Name: Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Öğrenin canlı pankreas doku dilimleri yöntemiyle adacık fonksiyonu ve bağışıklık hücre etkileşimlerini incelemeyi. Bu teknik, tip 1 ve tip 2 diyabet gibi hastalıkların patolojilerini koruyarak gerçek zamanlı gözlem imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ve P01 AI042288 hibeleri tarafından finanse edildi. Bu araştırma Diyabetli Pankreas Organ bağışçıları Ağı (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) ve Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) sponsorluğunda ortak tip 1 diyabet araştırma projesidir. İfade edilen içerik ve görüşler yazarların sorumluluğundadır ve nPOD'un resmi görünümünü yansıtmak zorunda değildir. Araştırma kaynakları sağlamak için nPOD ile ortaklık sağlayan Organ Tedarik Kuruluşları (OPO) http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/'de listelenmiştir. Florida Üniversitesi'nden Dr. Kevin Otto'ya fare dilimleri üretmek için kullanılan vibratomu sağladığınız için teşekkür ederiz.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Bu protokolün amacı, pankreas dilimlerinin neslini ve dilimleri fonksiyonel ve immünolojik çalışmalarda çalıştırmak için gereken prosedürleri ortadan çıkarmaktır. Canlı pankreas dilimleri kullanmanın birçok faydası vardır. Bununla birlikte, açıklanan deney protokolleri sırasında dokunun canlı ve yararlı kalması için gerekli olan birkaç kritik adım vardır. Hızlı çalışmak zorunludur. Doku canlılığını korumak için pankreasın enjekte edilmesi ile vibratom üzerindeki dilimlerin üretilmesi arasındaki süre en aza indirilmelidir...

Pankreasın tutulumu pankreatit, T1D ve T2D1,2,3 gibi hastalıklara patognomoniktir. İzole adacıklardaki fonksiyon çalışması genellikle adacıkların çevrelerinden uzaklaştırılmasını içerir4. Canlı pankreas dokusu dilim yöntemi, sağlam adacık mikroçevrelerini korurken ve stresli adacık izolasyon prosedürlerinin kullanımından kaçınırken pankreas dokusunun incelenmesine olanak sağlamak için geliştirilmiştir5,6,7. İnsan donör dokusundan alınan pankreas dokusu dilimleri T1D'yi incelemek için başarıyla kullanılmış ve immün hücre infiltrasyonunun yanı sıra beta hücre kaybı ve işlev bozukluğu süreçlerini göstermiştir8,9,10,11,12,13. Canlı pankreas dokusu dilimleme yöntemi hem fare hem de insan pankreas dokusuna uygulanabilir5,6,8. Organ donör dokularından insan pankreas dokusu dilimleri, Diyabetli Pankreas Organ Bağışçıları Ağı (nPOD) ile işbirliği ile elde edilir. Fare dilimleri çeşitli farklı fare suşlarından oluşturulabilir.
Bu protokol, gen-1-null 'ı (NOD) aktive eden obez olmayan diyabetik-rekombinasyona odaklanacaktır. Rag1-/-) ve T hücre reseptör transgenik (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) fare suşları. NOD. Rag1-/- fareler, rekombinasyon aktive edici gen 1 (Rag1)14'teki bir bozulma nedeniyle T ve B hücreleri geliştiremezler. NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fareleri hızlandırılmış tip 1 diyabet için bir model olarak kullanılır, çünkü insülin epitopunu hedefleyen tek bir T hücre klonu üretirler, bu da tutarlı adacık infiltişi ve hızlı hastalık gelişimi ile sonuçlanır15. Burada yer alan protokolde konfokal mikroskopi yaklaşımlarının uygulanması yoluyla canlı insan ve fare pankreas dilimleri kullanılarak fonksiyonel ve immünolojik çalışmalara yönelik prosedürler açıklanmaktadır. Burada açıklanan teknikler arasında canlılık değerlendirmeleri, adacık tanımlama ve konum, sitozolitik Ca2+ kayıtlarının yanı sıra bağışıklık hücresi popülasyonlarının lekelenerek tanımlanması yer almaktadır.

<table><tbody><tr><td>#3 Stil Neşter Saplı</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES Tamponu, 1M</td></tr><tr><td>Çözelti 10 cm İşlenmemiş Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Şırınga</td><td>BD</td><td>301029</td><td>Luer-Lok Uçlu BD Şırınga</td></tr><tr><td>27 G İğne</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD Genel Kullanım ve PrecisionGlide Hipodermik İğneler</td></tr><tr><td>35 mm kapaklı cam tabanlı Petri kabı</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-Dish 35 mm, yüksek</td></tr><tr><td>50 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu odacıklı kapak camı</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Kuyulu</td></tr><tr><td>APC anti-fare CD8a antikoru</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (dihidrat)</td></tr><tr><td>Kompakt Dijital Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>İğne deliği&thinsp;= 1.5-2 havadar birim; 512&thinsp'de 10x/0.40 sayısal açıklık HC PL APO CS2 kuru ve 20x/0.75 sayısal açıklık HC PL APO CS2 kuru objektif ile elde edilir; &zamanlar; &ince; 512 piksel çözünürlük</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</sub</td></tr><tr><td>>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Dimetil sülfoksit</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm doku kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Kolay Tutuşlu Doku Kültürü Yemekleri</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Cerrahi Bıçak Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>hücre geçirgen Ca2+ göstergesi</td></tr><tr><td>Jel Kontrolü Süper Yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Sertleştirilmiş İnce Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veteriner</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Kelepçe</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-7440</td> <td>ve nbsp; Düz; 500-900 gram basınç; 1.5" Uzunluk</td></tr><tr><td></td><td>Kimwipes Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Bilim ve Ticaret; Kimmendil ve ticaret; Hassas Görev Silecekleri, 2 Katlı</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Bu kit, kalsein-canlı hücre boyası içerir.</td></tr><tr><td>Düşük glikozlu DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl<alt>2</alt> (heksahidrat)</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO<alt>4</alt> (heptahidrat)</td></tr><tr><td>Manyetik Isıtmalı Platform</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>Dinamik stimülasyon için görüntüleme odası platformu kayıtlar</td></tr><tr><td></td><td>Mikrodalga GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Şırınga Filtresi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Boya Fırçası</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Açık Elmas Banyosu Görüntüleme Odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>Dinamik stimülasyon kayıtları için görüntüleme odası</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>hücre geçirgen Ca2+ göstergesi</td></tr><tr><td>Gece görüntüleme odası</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>Dilim üretimi için agaroz yapmak için</td></tr><tr><td>PE etiketli insülin tetramer</td><td>Emory Tetramer Araştırma Çekirdek</td><td>dizisi YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO 4</td></tr> <tr><td>Vibratom için Jiletli Bıçaklar Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>71998</td><td>; Çift Kenarlı Paslanmaz Çelik, kaplamasız</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque düşük erime noktalı agaroz</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>Dilim üretimi için agaroz yapmak için</td></tr><tr><td>Dilim çapa</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Dilim çapa (dinamik görüntüleme)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Dinamik görüntüleme odası</td></tr> <tr><td>için dilim ankrajSodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monohidrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH 2 PO > (monohidrat)</td></tr> <tr><td>Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Glycine max'tan (soya fasulyesi)</td></tr> <tr><td>Aşama Adaptör</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>Mikroskop sahnesinde dinamik stimülasyon kayıtları için görüntüleme odasına sığdırmak için</td></tr><tr><td>Sahne üstü inkübatör</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Mavi Ölü Hücre Lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>mavi-floresan nükleik asit lekesi</td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Şahin ve ticaret; Plastik Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri</td></tr><tr><td>Valf Kontrol Sistemi</td> Dinamik <td>stimülasyon kayıtları için</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td> Sistemi</tr><tr><td>Vibratom VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp Genel Amaçlı Deluxe Su Banyosu GPD 02</td></tr></tbody></table>

canlı pankreas doku dilimlerinde adacık fonksiyonu ve adacık-İmmün hücre etkileşimlerinin gözlemlenmesi

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Canlı pankreas doku dilimleri, adacık fizyolojisinin incelenmesine ve bozulmamış bir adacık mikroçevresi bağlamında işleve izin verir. Dilimler agarose içine gömülü canlı insan ve fare pankreas dokusundan hazırlanır ve vibratom kullanılarak kesilir. Bu yöntem, dokunun tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) gibi altta kalan patolojileri korumanın yanı sıra canlılığını ve işlevini korumasını sağlar. Dilim yöntemi, pankreasın endokrin ve ekzokrin dokularını oluşturan karmaşık yapıların ve çeşitli hücreler arası etkileşimlerin sürdürülmesi yoluyla pankreasın incelenmesinde yeni yönler sağlar. Bu protokol, adacık fizyolojisi değerlendirmeleri ile birlikte pankreas dilimleri içindeki canlı endojen bağışıklık hücrelerinin lekeleme ve zaman atlamalı mikroskopisinin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir. Ayrıca, bu yaklaşım, ana histocompatibility complex-multimer reaktifler kullanılarak adacık hücresi antijenlerine özgü immün hücre popülasyonlarını ayırt etmek için rafine edilebilir.

Bu protokol hem işlevsellik çalışmalarına hem de immün hücre kayıtlarına uygun canlı pankreas doku dilimleri sağlayacaktır. Hem parlak alanda hem de yansıyan ışığın altındaki dilim görünümü Şekil 1A,B'de gösterilmiştir. Tartışıldığı gibi, adacıklar, insülin içeriği nedeniyle ortaya çıkan artan tanecikleri nedeniyle yansıyan ışığı kullanarak dilimler halinde bulunabilir (Şekil 1C) ve yansıyan ışık kullanıldığında arka plan dokusuna göre açıkça gö...

Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Protokolümüz, bağışıklık hücresi etkileşimlerinin adacık işlevselliği üzerindeki etkisini yanıtlamaya yardımcı olacaktır. Canlı pankreas doku dilimi yöntemi, patolojilerin ve doğal mikroçevrenin altında kalan dokuların korunması sırasında adacık fizyolojisinin ve işlevinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem pankreatit, tip I diyabet ve tip II diyabet gibi pankreas hastalıklarının hastalık süreçleri hakkında fikir verebilir.Başlamak için, numune tutucusun üzerindeki blokları bıçak genişliğini aşmayacak şekilde düzenleyin, vibratom yavaşça hareket ettiğinde bıçağın mümkün olan en az mesafeyi ilerleyebilmesini sağlayın. Numune tutucusuna bir süper tutkal hattı uygulayın, tutkal dağıtıcısının ucunun ucunun kullanılarak ince bir tabaka haline getirilir, ardından doku bloklarını yapıştırıcıya çevirin, böylece dokuya yakın taraf yukarı doğru yüzler. Blokları yavaşça aşağı itin ve tutkalın üç dakika kurumasına izin verin.Daha sonra, plakayı vibratome bir vida ile takın ve bıçak yüksekliğini ve kat edilen mesafeyi, bıçağın blokların uzunluğu üzerinde ve hemen üstünde hareket etmesi için ayarlayın. Tutkalın kuruduğunu kontrol etmek için blokları forsepslerle hafifçe iteleyin ve ardından vibratom tepsisini bıçak kaplanana kadar soğutulmuş hücre dışı bir çözelti ile doldurun. Vibratomu 120 mikrometre kalınlığında dilimler yapacak şekilde ayarlayın ve başlatın, ardından doku bloklarından çıkan dilimleri gözlemleyin.Altına bir boya fırçası veya tokalar yerleştirerek bloktan yüzdüklerinde dilimleri kaldırın ve dilimleri üç milimoler D-glikoz ve tripsin inhibitörü içeren Krebs-Ringer bikarbonat tampona yerleştirin. Dilimleri içeren tabakları bir rocker üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 25 RPM'de bir saat kuluçkaya yaslayın. Dilimlerin daha uzun süre tutulması gerekiyorsa, dilimleri 15 mililitre dilim kültürü ortamına yerleştirin ve plakayı bir inkübatöre yerleştirin.Hazırlanan dilimleri aynı gün çalışmaları için 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın veya bir gecede 24 santigrat derecede kültüre edilen dilimleri deneyden önce en az bir saat boyunca 37 santigrat dereceye aktarın. Kayıtten en az bir saat önce mikroskobu aç ve sahne üst inkübatörü 37 santigrat dereceye kadar dengele. Sahnedeki dilimi içeren kapak cam alt Petri kabını sabitleyin.Parlak alan modunda 10X hedefini ayarlayarak mikroskobu odakla ve dilim içinde turuncu kahverengi renkli ovaller arayarak parlak alan modunu kullanarak adacıkları bulun. Mikroskopun dokunmatik ekran denetleyicisindeki CS düğmesine basarak mikroskobu konfokal görüntülemeye geçirin. Adacıkları yansıtıcı kullanarak görüntülemek için 638 lazer dedektörünü ve PMT dedektörünü açın.Lazer gücünü %1 ile %2 arasında ayarlayın ve çentik filtrelerini kapatın. Nükleik asit lekesini gözlemlemek için 405 nanometre lazer ve PMT dedektörünü kullanın. CD8 antikor tespiti için hibrit dedektör ve insülin tetramerini görüntülemek için 488 nanometre lazer ve hibrit dedektör.Sahne alanı denetleyicisinin X ve Y düğmelerini kullanarak görüş alanındaki ilgi adacını ortaleyin. Bir ilgi adacık bulunduğunda, 20X hedefine geçin ve adacık çerçevenin çoğunu kaplasın diye yakınlaştırın. Adacıktan bir z yığını alın, ardından hücrelerin canlı olduğu ve çevredeki bağışıklık hücrelerinin odaklandığı en iyi optik bölümleri bulun.Mikroskobu XYZT modunda kaydedecek şekilde ayarlayın ve birkaç saatlik bir süre boyunca her 20 dakikada bir seçilen adımların z yığınını kaydetmek için ayarları optimize edin. Pankreas dokusu dilimindeki adacıklar brightfield kullanılarak görselleştirildi ve ışık mikroskopisi yansıtıldı. Adacıklardaki insülin tanecikleri arttırır ve büyük miktarlarda yansıyan ışığın emilimine neden olarak adacıkların görünürlüğünü arttırır.Canlı bir insan pankreas doku diliminin uygulanabilirliği lekelenerek değerlendirildi. Canlı hücreler yeşil, ölü hücreler ise mavi ile gösterilir. Canlılık için bir başka olumlu gösterge de gözlemlenebilir bazal aktivitedir.Canlı bir pankreas dilimine hücre geçirgen kalsiyum göstergesi yüklendiğinde, hem fare hem de insan pankreas dilimlerinde glikoz stimülasyonu gözlendi. Glikoz stimülasyonu sırasında tek tek hücrelerin floresanları da ölçüldü. Dithizone boyama ve yansıyan ışık mikroskopisi kullanılarak sağlam ve hastalıklı adacıklar gözlendi.Hastalıklı adacıklar bağışıklık hücresine sızma ve hücre ölümü nedeniyle taneciklerini kaybetmeye başlar. Bağışıklık hücresi popülasyonları CD8 antikorları ve insülin tetramer lekeleme kullanılarak tanımlanabilir. Birlikte boyama, hücrelerin özellikle insülin antijenini hedef alan efektör T hücresi olduğunu gösterir.Bu prosedürde hatırlanması gereken en kritik şey, dilimleri her zaman çözelti proteaz inhibitöründe tutmaktır. Bu işlemden sonra, immün hücre etkileşimlerinin ve adacık fonksiyonunun etkisinin incelenmesini sağlayan bağışıklık hücresi deneylerinde çok sayıda işlevsellik yapılabilir.

observing-islet-function-islet-immune-cell-interactions-live

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Immünohistokimyasal lekeli pankreas örneklerin büyük ölçekli satın alma ve analiz Roman bilgisayar destekli yöntemler açıklanmıştır: (1) Sanal Dilim yakalama bölümün tamamını, büyük ölçekli veri (2) Kütle analiz 2D Sanal Dilimleri (3) İmar (4) 3D adacık haritalama ve (5) matematiksel analizi.

Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Ex vivo pankreas adacık çalışmalar diyabet araştırma için önemlidir. Onların yerli 3 boyutlu mimari kültürlü adacıkları çalışmaya varolan zaman alıcı, verimsiz ve az kullanılan tekniklerdir. Bu eser bütün kültürlü adacıkları yüksek kalitede parafin bölümleri oluşturmak için yeni, basit ve etkili bir yöntem açıklanır.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Akut pankreas doku dilimlerinin hazırlanmasını ve konfokal lazer tarama mikroskobunda kullanımını, kalsiyum dinamiklerini aynı anda çok sayıda canlı hücrede, uzun zaman periyotlarında ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlükte incelemek için sunuyoruz.

Akut Fare Pankreas Doku Dilimlerinde Kalsiyum Dinamiğinin Konfokal Lazer Tarama Mikroskopisi

Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.

Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi

Bu protokol, yakın fizyolojik koşullar altında hücre fonksiyonunu incelemek için ölen organ bağışçılarından insan pankreas dilimlerinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu yenilikçi yaklaşım, normal ve yapısal olarak hasar görmüş adacıkların araştırılmasını ve endokrin ve ekzokrin kompartmanlar arasındaki karmaşık etkileşimi sağlar.

Endokrin ve Ekzokrin Pankreas Fizyolojisini İncelemek için İnsan Pankreas Dokusu Dilimlerinin Oluşturulması

Öğrenin canlı pankreas doku dilimleri yöntemiyle adacık fonksiyonu ve bağışıklık hücre etkileşimlerini incelemeyi. Bu teknik, tip 1 ve tip 2 diyabet gibi hastalıkların patolojilerini koruyarak gerçek zamanlı gözlem imkanı sunar.

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Daha fazla video keşfet