaynaklı yara sistemini incelemek için ek vivo model olarak porcine korneaları kullanıyoruz. Hem bazı ilaçların potansiyel farmakolojisi hem de enfeksiyonun neden olduğu yara sisteminin hücre ve moleküler biyolojisi doku eksplant kültürleri üzerinden incelenebilir. Bu model diğer viral ve bakteriyel enfeksiyonlar için de kullanılabilir. Bu çalışmada, preklinik küçük bir molekül olan BX795'in antiviral etkinliğini test etmek için porsin korneaları kullanılmıştır. Erişim kolaylığı ve maliyet etkinliği nedeniyle porcine kornea kullanımı tercih edildi. Ek olarak, porcine kornea modelleri, korneaların izole edilmesi kolay, enfeksiyon ve görselleştirme için yeterli boyutta ve15'iidare etmek için sağlam olan iyi insan gözleri modelleridir. Porcine korneaları ayrıca hem trans kornea geçirgenliği hem de sistemik emilim15'te insan kornea modellerinin karmaşıklığı ile karşılaştırılabilir. Çalışma için bu modeli kullanarak, BX795'in HSV-1 virüs enfeksiyonunun yetkin bir inhibitörü olarak nasıl daha fazla araştırmaya layık olduğunu ve potansiyel bir küçük moleküllü antiviral bileşik olarak sınıflandırma literatürüne eklediğini ortaya çıkarabildik16.

<table><tbody><tr><td>30 G hipodermik iğneler.</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>500 mL cam şişe.</td><td>Thomas Scientific</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>Antimikotik ve Antibiyotik (AA)</td><td>GIBCO</td><td>,</td><td>Aliquot'u 5 mL'lik tüplere 15240096 ve</td></tr><tr><td>Tezgah üstü girdap</td> kullanana kadar donmuş halde tutun.<td>BioDot</td><td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-Güvenlik Seviye-2 (BSL-2) sertifikasına sahip Biyogüvenlik kabini.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6" Steril Kalsiyum Aljinat Standart Swablar.</td><td>Püriten</td><td>22029501</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı - 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Kristal menekşe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>Tozu karanlık bir yerde saklayın</td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td>4 > </td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Aliquot'u 50 mL'lik tüplere kullanana kadar C ve düz kenarlı cımbız kullanana kadar donmuş halde tutun</td></tr><tr><td>; 2.Harward</td> <td>Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucular --80 >C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>Taze bıçak kutusu.</td><td>Thomas Bilimsel</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Guaze</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td>108 inç kare klasör 12 kat</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>evde yetiştirildi-Northwestern Üniversitesi'nden</td><td></td> <td>Dr. Patricia Spears'tan orijinal tür. HSV-1 suşunu eksprese eden GFP 17</td></tr><tr><td>İnsülin, Transferrin, Selenyum - ITS</td><td>GIBCO</td><td>,</td><td>Aliquot'u 5 mL'lik tüplere 41400045 ve Manyetik karıştırıcı kullanana kadar donmuş halde tutun</td></tr><tr><td>.</td><td>Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>Metalik Makas.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler 1 ila 1000 &mikro;L.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Temel Orta - MEM</td><td>GIBCO</td><td>11095080</td><td>4 > OptiMEM'i kullanana kadar C</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985047</td><td>Mağazası 4 > </td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td> kullanana kadar C.<td>GIBCO</td><td>,</td><td>Aliquot'u 5 mL'lik tüplere 15140148 ve kullanılana kadar donmuş halde tutun</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu Su -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Porcine Corneas</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>İsteğe göre özel sipariş</td></tr><tr><td>Prosedür tezgah kapakları - gerektiği gibi.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler</td><td>Thomas Scientific</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetleme ekipmanı.</td><td>Thomas Scientific</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma mıknatısı.</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü şişeleri, T175 cm2.</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>%5 CO2 ve 37 °C muhafaza edebilen doku kültürü inkübatörleri; C sıcaklığı.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar (6 oyuklu).</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Aliquot'u 10 mL'lik tüplere koyun ve Vero hücrelerini kullanana kadar donmuş halde tutun</td></tr><tr><td></td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

herpes simpleks virüs-1 antivirallerinin etkinliğini İncelemek için porcine kornea dokusu eksplant

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Virüsler ve bakteriler kornea enfeksiyonu yoluyla çeşitli oküler yüzey kusurlarına ve yaralar ve ülserler gibi dejenerasyona neden olabilir. Dünya çapında% 60-90 arasında değişen bir seroprevalans ile, Herpes Simpleks Virüs tip-1 (HSV-1) genellikle lezyonlar ve enfeksiyon ilişkili körlük olarak da kendini gösteren orofasiyal bölgenin mukokütanöz lezyonlarına neden olur. Mevcut antiviral ilaçlar etkili olmakla birlikte, toksik yan etkilerin direncinin ortaya çıkması ve kalıcılığı, bu her yerde bulunan patojene karşı yeni antivirallerin geliştirilmesini gerektirir. In vitro değerlendirme, ortaya çıkan bir antiviral ile ilgili bazı fonksiyonel veriler sağlasa da, in vivo oküler dokunun karmaşıklığını göstermez. Bununla birlikte, in vivo çalışmalar pahalıdır ve özellikle viral ajanlarla çalışırken eğitimli personel gerektirir. Bu nedenle ex vivo modelleri antiviral test için verimli ancak ucuz adımlardır. Burada, HSV-1'in porcine kornea ex vivo kullanarak enfeksiyonu incelemek için bir protokol ve mevcut ve yeni antiviral ilaçları kullanarak topikal olarak tedavi etmek için bir yöntem tartışıyoruz. Ayrıca HSV-1 kullanarak bir plak tahlilini gerçekleştirme yöntemini de gösteriyoruz. Ayrıntılı yöntemler, HSV-1 patojenine benzeyen enfeksiyonları incelemek için benzer deneyler yapmak için kullanılabilir.

Deneysel antivirallerin etkinliğini anlamak için, in vivo insan klinik deneyleri için gönderilmeden önce kapsamlı bir şekilde test edilmesi gerekir. Bu bakımdan pozitif kontrol, negatif kontrol ve test gruplarının belirlenmesi gerekiyor. Trifluorothymidine (TFT) uzun zamandır herpes keratitini topikal olarak tedavi etmek için tercih edilen tedavi olarak16. Pozitif kontrol olarak kullanılan TFT tedavi edilen kornea grupları daha düşük enfeksiyon yayılımı gösterir. Negatif kontrol olarak PBS'de çözü...

Deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için bir porcine korneasının kullanımını açıklıyoruz.

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

İlaçların hayvan modellerindeki etkinliğini anlamak maliyet ve emek yoğundur. Eks vivo doku eksplant modeli kullanan protokolümüz hem maliyet hem de çalışmayı yürütmek için gerekli bilimsel personel açısından önemli ölçüde daha düşüktür. Bu tekniğin ana avantajı, diğer bazı küçük hayvan modellerinin aksine insan gözlerine çok benzeyen anatomi ve fizyolojiye sahip porcine gözlerinin kullanılmasıdır.İlaçları in vitro olarak test ettiğimizde, hayvan veya insan modellerinde bulunmayan etkinliği gösterebilirler. Ex vivo doku sistemleri, in vitro sistemlerimizin hayvan ve insan denemelerine çevrilip çevrilmediğini anlamanın en iyi yoludur. Porcine kornea sistemi, daha az emek yoğun olmasına rağmen, ilaçları izole etmek, sürdürmek, enfekte etmek ve tedavi etmek için eğitilebilir beceriler gerektirir, özellikle korneanın tüm porcine gözünden izolasyon süreci kelimelerle ifade etmek zordur, ancak görsel gösteri gerektirir.Uygun bir satıcıdan porcine gözleri aldıktan sonra, dokuları işleme kadar buzda saklayın ve uygun kişisel koruma ekipmanını takın. Çalışma alanını %70 etanol ile dezenfekte edin ve çalışma alanına bir tezgah kapağı sabitleyin. Çalışma alanı hazır olduğunda, gözleri 50 mili

porcine-corneal-tissue-explant-to-study-efficacy-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Herpetik kornea hastalığı çalışmaların çoğu birincil enfeksiyon modeli kullanın. Ancak, HSV-1 ile birincil infeksiyon genellikle insan hastalığına yol açmaz. Burada daha yakından insan hastalığı taklit herpetik kornea hastalığı, tekrarlayan modeli açıklamak.

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Bu videoda, domuz gözünden diseke edilen bir korneoskleral düğme kullanarak bakteriyel keratit için bir ex vivo model oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Aşılanmış bakteriler, altta yatan stromayı istila etmek ve in vivo enfeksiyonu taklit eden kornea dokuları içinde bir enfeksiyon oluşturmak için kornea epitel insizyonlarını geçer.

Domuz Ex vivo Kornea Bakteriyel Keratit Modeli: Kornea Epitel Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon Oluşturma Tekniği

Bu video, domuz gözündeki kornea endotel hücrelerine seçici olarak zarar vermek için invaziv olmayan lazer destekli bir prosedürü göstermektedir. Geliştirilen ex vivo endotel hücre hasarı modeli, kornea endotel hastalıklarını incelemek için kullanılabilir.

Domuz Kornea Endotel Hücrelerinin Lazer Destekli Seçici Ablasyonu: Ex Vivo Çalışmalar için Odaklanmış Domuz Kornea Endotel Hasarını İndüklemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, enfekte domuz korneasından elde edilen bir virüs kullanılarak plak testi gerçekleştirme yöntemi gösterilmektedir. Domuz korneası, deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için kullanılır.

Plak Testi ile Deneysel İlaçların Antiviral Etkinliğinin Belirlenmesi

Deri, insan patojeni herpes simpleks virüsü tip 1'in (HSV-1) hedef dokularından biridir. HSV-1'in dokuya invazyon yolunu araştırmak için, cildin en dış tabakasını temsil eden murin epidermal tabakalarının ex vivo bir enfeksiyon modeli oluşturduk.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Bu makalede, bakteriyel keratitin ex vivo porcine modelini kurmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Pseudomonas aeruginosa prototipik bir organizma olarak kullanılır. Bu yenilikçi model in vivo enfeksiyonu taklit eder, çünkü bakteri çoğalması bakterinin kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlıdır.

Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.

Organ Kültürü Domuz Korneaları Kullanılarak Terapötik ve Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi ve Epitel Yara İyileşmesi

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Keşfedin, domuz kornea doku eksplant modeli kullanarak Herpes Simpleks Virüs-1 antivirallerinin etkinliğini değerlendirme yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, in vitro bulguların klinik uygulamalara aktarılmasını kolaylaştırır.

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Daha fazla video keşfet