Name: İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin, iPSC-kökenli makrofajlar ve pH-duyarlı boyalı ölü SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri kullanarak mikroglial fagositozu nicel olarak değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir in vitro görüntüleme yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, yüksek içerikli mikroskopiye yardımlarından dolayı Dr. Val Millar ve Dr. Sohaib Nizami'ye ve yüksek içerikli mikroskoplara erişim için Dr. Daniel Ebner'e teşekkür ediyor. Ayrıca, yazarlar dr. Emma Mead'e test geliştirme tavsiyeleri için ve Bayan Cathy Browne'a iPSC desteği için teşekkür eder. Bu çalışma, Oxford Martin School LC0910-004'ten James Martin Kök Hücre Tesisi Oxford'a (S.A.C.) ek destekle Alzheimer Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, grant reference ARUK-2020DDI-OX) tarafından desteklendi; Parkinson İngiltere'den Monument Trust Discovery Ödülü (J-1403); MRC Demans Platformu İngiltere Kök Hücre Ağı Sermaye Ekipmanları MC_EX_MR/N50192X/1, Ortaklık MR/N013255/1 ve Momentum MC_PC_16034 Ödülleri.

<ol><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748(2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li>
<li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+in+the+brain%3A+Homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790(2019).</li>
<li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li>
<li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li>
<li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380(2020).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136(2020).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684(2019).</li>
<li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li>
<li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li>
<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li>
<li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+robust+Z%27+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).</li>
<li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+%CE%B1-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson%27s+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li>
<li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia%2Fbrain+macrophages+in+vitro%3A+Involvement+of+lectin-%2C+integrin-%2C+and+phosphatidylserine-mediated+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li>
<li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li>
<li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49(2018).</li>
<li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li>
<li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikroglia, apoptotik nöronların fagositozu da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların başlatılmasını ve ilerlemesini etkileyen önemli işlevlere sahiptir. Bozulmuş mikroglial fagositoz ve sinapsların uygunsuz fagositozu, alttaki mekanizmalar ve nedensellik iyi anlaşılmasa da nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir4,23. Bu makalede, apoptotik hücrelerin fagositozunu iPSC-makrofajlarla ölçmek için bir fagositoz tahlilini özetlemektedir, canlı hücreli zaman atlamalı görüntüleme okuması veya sabit hücreli yüksek içerikli mikroskopi veya her ikisinin bir kombinasyonu tek bir testte. Bu çok yönlülük, tahlillerin zaman içinde birkaç kuyuda bireysel fagositik olayları incelemek için kullanılabileceği veya birden fazla koşul veya tedavi ile yüksek içerikli tarama için kullanılabileceği anlamına gelir. Yüksek içerikli tahlil tek bir zaman noktasında sabit olduğundan, aynı anda birden fazla tahlil plakası hazırlanabilir. Yüksek içerikli test, makrofajları / mikrogliayı hastalıkla ilişkili genetik varyantlarla karakterize etmek veya fagositoz değişiklikleri için küçük molekül inhibitörlerini taramak için potansiyel bir yardımcılığa sahiptir. Test ayrıca diğer mikroglia modellerinin fagositozunu veya potansiyel olarak astrositleri incelemek için kolayca uyarlanabilir. Fagositoz tahlili potansiyel olarak canlı hücre görüntüleme lekeleri ile çoklayıcı olabilir, örneğin mitokondri, kalsiyum veya ROS göstergeleri ve ilgi çekici proteinler için fiksasyon sonrası immünofluoresan boyama yapılabilir. Apoptotik nöronal hücreleri kullanan mevcut fagositoz testleriyle karşılaştırıldığında, bu protokolün sağladığı temel avantajlar, fagositik yükün hazırlanmasının nispeten basit ve hızlı olması ve tek tip bir ürünle sonuçlanmasıdır. Diğer tahliller nöronların veya SH-SY5Y'lerin 2 h 25 için S-nitroso-L-sistein, 3 h22için okadaikasit,stauro 4-16 h26,27 ,28,29veya24 h30için UV ışınlama içinsporin ve apoptozun farklı aşamalarında hücrelere neden olabilir. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme ve yüksek içerikli görüntüleme okumaları, yazarların bildiği kadarıyla daha önce açıklanmamıştır. Fagositik kargoyu hazırlamak için paraformaldehit fiksasyonunu kullanmanın ana sınırlaması, apoptoz sürecini tam olarak repapitoz haline vermemesidir, çünkü fiksasyon hücrelerin daha küçük boyutları nedeniyle daha hızlı bir şekilde fagositoz yapılması muhtemel apoptotik cisimlere bölünmesini önler. Fiksasyonun, fagositleri çeken hedef hücreden nükleotid "beni bul" sinyallerinin (örneğin, ATP, UDP) salgılanması üzerinde nasıl bir etkisi olduğu bilinmemektedir. Apoptotik hücrelere benzer şekilde, sabit SH-SY5Y'ler propidium iyodüre bazı membran geçirgenliği sergiler. Membran geçirgenliği "beni bul" sinyallerinin serbest bırakılmasıyla ilişkilidir; ancak, bu sabit SH-SY5Y'lerde çalışılmamıştır ve nükleotid çok hızlı bir şekilde serbest bırakılırsa, SH-SY5Y'ler iPSC-makrofajlara eklenmeden önce yıkanırlar.
Protokoldeki ilk kritik adım, ölü SH-SY5Y'lerin pH'a duyarlı kırmızı floresan boyanın STP esteriyle boyanmasıdır. Bu boya, ölü SH-SY5Y'lerin yüzeyinde serbest birincil aminlerle hızlı ve yaygın bir şekilde reaksiyona sokulur. Boyama süresinin optimize edilmesi gerekmez; ancak etiketlemeden önce boyanın işlenmesine dikkat edilmelidir. Etiketleme reaksiyonu serbest amin içeren tamponlarda yapılmamalıdır. Ayrıca, DMSO stoğu soğuk sulu tamponda veya yüksek son konsantrasyonda seyreltilirse yağış riski vardır. Çökelticiler mikroskop altında yoğun koyu nesneler olarak görünecektir. Ek olarak, pH'a duyarlı boya çözeltisi normal plastik santrifüj tüplerine yapışır ve yavaşça yıkanır; bu nedenle, etiketleme adımı için düşük bağlayıcı tüpler önerilir. Kalıcı olarak floresan boya yerine pH'a duyarlı bir boyanın kullanılması, plazma zarını komşu olan parçacıklara karşı, yutulan parçacıkların tanımlanmasına yardımcı olur. Nötr pH'da bir miktar floresan olduğundan, fagositik kargo ve iPSC makrofajlarının yoğunluğunun doğru segmentasyon için yeterince düşük tutulması gerekir, ancak çok sayıda fagositik olay yakalanacak kadar yüksektir. Yüksek içerikli mikroskopi, kuyuda orta yoğunlukta kargo (iPSC-makrofaj başına 2 SH-SY5Y'den fazla) ile fagositozu doğru bir şekilde tanımlayabiliyordu. Tersine, derin kırmızı spektrumdaki mikroskobun daha zayıf hassasiyeti nedeniyle, canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme verilerindeki iPSC-makrofajların segmentasyonu daha az özgüvenliydi ve yanlış pozitif olasılığını azaltmak için çok düşük bir kargo yoğunluğu kullanmak gerekiyordu (her iki iPSC makrofajı için 1 SH-SY5Y). Uygun segmentasyon ve kargo yoğunluğunun doğrulanması, tedavi edilmemiş ve sitochalasin D-tedavi edilen kuyular arasındaki karşılaştırmalarla yapılmalıdır. İyi optimize edilmiş bir testte, sitochalasin D, tedavi edilmemiş örneklere göre hücre başına ortalama nokta sayısını% 90 azaltmalıdır.
Protokoldeki bir diğer kritik adım, hücrenin görüntü analizinde tanımlanmasını ve segmentlere ayrıştırılmasını sağlayan iPSC-makrofaj boyamadır, böylece herhangi bir harici SH-SY5Y'ler sayım dışı bırakılmıştır. Önerilen boya hücre geçirgendir, sitoplazma içinde çözünmeyen bir floresan ürüne dönüştürülür, sabitlenebilir ve toksik değildir (bkz. Malzeme Tablosu). Boyama adımı, yüksek içerikli görüntüleme fagositozu testine sahip iPSC-makrofajların kullanımı için optimize edilmiştir ve diğer hücre tipleri kullanılırsa yeniden optimize edilmesini öneririz. Çözünmeyen floresan ürünün hücreler içindeki birikimini iyileştirmek için hücre boyama süresi arttırılabilir. Boya konsantrasyonu optimize edilmişse, organik çözücü aracın toksik seviyelerinden kaçınmaya özen edilmelidir.
Tahlilin başarısında üçüncü kritik faktör veri analizidir. Sağlanan analiz işlem hatları, boyama yoğunluğuna veya hücre morfolojisine olan farklılıklar, yazıldığı gibi işlem hatlarının segmentasyon etkinliğini azaltabileceğinden, kuralcı değil, rehberlik amaçlıdır. Bu nedenle, işlem hattının uygun pozitif ve negatif denetimler üzerinde test edilmesiyle bazı iyileştirmeler gerekecektir ve en iyi duruma getirilmesi gereken parametreler protokol metninde belirtilir. Negatif kontroller, SH-SY5Y'ler eklenmeden önce iPSC-makrofajların sitalazisin D gibi güçlü bir fagositoz inhibitörü ile önceden tedavi edildiği bir durumu içermelidir. Başka bir olası olumsuz kontrol, Ş-SY5Y'lerin daha önce tedavi edilmemiş iPSC-makrofaj kuyularına eklenmesidir, tahlilden 10 dakika önce, bu da kargonun bir miktar yerleşmesine izin verir, ancak kayda değer miktarda fagositozun gerçekleşmesi için çok kısadır. Fagositoz olayı, derin kırmızı floresan kanalını kullanan yazılım algoritması tarafından tanımlanan bir iPSC makrofajının sınırları içinde kırmızı floresan bir nesne olarak tanımlanır. Hücrelerin segmentasyonu zayıfsa (Şekil 2), iPSC-makrofajlara yakın birçok fagositozlu olmayan SH-SY5Y analize hatalı olarak dahil edilebilir, yani yanlış pozitifler. İyi segmentasyon elde etmedeki en önemli faktör, iPSC makrofajlarının sıkı bir şekilde tanımlamasıdır. Her iki analiz için segmentasyon otomatiktir, bu nedenle her hücre için mükemmel segmentasyon elde etmek mümkün değildir; ancak, referans olarak birkaç test görüntüsü kullanılarak segmentasyonu daha uygun hale getirmek için birkaç parametre ayarlanabilir. Sitachalasin D kontrolü optimal segmentasyonu değerlendirmek için önemlidir, çünkü bu durumda tespit edilen yüksek sayıda fagositik olay segmentasyonun en uygunun altında olduğunu gösterir. Veri analizi boru hattının optimizasyonu ideal olarak, sitochalasin D durumunda hücre başına fagositik olay sayısı% 80-% 90 daha düşük olana kadar tekrarlanmalıdır.
Fagositoz tahlilinde meydana gelme olasılığı en yüksek olan problemler şunlardır: (1) pozitif kontrollerde zayıf pH'a duyarlı floresan, (2) tahlil sonundaki makrofajların seyrek veya düzensiz dağılımı veya (3) fagositozlu olmayan SH-SY5Y'lerden yapılan analizlerde yüksek sayıda yanlış pozitif. Zayıf pH'a duyarlı floresan sorunlarının giderilmesi öncelikle SH-SY5Y'lerin lekelenmelerinin güçlü bir macenta rengine sahip bir hücre peletiyle sonuçlanıp sonuçlanmadığını kontrol etmelidir. Renk zayıfsa, taze bir boya stoğu kullanıldığından emin olun, etiketleme tamponunun aminsiz olduğundan emin olun, boyamadan önce SH-SY5Y'lere ekstra bir yıkama ekleyin, doğru sh-SY5Y sayısının lekeli olup olmadığını kontrol edin, hiçbir boya çökeltisinin kanıtta olmadığından emin olun ve boyanın etiketleme konsantrasyonunu optimize edin. SH-SY5Y'ler güçlü bir şekilde lekelenmişse, test plakasına eklenen konsantrasyonun doğru olup olmadığını kontrol edin ve iPSC makrofajlarının sağlıklı ve çok eski olmadığından emin olun. İkinci tür sorun, düzensiz makrofaj dağılımı, pipetleme sırasında hücre kaybından neden olabilir ve hücrelerin yaşadığı pipetleme kuvvetlerini azaltmak için adımlar atılmalı, dar delikli uçlardan kaçınılmalıdır. Sorun devam ederse, iPSC makrofajlarını hücre geçirgen boyası ile yüklemenin kuluçka süresini azaltın. Üçüncü sorun, fagositozsuz parçacıkların analize hatalı bir şekilde dahil edilmesiyle ilgili olarak, analiz işlem hattının daha fazla optimizasyonunun gerekli olduğunu gösterir. Sorun giderme, öncelikle hücre segmentasyonuna ve yazılımın bitişik nesneleri içerip dahil etmediğine odaklanmalıdır. Ayarlanabilen belirli parametreler ilgili adımların altındaki notlarda önerilmektedir (canlı hücre zaman atlamalı analizi için adım 6.1.11-6.1.15 ve yüksek içerik analizi için 6.2.4-6.2.8 adımları). Hücre segmentasyonu daha da geliştirilemezse, yüksek içerik analizinin yanlış bölümlenmiş iPSC makrofajlarını dışlayan ek bir adımı (adım 6.2.8) vardır. Ayrıca, iPSC makrofajlarında pH'a duyarlı floresanların kabul edilen noktalarını filtreleyen modül optimize edilebilir, bu da kabul edilen nesnelerin eşik yoğunluğunu artırarak, fagositozlu olmayan SH-SY5Y'leri (canlı hücre zaman atlamalı analizi için adım 6.1.17 ve yüksek içerik analizi için adım 6.2.11) dışlamaya yardımcı olmalıdır.
Fagositoz tahlilleri için her birinin avantajları ve sınırlamaları olan iki tip mikroskopi okuması geliştirdik. Canlı hücreli zaman atlamalı görüntüleme, fagositoz kinetiği hakkında ekstra bilgi sağlamanın yararlarına sahiptir ve yüksek içerikli görüntüleme platformlarından daha yaygın olarak kullanılabilir. Önerilen açık kaynaklı yazılım mikroskop kaynağına göre agnostiktir ve canlı hücre zaman atlamalı veya canlı hücreli zaman atlamalı olsun veya olmasın, herhangi bir kaliteli floresan mikroskopla kullanılabilir. Canlı hücre görüntülemenin ana sınırlaması sınırlı hassasiyet ve optiktir, bu da iPSC makrofajlarının iyi segmentasyonunu tespit etmeyi ve gerçekleştirmeyi daha zor hale getirir. Bu sınırlama, iPSC-makrofaj boyama süresini artırarak veya varsa daha hassas bir mikroskopa geçerek azaltılabilir. Yüksek içerikli görüntüleme fagositozu tahlili, yüksek içerikli bir görüntüleme sistemi varsa önerilen okumadır. Yüksek içerikli görüntüleme sistemleri, daha yüksek aktarım hızı ve daha güvenilir veriler sağlar ve bu tahlilin tarama için kullanılmasını sağlar, bu da "hücre başına nokta sayısı" çıkışı20için ≥7'lik sağlam bir Z' beklenir. Canlı hücre zaman atlamalı yöntemi ile karşılaştırıldığında, yüksek içerikli mikroskopi okuma daha yüksek hassasiyete, daha yüksek otomasyon ve hız derecesına sahiptir, daha fazla kuyu ve görüntüleme alanı işlenebilir ve yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler üretilir. Hücre segmentasyonu iyi görüntülerle daha etkilidir ve segmentasyon ayrıca son derece düzensiz şekilli hücreler için uygun daha fazla hücre segmentasyon yöntemi sağlayan yüksek içerikli görüntüleme analiz yazılımı ile desteklenmiştir. Yüksek içerikli görüntüleme analizi yazılımı ayrıca, fagositik hücrelerin yüzdesi gibi açık kaynaklı yazılımla karşılaştırıldığında daha fazla fagositoz parametresi hesapladı. Yüksek içerikli fagositoz testinin ana sınırlaması, görüntüleme sisteminin ve analiz yazılımının maliyet ve erişilebilirliklerinden biridir.
Sonuç olarak, bu makalede sunulan nicel fagositoz tahlilleri, ölü nöronların in vitro mikroglia fagositozunu modellemek için yararlı bir araçtır. Mikroglia iPSC-makrofajlar tarafından modellenir ve ölü nöronlar paraformaldehit sabit SH-SY5Y'ler tarafından modellenir. Yayınlanan en otantik mikroglia ve ölü/ apoptotik nöron modelleri olmasa da, bunlar hazırlanması kolaydır ve ölçeklenebilir. Testin kendisi çok yönlüdür, iki tür görüntüleme okuması ayrıntılıdır ve farklı mikroglia / makrofaj monokültür modelleri veya fagositik kargo olarak hareket etmek için farklı bir hücre tipi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yüksek içerikli görüntüleme okuması nicel veri elde etmek için avantajlıdır ve fagositozun küçük molekül modülatörlerini veya iPSC makrofajlarındaki ekran genetik varyantlarını test etmek için ölçeklendirilebilir. Bununla birlikte, yüksek içerikli görüntüleme sistemleri pahalı ve veri ağırlıklı olduğundan, gerekirse herhangi bir kaliteli geleneksel floresan mikroskobun yerine ikame edilebilecek canlı hücreli bir zaman atlamalı mikroskop kullanılarak protokole alternatif bir görüntüleme okuması dahil edilmiştir.

Mikroglia beyin dokusu yerleşik makrofajlardır ve işlevleri bağışıklık gözetimi, yaralanma / enfeksiyona enflamatuar yanıtları koordine etme, sinaptik yeniden şekillendirme ve ölü hücrelerin, miyelin, protein agregaları ve patojenlerin fagositozunu içerir. Fagositoz, mikroglia'nın yüzey reseptörleri ile kargoyu tanıdığı ve sitoskeletonlarını nesneyi bir fagogoz içine sarmak için yeniden düzenlediği ve daha sonra kargonun bozulması için lizozomlarla kaynaştığı süreçtir. Sağlıklı mikroglia fagositoz apoptotik beyin hücrelerini nekrotik olmadan önce çıkarmakiçin 1. Apoptotik hücrelerin fagositozu efferositoz olarak da bilinir ve ölmekte olan hücre tarafından fosfatidiylserine "eat-me" sinyalinin gösterilmesini gerektirir2. TIM-4, BAI1, Stabilin-2 ve TREM2 dahil olmak üzere çok sayıda mikroglia reseptörü doğrudan fosfatidiylserine bağlanır. Mikroglial TAM reseptörleri (örneğin, MERTK) ve integrinler sırasıyla GAS6 veya MFG-E8 aksesuar proteinlerini kullanarak dolaylı olarak fosfatidiylserine bağlanır. Diğer "beni ye" sinyalleri ölmekte olan hücrelerin tanınması için gerekli olabilir, bunlar glikosilasyon değişiklikleri veya yüzey proteinlerinin şarjını içerir; hücre içi proteinlerin ekspresyözü ICAM3, kalretikülin, hücre yüzeyinde annexin-I; oksitlenmiş LDL; veya apoptotik hücrenin mikroglia tarafından üretilen tamamlayıcı C1q1,2ile kaplanması.
Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, frontotemporal demans ve amyotrofik lateral skleroz da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar, ölü hücreler, miyelin parçaları ve protein agregaları gibi beyin atık ürünlerinin birikmesi ve bu uyaranlara abartılı enflamatuar yanıtlar da dahil olmak üzere mikroglia fonksiyonuna bozulma ile ilişkilendirilmiştir3. Fagositoz nörodejeneratif hastalıklarda bozulabilir ve yaşlanma, inflamasyon veya spesifik genetik risk varyantlarının bir kombinasyonu nedeniyle patolojiye katkıda bulunabilir4,5. Öte yandan, mikroglia'nın uygun nöronları veya sinapsları uygunsuz bir şekilde fagositoz haline sokabileceğine dair nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinden de kanıtlarvardır 6,7,8. Mekanizmanın hasarlı nötralizörlerin fosfatidiylserine gösterimi ile tetiklenmesi muhtemeldir, mikroglial fagositoz reseptörleri TREM2 veya GPR56 tarafından doğrudan algılanan veya dolaylı olarak çözünür kompleman C1q ile fosfatidiliserin zenginleştirilmiş membranla algılanan CR3 aracılı fagositoz9,10,11.
Fagositoz fonksiyonunun in vitro tahlilleri, örneğin, mikroglia'daki bir genetik risk varyantının fenotipik etkisini değerlendirmek için, lateks boncuklar4gibi fizyolojik olmayan kargolar kullanılarak sıklıkla gerçekleştirilir. Floresan etiketli bakteriler ve zymosan da fizyolojik olan ancak nörodejeneratif hastalıklarla ilgili olmayan bakteriler kullanılır. Fizyolojik olmayan fagositik kargolar, fagositik yutmanın temel makinelerindeki kusurları tespit etmek için kullanılabilir, ancak apoptotik nöronların fagositozunda ilk "tanıma" adımını doğru bir şekilde modelleyememiştir. Kargonun boyutu, şekli, sertliği ve türü, etkinleştirilen hücre içi sinyal yollarını da dikte eder ve mikroglia aktivasyon durumunun farklı sonuçlarına yol açar. Örneğin, E.coli bakterileri insan hücrelerinin aksine küçük ve serttir ve yüzeylerindeki lipopolisakkaritler fagositoz ve pro-enflamatuar sinyal yollarını aktive eden Toll benzeri reseptör 4 (TLR4) tarafından tanınır2,12.
Nörodejeneratif hastalık çalışmaları bağlamında, daha alakalı bir fagositik kargo, memeli plazma membranlarında fosfatidilinerine ekrana sahip olacak ve mikroglia'nın karşılaşması muhtemel sinyalleri içerecek şekilde ideal olarak insan ve nöronal olacaktır. Bu fagositoz protokolü için insan nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y, kültürü kolay bir nöron modeli olarak seçildi. Kalıcı yüzey fosfatidilizerin ekranı, daha öncetrombositlerinfosfatidilizin görüntülenmesine neden olduğu gösterilen paraformaldehit tarafından yapay olarak indüklenmiştir 13 . Mikroglia hücre modeli için, insan mikrogliasının ontogeny ve transkripsiyonel profilini taklit eden ve fagostik olarak yetkin14 , 15 , 16,17olan insan iPSC-makrofajları kullanılmıştır. iPSC-makrofajlar mevcut en otantik mikroglia modeli değildir, örneğin mikroglia morfolojisini taklit etmezler; ancak, istenirse, Haenseler ve ark.15gibi daha otantik bir monokültür iPSC mikroglia modeli ile ikame edilebilir. İnsan iPSC modelleri, insan ve fare nörodejeneratif hastalık dokularında gözlenen mikroglia transkripsiyonel modüllerinin sınırlı çakışması ile ilgili endişeler nedeniyle nörodejenerasyonu incelemek için birincil kemirgen mikroglia tercih edilir18. Ölü SH-SY5Y'ler, nötr pH'da zayıf ve fagositozdan sonra iPSC makrofajlarının fagolyozomlarının içinde zayıf bir şekilde floresan aside duyarlı bir boya ile lekelenir. Aside duyarlı bir boya kullanmak, fagositik olayları tespit etme doğruluğunu artırır, canlı ve sabit makrofajların farklı okumaları için çok yönlülük19. Bu protokol, hem fagositozun canlı hücre zaman atlamalı görüntülemesini hem de fagositoz için sabit bir yüksek içerikli görüntüleme testini, okumadan önce aynı hücre hazırlama adımlarıyla özetlemektedir (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Şekil 1: Metodolojinin şematik diyagramı. SH-SY5Y'lerin hazırlanması ve iPSC-makrofajların boyanmasına paralel olarak gerçekleştirilen ve daha sonra SH-SY5Y'lerin iPSC-makrofajlara pipetlendiği fagositoz tahlilinin ana hatları. Canlı hücreli zaman atlamalı görüntüleme hemen yapılır veya hücreler gerekli süre boyunca 7 °C/5 CO2'de inkübe edilir ve yüksek içerikli mikroskopi yapılmadan önce sabitlenir. PFA: paraformaldehit, HBM: fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortam, pHr: pH'a duyarlı kırmızı floresan boya STP Ester çözeltisi, PRFMM: fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td>352096</td> 2-20 ve mikro <td>hücrelerin santrifüjlenmesi için</td></tr><tr><td>; L, 20-200 ve mikro; L, 100-1000 ve mikro; L tek kanallı mikropipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol 50 mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Fabrika ortamının bileşeni</td></tr><tr>PBS <td>Alfa Aesar</td><td>J61899'da</td><td>%4 paraformaldehit</td><td>Hücrelerin fiksasyonu için</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka, doku kültürü ile tedavi edilmiş</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AggreWell-800 24 oyuklu plaka</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>34815</td><td>Embriyoid cisimciklerinin oluşumu için mikrokuyu düşük yapışmalı 24 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>Annexin V-FITC Apoptoz Boyama / Tespit Kiti</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Sabit SH-SY5Y'lerin kalite kontrolü için bir test olarak annexin V-FITC boyama kiti. Kit, annexin bağlayıcı tampon, annexin V-FITC ve propidium iyodür içerir.</td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Mikroplakalar, doku kültürü ile işlenmiş, siyah, 96 oyuklu kapaklı</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>Fagositoz tahlili için siyah kuyucuk duvarlı ve optik olarak şeffaf bir tabana sahip 96 oyuklu doku kültürü (TC) ile muamele edilmiş mikroplaka</td></tr><tr><td>CellProfiler yazılımı</td><td></td><td></td><td>Canlı hücre hızlandırılmış mikroskobu ile elde edilen fagositoz görüntülerinin analizi için açık kaynaklı yazılım. Web sitesinden (http://cellprofiler.org/) ücretsiz indirin, bu protokol 2.2.0 sürümünü kullandı.</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red boya</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34565</td><td>iPS-makrofajların sitoplazmasını boyamak için derin kırmızı floresan, hücre geçirgen, süksinimidil ester-reaktif boya. CellTracker Deep Red boyasını DMSO'da 2 mM'ye (1.4 mg / mL) çözün. 1 &mu'da kullanın; M, DMSO stoğunun Makrofaj ortamı ile seyreltilmesiyle.</td></tr><tr><td>Sınıf 2 laminer hava akışı güvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 gaz şişesi</td><td></td><td></td><td>EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>CO2 inkübatör aksesuarı, 37 ° C'ye ayarlanmış; C ve %5 CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus Görüntü Veri Depolama ve Analiz Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Opera Phoenix için veri depolama ve analiz platformu. Tüm önemli yüksek içerikli tarama araçlarını destekler.</td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>Fagositoz testi için negatif kontrol tedavisi. DMSO'da 10 mM'ye kadar sulandırın ve alikotları -20 ° C'de saklayın; C, daha fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının. Son konsantrasyonda 10 &mikro; M'de kullanın.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>SH-SY5Y ortamının Bileşeni</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>CellTracker ve pHrodo boyaları için</td></tr> çözücü <tr><td>EVOS FL Otomatik Görüntüleme Sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMF4300</td><td>Canlı hücreli hızlandırılmış görüntüleme mikroskobu</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto EVOS Light Cube CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>Aksesuarı</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto için EVOS Işık Küpü DAPI</td><td>Termo </td><td>EVOS</td><td>AMEP4650 FL</td> Auto</tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>EVOS FL</td></tr> Auto <tr><td>EVOS için Aksesuar Sahne İnkübatörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>EVOS FL Otomatik</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma</td><td>F4135</td> için Aksesuar <td>SH-SY5Y ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Akış sitometresi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC Nitelikli, Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi</td><td></td><td>iPSC kültürü için invitrogen A1413302 hESC nitelikli bazal membran matrisi</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank' Yıkama adımları için dengeli tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>İnsan rekombinant BMP4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>Embriyoid Vücut ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>İnsan rekombinant IL-3</td><td>Gibco</td><td>PHC0033</td><td>Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>İnsan rekombinant SCF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Embriyoid Vücut ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>İnsan rekombinant VEGF</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>Embriyoid Vücut ortamının Bileşeni</td></tr><tr><td>Canlı Hücre Görüntüleme Çözümü</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>Ölü SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>Düşük protein bağlayıcı 2 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>Boyama için SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC9501</td><td>Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının</td></tr><tr><td>bileşeni mTeSR1 Orta</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>85850</td><td>iPSC ortamı</td></tr><tr><td>Çok Kanallı 20-200 uL pipet</td><td></td><td></td><td>96 oyuklu plakalı</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 formülasyonunun iPS-makrofajların çekirdeklerini boyamak için bir damlalıklı şişede sıvı kullanımı için, Makrofaj ortamında 0,5 damla/mL kullanın.</td></tr><tr><td>Opera Phoenix Yüksek İçerikli Tarama Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>Harmony yazılım sürümü 4.9 ile kullanılan yüksek içerikli görüntüleme mikroskobu.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Fabrika, Makrofaj ve SH-SY5Y ortamının Bileşeni</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Kırmızı STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>ölü SH-SY5Y'leri etiketlemek için pH'a duyarlı kırmızı floresan boya. pHrodo iFL Kırmızı STP Ester tozunu DMSO'da 5 mg / mL konsantrasyona kadar sulandırın. Her 1 milyon SH-SY5Y için 2,5 &mu ekleyin; L (12.5 &mu; g) Canlı Hücre Görüntüleme Solüsyonunda süspanse edilmiş önceden ısıtılmış hücrelere pHrodo iFL Kırmızı STP Ester stoğu.</td></tr><tr><td>Serolojik pipet dolgusu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T175 şişesi, doku kültürü ile tedavi edilmiş</td><td></td><td></td><td>"Fabrikalar" olarak bilinen iPSC-makrofaj öncülerinin farklılaşması için kapT75</td></tr> <tr><td>şişesi</td><td></td><td></td><td>SH-SY5Y kültürü için kap</td></tr><tr><td>Şeffaf plaka kapatıcılar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>Tahlil plakasının saklanması ve taşınması için</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Rekombinant tripsin benzeri enzimler ve 1.1 mM EDTA içeren hücre ayrışma tamponu yok, temiz kullanın.</td></tr><tr><td>Su banyosu, 37 ° C'ye ayarlanmış; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 L-glutamin, gentamisin ve fenol kırmızısı içeren</td> orta <td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>Fabrika ve Makrofaj ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 L-glutamin içeren ortam; gentamisin veya fenol kırmızısı içermez</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>Fenol kırmızısı içermeyen makrofaj ortamı, fagositozda kullanım için katkı maddeleri veya büyüme faktörleri olmadan</td></tr></tbody></table>

İpsc-makrofajlar tarafından Ölü nöroblastom hücrelerinin fagositozu için İn vitro nicel görüntüleme tahlili

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia, Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda nöroimmün yanıtları düzenler. Microglia, fagositozun özel bir formu olan efferositoz süreciyle ölü ve ölmekte olan nöronları temizler. Fagositoz fonksiyonu mikrogliayı etkileyen çevresel veya genetik risk faktörleri ile bozulabilir. Bu makale, fagositik kargo için pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş bir insan nöroblastom hücre hattı (SH-SY5Y) kullanarak, mikroglianın indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) modelinde mikroglial efferositozu incelemek için hızlı ve basit bir in vitro mikroskopi protokolü sunmaktadır. Prosedür, fagositler tarafından "beni ye" sinyali olarak kabul edilen yüzey fosfatidiylserine gösteren ölü nöroblastom hücrelerinin yüksek verimine neden olur. 96 kuyulu plaka tahlili canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme için uygundur veya plaka daha fazla işlemden önce başarıyla sabitlenebilir ve yüksek içerikli mikroskopi ile ölçülebilir. Sabit hücreli yüksek içerikli mikroskopi, tahlillerin küçük molekül inhibitörlerinin taranması veya genetik varyant iPSC hatlarının fagositik işlevinin değerlendirilmesi için ölçeklendirilmesini sağlar. Bu test, tüm ölü nöroblastom hücrelerinin fagositozunu iPSC-makrofajlar tarafından incelemek için geliştirilmiş olsa da, test sinaptozomlar ve miyelin gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilgili diğer kargolar ve diğer fagositik hücre tipleri için kolayca uyarlanabilir.

Canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, daha önce özetlenen protokol kullanılarak gerçekleştirildi ve vahşi tip iPSC makrofajları kuyu başına 20.000 hücrede tohumlandı. Farklı miktarlarda SH-SY5Y uygulandı (adım 3.1'deki hücre sayımından tahmin edildiği gibi 10.000-30.000) ve fagositoz inhibitörü sitochalasin D, her sh-SY5Y miktarı için fagositozu inhibe etmek için bir kontrol görevi görenerek bazı kuyularla önceden inkübe edildi (1 saat). Görüntüleme, SH-SY5Y'lerin eklenmesinden 40 dakika sonra başladı ve görüntüler sonraki 3 saat boyunca 5 dakika aralıklarla çekildi (veriler ilk 40 dakikalık gecikmeyi içerir). Ek Veriler'de temsili bir zaman atlamalı video bulunur ve Şekil 3'tegösterilen nicel veriler analiz edilir. Kuyu başına 10.000 SH-SY5Y miktarı ile, hücre başına fagositozlu parçacıkların (lekeler) sayısı zamanla doğrusal olarak artmıştır ve sitochalasin D tarafından yaklaşık% 50 oranında inhibe edildi. Sitochalasin D'nin inhibisyonu beklenenden daha zayıftı, büyük olasılıkla yetersiz teknik veya biyolojik çoğalmalardan kaynaklandı, çünkü durum başına sadece bir kuyu üç görüntü alanıyla görüntülendi. Kuyu başına daha yüksek miktarda SH-SY5Y (20.000 ve 30.000) ile fagositoz, muhtemelen daha kalabalık bir görüş alanında iPSC-makrofajların ve SH-SY5Y'lerin zayıf segmentasyonu nedeniyle zayıf doğrusallık gösterdi.
Sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme, daha önce özetlenen protokol kullanılarak, kuyu başına 20.000 hücrede vahşi tip iPSC makrofajları, birkaç farklı miktarda SH-SY5Y (kuyu başına 10.000-80.000) ile gerçekleştirildi ve test plakası 5 saat sonra sabitlendi ve görüntülendi. Şekil 4A'da ve Şekil 4B17'degösterilen analiz edilmiş verilerde fagositozun temsili bir görüntüsü sunulmuştur. SH-SY5Y miktarının artırılması, hücre başına daha fazla sayıda fagositozlu parçacık (leke) ile sonuçlandı; bununla birlikte, SH-SY5Y miktarının iki katına çıkması, hücre başına nokta sayısında sadece 1,5 kat artışa yol açar. Bu, test edilen miktarların fagositoz ile oran sınırlayıcı olmadığını gösterir. Daha sonra yüksek içerikli görüntüleme fagositozu tahlilleri, fagositozun çeşitli inhibitörleri kullanılarak doğrulanmıştır (Şekil 4C)17. Aktin polimerizasyon inhibitörleri sitochalasin D ve jasplakinolid, fagositozdan önce 1 saat ön kuluçkaya yattıklarında sırasıyla% 91 ve% 90 oranında fagositozu önemli ölçüde inhibe etti. Sitochalasin D veya jasplakinolid negatif kontroller olarak kullanıldığında tahlillerin sağlam Z'si sırasıyla 0.7 ve 0.8 olarak hesaplanır,20. Lizozom asitleşme inhibitörü bafilomycin A1, fagositozdan önce 1 saat kuluçkalandığında fagositozu önemli ölçüde% 31 azalttı. Lizozom asitleşme inhibitörünün akin inhibitörlerine karşı daha zayıf etkisi, içselleştirilmiş kargonun tespit edilmesinin fagozomun tam asitlenmesini gerektirmeyebileceğini göstermektedir. Rekombinant ek v, SH-SY5Y'lerin yüzeyinde maruz kalan fosfatidiylserine'i özellikle bloke etmek için bir kontrol olarak kullanıldı ve fagositik reseptörlerin önemli bir "beni ye" sinyali olan ligand'a erişmesini engelledi. Rekombinant ekine V ilavesi, SH-SY5Y ilavesinden hemen önce kuyulara eklendiğinde fagositozu% 30 oranında önemli ölçüde azalttı. Sabit SH-SY5Y'lerin floresan ek v probu kullanılarak fosfatidiylserine maruz kaldığı doğrulanmıştır, oysa canlı SH-SY5Y'ler ek V boyama için negatifti(Şekil 4D).
Mikroglial fagositoz reseptörü TREM2'nin daha önce apoptotik nöronların fagositozu için önemli olduğu gösterilmiştir21. TREM2'nin R47H mutasyonu Alzheimer hastalığının geç başlaması için bir risk genidir ve TREM223'ünligand bağlanmasını azaltmak için hipotez edilir. R47H TREM2 ve TREM2 KO'nun fagositik fonksiyonlarının değerlendirilmesi amacıyla WT/R47H/KO TREM217ile izojenik iPSC-makrofaj hatları kullanılarak sabit hücreli yüksek içerikli fagositoz tahlil işlemi gerçekleştirilmesi gerçekleştirilmesi amaçla gerçeklenmiştir. Fagositik yükün (40.000 SH-SY5Y) kademeli bir ilavesi kullanılarak 1 ila 5 saat arasında çeşitli fagositoz süresi test edildi. Elde eden sinyal doğrusal olarak 4 h'ye çıkar ve 5 h'de hafifçe seviye atlar (Şekil 5)17. Trem2 KO'da WT'ye kıyasla düşük fagositoz oranı ve kapasitesi (% nokta pozitif hücreler) belirginken, R47H TREM2 mutantında değiştirilmiş fagositoz yoktu. TREM2 KO hücrelerindeki fagositik defekt, R47H TREM2 mutasyonu tarafından fenoskopi değildir, çünkü TREM2 işlevi normal fagositozu desteklemek için yeterlidir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Şekil 3: Canlı hücreli zaman atlamalı fagositoz tahlil için örnek veriler. Ölü SH-SY5Y'lerin vahşi tip iPSC-makrofajlar bioni010-C (ECACC ID: 66540023) tarafından alınması 3 saat boyunca 5 dakika aralıklarla görüntülenmiştir. Grafikte görüntülenen süreler, ölçümsüz ilk 40 dakika da dahil olmak üzere fagositozun başlatılmasındandır. Üç çoğaltma kuyusundan hücre başına ortalama nokta sayısı çizilir. 10.000 SH-SY5Y'nin fagositozu 1 saat ön tedavi ile 10 μM sitochalasin D ile inhibe edilirken, daha yüksek miktarda SH-SY5Y (20.000 ve 30.000) fagositozun yetersiz nicel nicemine sahiptir. Ortalama ± standart sapma (SD), N = 1 deneme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Şekil 4: Sabit hücreli yüksek içerikli fagositoz tahlilinin optimizasyonu ve doğrulanması. (A) Vahşi tip iPSC-makrofajlar BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) tarafından fagositozlanmış SH-SY5Ys'nin temsili yüksek içerikli mikroskopi görüntüsü. 40.000 SH-SY5Ys ile 3 saat zaman noktası gösterilir. Floresan kanalları birleştirilir, iPSC-makrofaj lekesi kırmızı, çekirdek mavi ve SH-SY5Ys sarı olarak gösterilir. İç panel, görüntünün 3x büyütülmüş bir bölümüdür. (B) Vahşi tip iPSC makrofajlarına farklı miktarlarda kargo ilavesi kullanılarak, 5 saat sonra fagositozlu ölü SH-SY5Y'lerin hücre başına nokta sayısı. Ortalama ± standart hata (SEM), N = 3 hasat için. (C) Fagositoz (3 h) 10 μM sitochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolid (1 saat ön tedavi ile); Jas) ve 13 μg/mL rekombinant annexin V (ölü SH-SY5Y'lere aynı anda eklenir; Ann). SH-SY5Ys eklenmemiş iPSC makrofajları negatif kontrol (-ve) olarak kullanıldı ve pozitif (+ve) kontrol SH-SY5Ys eklenmiş iPSC-makrofajlar tedavi edilmemiştir. Veriler, deneme tekrarı ortalamasına göre normalleştirildi. SEM ± anlamına gelir, N = 3-6 hasatlar için ve iki vahşi tip hücre hattıyla (SFC840-03-03, Bu satırın karakterizasyonu (Fernandes ve ark.21 ve BIONi010-C). Dunnett'in post-hoc testi ile 1 yönlü ANOVA, işlenmemiş hücrelerle karşılaştırmalar. *p &lt; 0.05, ***p &lt; 0.001. (D) Taze sabitlenmiş SH-SY5Ys leke fosfatidiylserine ekran (eksel V-FITC) için eşit olarak leke ve sınırlı hücre geçirgenliği (propidium iyodür) vardır. Canlı SH-SY5Y'ler, kültürdeki birkaç ölü hücrede bulunan odak lekesi dışında ek V-FITC veya propidium iyodür için lekelenmez. Rakamlar Alzheimer Araştırma ve Tedavi17'denizin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Şekil 5: Fagositoz TREM2 KO'da azalır, ancak R47H TREM2 iPSC makrofajlarında azalmaz. Yüksek içerikli fagositoz tahlilleri, şaşırtıcı eklemelerle kuyu başına 40.000 SH-SY5Ys ile gerçekleştirildi. Parametreler için araçlar ölçülmektedir: hücre başına nokta sayısı, hücre başına nokta alanlarının toplamı(μm 2)ve alan başına fagositozlu parçacıklar içeren hücrelerin yüzdesi. Veriler, deney başına her genotip için anlam ifade etmek üzere normalleştirildi. Ortalama ± SEM, N = 3 hasat için. Dunnett'in geçici sonrası testi olan 2 yönlü ANOVA'yı her seferinde WT ile çift yönlü olarak ölçer: *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001. Rakamlar Alzheimer Araştırma ve Tedavi17'denizin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: SH-SY5Ys hazırlama için örnek QC. Ayrışmış SH-SY5Y'ler % 0 (canlı hücreler), % 1 ve paraformaldehitin (PFA) % 2'si ile 10 dakika sabitlendi, daha sonra yıkandı. Hücreler ekselin V-FITC ve propidium iyodür (PI) ile boyandı ve hemen akış sitometrisi ile ölçüldü. Renk yoğunluğu nokta çizimleri, akış sitometri analiz yazılımında, bir çeyrek kapısı yerleştirmek için tek lekeli ve lekesiz kontroller kullanılarak oluşturulmuştur. Kadranlar, bu çeyrekteki olayların yüzdesiyle açıklamalı. Canlı hücreler esas olarak Q4'tedir ve sabit hücreler çoğunlukla Q2'dedir. Q1 = ek V-/PI-, Q2 = ek V+/PI+, Q3 = ek V+/PI-, Q4 = ek V-/PI- (canlı hücreler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Video: Canlı hücreli zaman atlamalı fagositoz. Vahşi tip iPSC makrofajları BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) tarafından fagositozlanmış SH-SY5Ys'nin temsili zaman atlamalı videosu. Görüntüler her 5 dakikada bir 3 saat boyunca çekildi. Video kırpılır ve saniyede 3 karede çalışır ve tahlilin son 1,5 saatini gösterir. Aside duyarlı boya lekeli SH-SY5Y'ler kırmızı renkte gösterilir, fagozom asitleşme ile sinyal yoğunluğu artar. Hoechst 33342 ile boyanmış hücre çekirdekleri mavi renkte gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Bu in vitro görüntüleme tahlili, farklı hücre tedavilerinin veya farklı genotiplerin mikroglial fagositoz üzerindeki etkisini ölçmeyi mümkün kılar. Nörodejeneratif hastalıkla ilgili iki hücre tipi kullanarak, büyük yüksek içerikli görüntüleme ekranları tarafından kolayca ve ucuza ölçeklendirilebilecek şekilde hazırlanan fagositik kargo için ölü nöroblastom hücreleri kullanıyoruz. Sınıf 2 biyolojik güvenlik kabininde, ortamı aspire ederek SH-SY5Y'leri ayrıştırın.4 ml hücre ayrıştırma tamponu ekleyin ve tamponu hemen çıkarın, böylece hücreleri kaplayan ince bir film olarak 1 ml'den az kalır. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 2 ila 3 dakika kuluçkaya yatır. Sonra 10 ml HBSS'de T-75 şişesine.Ve SH-SY5Y'leri 15 ml konik santrifüj tüpüne pipetle. 5 dakika boyunca 400xG'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 2 ml fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortamda yeniden askıya alın, sabitlemeden önce kümeleri parçaladığından emin olun.Tüpe 2 ml% 4 güç formaldehit ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ara sıra hafif ajitasyonla inkübe ederek hücreleri sabitleyin. Tüpe 10 ml HBSS ekleyin. Ardından, 7 dakika boyunca 1200xG'de santrifüj.Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 ml fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortamda yeniden askıya alın. 1 milyon HS-SY5Y hücreini 2 ml düşük protein bağlayıcı bir tüpe sayın ve çıkarın. Fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortam ile toplam hacmi 300 ila 500 mikrolitreye getirin.Daha sonra tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda kısa bir süre ısıtın. pH'a duyarlı kırmızı floresan boya STP esterini üreticinin talimatlarına göre yeniden inşa edin. Daha sonra milyon SH-SY5Y hücresi başına 12,5 mikrogram boya ekleyin.Tüpü sallayarak hafifçe karıştırın. Ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküb tüpe bırakın, ışıktan kornun. 7 dakika ve 4 santigrat derece için 1200xG'de 1 ml HBSS ve santrifüj ekleyin.Üstnatant atın. Ve 2 ml HBSS ile yıkayın. Fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamlarındaki hücre peletini ml başına 0,2 ila 1,2 milyon hücre konsantrasyonuna yeniden askıya alın, böylece 50 mikrolitre 10.000 ila 60.000 hücre içerir.Biyolojik bir güvenlik kabininde, makrofaj ortamlarında derin kırmızı floresan hücre permeant süksinimsal ester-reaktif boya çözeltisi hazırlayın. Hoechst 33342'yi ekleyin ve çalışma sokucuyu bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Hücre üstnatantını çok kanallı bir pipetle steril bir rezervuara pipetle keserek iPSC makrofaj ortamını nazikçe epire edin.Çok kanallı pipet kullanarak iPSC makrofajlarına boya çözeltisinin kuyusu başına 70 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derecede 1 saat kuluçkaya yatır ve %5 karbondioksit. Fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamlarında deneysel tedavileri onarın.Kuluçkadan sonra, iPSC makrofaj ortamını çok kanallı bir pipetle çok nazikçe epire edin ve kuyu başına 100 mikrolitre HBSS ekleyin. HBSS'yi hemen hafif pipetleme ile çıkarın. Daha sonra 100 mikrolitre fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamı ve ayrı kuyularda deneysel tedaviler ekleyin.37 santigrat derecede 10 dakika ila 1 saat kuluçkaya yatır ve% 5 karbondioksit. Sıvının kenarındaki her kuyunun yanlarından kuyu başına 50 mikrolitre SH-SY5Y eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 3 ila 5 saat boyunca% 5 karbondioksit.Fagositoz inkübasyonundan sonra, çok kanallı bir pipetle pipetle pipetleme yaparak hücre süpernatantlarını hafifçe aspire edin ve atın. 100 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra% 2 güç formaldehit 100 mikrolitre ekleyerek ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitleyin.Kuyuları aspire edin ve 100 mikrolitre PBS ekleyin. Yüksek içerikli mikroskopla doğrudan görüntülemeye devam edin veya plaka sızdırmazlık ve folyo ile örtün ve plakayı gerekli olana kadar 4 santigrat derecede saklayın. Yüksek içerikli görüntüleme mikroskobu açın ve görüntü yakalama yazılımını açın.Ekranın üst kısmındaki LOAD"i tıklayarak test plakasını mikroskopa yükleyin. KUR"sekmesini seçin. Sol üstteki açılır menülerde uygun plaka türünü seçin.Otomatik odaklama seçeneği:iki tepe"Amaç:40x Su, NA 1.1"Konfokal"modu ve Binning 1. Ayarlar menüsünden kullanmadan önce 40x Su hedefini yıkayın. Kanal seçim kutusunda, DAPI, Alexa 647 ve Alexa 568 kanallarını eklemek için artı simgesini kullanın.Bunları bir mikrometrenin tek bir düzlemini ölçecek şekilde ayarlayın. Test plakasının boyama verimliliği için zaman ve güç ayarlarını optimize edin. Kanalları ayırmak için kanal sırasına tıklayarak kanalların aynı anda ölçülmediğine emin olun.Gezinti altında ve düzeni tanımlayın, ölçüm kuyularını seçin ve kuyu başına 9 ila 12 alan seçin. Kurulum sırasında, plaka haritasında temsili bir alana tıklayın. Ve boyamanın mevcut olduğundan ve kanal uzaklığını ayarlayarak görüntülerin odaklandığından emin olmak için her ölçüm kanalını sırayla kontrol edin.Verileri uzaktan analiz için bir sunucuya yüklemek için çevrimiçi işler"kutusunu ve ilgili ekran adını tıklatın. Kaydet" düğmesine tıklayarak test protokolünü kaydedin ve üstteki Denemeyi çalıştır sekmesine tıklayın. Deney plakasını adlandırın, sonra başla'ya tıklayın "Canlı bir hücre zamanı fagositoz yaşar tahlil, 10 ile gösterdi, Kuyu başına 000 SH-SY5Ys, hücre başına fagositoz parçacıklarının sayısı zamanla doğrusal olarak arttı ve Cytochalasin D. tarafından yaklaşık% 50 oranında inhibe edildi Kuyu başına daha yüksek miktarda SH-SY5Ys ile, fagositoz muhtemelen iPSC'nin zayıf segmentasyonu nedeniyle zayıf doğrusallık gösterdi, makrofajlar ve daha kalabalık bir görüş alanında SH-SY5Y'ler.Aşağıdaki sonuçlar, fagositozun bu temsili görüntüsü de dahil olmak üzere sabit hücreli yüksek içerikli bir görüntüleme yapılarak elde edilmiştir. SH-SY5Y miktarının arttırılması, hücre başına daha fazla sayıda fagositozlu parçacıkla sonuçlandı. Fagositoz tahlilleri, fagositozun çeşitli inhibitörleri kullanılarak doğrulandı.Sitochalasin D ve Jasplakinolide sırasıyla yüzde 91 ve 90 oranında fagositozu önemli ölçüde inhibe etti. Ve Bafilomycin A1, fagositozdan önce 1 saat önceden inkübe edildiğinde fagositozu% 31 oranında önemli ölçüde azalttı. Rekombinant Annexin 5'in eklenmesi, SH-SY5Y ilavesinden hemen önce kuyulara eklendiğinde fagositozu önemli ölçüde azalttı.Sh-SY5Y'ler düzeltildi Floresan Annexin 5 probu kullanarak Fosfatidiylserine maruz bıraktığımız doğrulandı. Canlı SH-SY5Y'ler Ekin 5 boyama için negatifti. 1 ila 5 saat arasında çeşitli fagositoz süresi, fagositik kargonun kademeli ilavesi kullanılarak test edildi.Bu protocall'un genel uzunluğu, fagositik kargonun hazırlanması ve iPSC makrofajlarının paralel olarak boyanmasına bağlı olarak kısaltılabilir. Bunu yapmak istiyorsanız, zamanlamaları önceden çalışın ve gelecekteki adımlara çözümler hazırlamak için kuluçkalarınızı kullanın.

in-vitro-quantitative-imaging-assay-for-phagocytosis-dead

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, indüklenmiş pluripotent kök hücreler kullanarak nöroblastom için mikroglial fagositoz testini gerçekleştiriyoruz. Test, nörodejeneratif hastalıklarda mikroglial fonksiyonun bozulmasını değerlendirmeye yardımcı olur.

Mikroglial Fagositoz Testi: iPSC Makrofajları Kullanılarak Nöroblastom Hücreleri için Mikroglial Fagositoz Modeli Oluşturmak İçin İn Vitro Test

Bu videoda, saflaştırılmış astrositlerin fagositik kapasitesini canlı görüntüleme testi ile in vitro olarak değerlendiriyoruz. Test, astrositlerin fagositik kapasitesini artırabilen veya inhibe edebilen kimyasal bileşikleri tanımlamak için etkili bir tarama platformu görevi görür.

İn Vitro Fagositoz Testi: Gerçek Zamanlı Astrosit Aracılı Sinaptozom Fagositozunu İncelemek İçin Canlı Görüntüleme Tabanlı Bir Yöntem

Kaynak: Funes, S., et. al., İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve İn Vitro Canlı Hücre Fagositoz Testinden Farklılaşma. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, pH'a duyarlı floresan boya etiketli sinaptozomlar kullanarak mikroglia benzeri hücrelerin fagositik kapasitesini incelemek için bir testi göstermektedir.

İnsan Sinaptozomları Kullanılarak Mikroglia Benzeri Hücrelerin Canlı Hücre Fagositoz Testi

Mikroglia hücre dışı bir ortamda malzemenin fagosite veya yutmak için yüksek bir kapasitesi olan merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Burada, sinaptik bileşenlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirme ve ölçmek için, genel olarak, uygun ve güvenilir olup, kantitatif analiz tarif edilmektedir.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Bu iletişim kuralı bir vitro canlı görüntüleme fagositoz tahlil astrocytes fagositik kapasitesini ölçmek için sunar. Arıtılmış sıçan astrocytes ve microglia pH göstergesi Birleşik synaptosomes ile birlikte kullanılır. Bu yöntem gerçek zamanlı engulfment ve yıkımı Kinetik algılayabilir ve astrocyte fagositoz oransal faktörleri tanımlamak için uygun tarama platformu sağlar.

Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes

Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajların sağlam nesil açıklar, ve sonraki karakterizasyonu için yöntemler. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu, gen ekspresyonu ve fonksiyonel tahliller bu iPSC kaynaklı makrofajların fenotip ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Öğrenin, iPSC-kökenli makrofajlar ve pH-duyarlı boyalı ölü SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri kullanarak mikroglial fagositozu nicel olarak değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir in vitro görüntüleme yöntemi.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Daha fazla video keşfet