Name: Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin 18F Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin, NIS ekspresyonlu kimerik antijen reseptör T hücrelerinin [18F]tetrafloroborat PET/CT ile dinamik görüntülenmesini. Bu yöntem, immünoterapi araştırmalarında hücre dağılımını invaziv olmayan şekilde izler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Mayo Clinic K2R boru hattı (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK) ve Predolin Vakfı (RS) aracılığıyla desteklenmiştir. Şekil 1, 2 ve 4 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

SSK, Novartis'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasındaki bir anlaşma yoluyla) ve Mettaforge'a (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslı CAR immünoterapisindeki patentlerin mucididir. RS, MJC ve SSK, CAR immünoterapisi alanında Humanigen'e lisanslı patentlerin mucitleridir. SSK, Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs ve Lentigen'den araştırma fonu almaktadır. Figürler BioRender.com ile oluşturuldu.

Bu yazıda NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve [18F]TFB-PET aracılığıyla infüze edilmiş CAR T hücrelerinin in vivo görüntülenmesi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Kavramın kanıtı olarak, NIS + BCMA-CAR T hücreleri çift iletim yoluyla üretildi. Son zamanlarda, NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesinin CAR T hücresi fonksiyonlarını ve etkinliğini in vivo olarak bozmadığını ve CAR T hücresi kaçakçılığına ve genişlemesine izin verdiğini bildirmiştik30...

Kimerik antijen reseptörü T (CAR T) hücre tedavisi, hematolojik malignitelerde hızla ortaya çıkan ve potansiyel olarak küratif bir yaklaşımdır1,2,3,4,5,6. CD19 yönelimli CAR T (CART19) veya B hücre olgunlaşma antijeni (BCMA) CAR T hücre tedavisinden sonra olağanüstü klinik sonuçlar bildirilmiştir2. Bu, agresif B hücreli lenfoma (aksikabagen ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 ve lisocabtagene maraleucel)7, akut lenfoblastik lösemi (Tisa-Cel)5,8, mantle hücreli lenfoma (brexucabtagene autoleuce)9 ve foliküler lenfoma (Axi-Cel)10 için ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) CART19 hücrelerinin onaylanmasına yol açmıştır. . Son zamanlarda, FDA, multipl miyelom (MM) (idecabtagene vicleucel)11 hastalarında BCMA yönelimli CAR T hücre tedavisini onayladı. Ayrıca, kronik lenfositik lösemi (KLL) için CAR T hücre tedavisi geç evre klinik gelişim aşamasındadır ve önümüzdeki üç yıl içinde FDA onayı alması beklenmektedir1.
CAR T hücre tedavisinin benzeri görülmemiş sonuçlarına rağmen, yaygın kullanımı 1) yetersiz in vivo CAR T hücre genişlemesi veya tümör bölgelerine zayıf kaçakçılık, daha düşük kalıcı yanıt oranlarına yol açar12,13 ve 2) sitokin salınım sendromu (CRS) dahil olmak üzere hayatı tehdit eden advers olayların gelişmesi14,15 ile sınırlıdır. . CRS'nin ayırt edici özellikleri arasında sadece inflamatuar sitokin/kemokinlerin yüksek düzeyleriyle sonuçlanan immün aktivasyon değil, aynı zamanda CAR T hücre infüzyonundan sonra masif T hücre proliferasyonu da bulunmaktadır15,16. Bu nedenle, CAR T hücrelerini in vivo olarak görüntülemek için doğrulanmış, klinik sınıf bir stratejinin geliştirilmesi, 1) CAR T hücresinin tümör bölgelerine kaçakçılığını izlemek ve potansiyel direnç mekanizmalarını ortaya çıkarmak için in vivo olarak gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve 2) CAR T hücresi genişlemesinin izlenmesine ve CRS'nin gelişimi gibi toksisitelerini potansiyel olarak tahmin etmesine izin verecektir.
Hafif KRS'nin klinik özellikleri yüksek ateş, yorgunluk, baş ağrısı, döküntü, ishalji, artralji, miyalji ve halsizliktir. Daha şiddetli KRS'de hastalarda taşikardi/hipotansiyon, kılcal damar kaçağı, kardiyak disfonksiyon, böbrek/karaciğer yetmezliği ve yaygın intravasküler pıhtılaşma gelişebilir17,18. Genel olarak, interferon-gama, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, interlökin (IL)-10 ve IL-6 dahil olmak üzere sitokinlerin yükselme derecesinin klinik semptomların şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir17,19. Bununla birlikte, CRS'yi tahmin etmek için "gerçek zamanlı" serum sitokin izlemenin kapsamlı bir şekilde uygulanması, yüksek maliyet ve sınırlı kullanılabilirlik nedeniyle zordur. CAR T hücre tedavisinin yararlı özelliklerinden yararlanmak için, evlat edinen T hücrelerinin non-invaziv görüntülemesi, CAR T hücre infüzyonundan sonra etkinliği, toksisiteleri ve nüksetmeyi tahmin etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.
Birçok araştırmacı, pozitron emisyon tomografisi (PET) veya tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ile radyonüklid tabanlı görüntülemeyi kullanmak için stratejiler geliştirmiştir, bu da yüksek çözünürlük ve yüksek hassasiyet sağlar20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T hücre kaçakçılığının in vivo görselleştirilmesi ve izlenmesi. Bu radyonüklid tabanlı görüntüleme stratejileri arasında, sodyum iyodür simporter (NIS), PET taramaları kullanılarak görüntü hücrelerine ve virüslere duyarlı bir yöntem olarak geliştirilmiştir31,32. [18F]TFB-PET ile NIS+CAR T hücre görüntüleme, CAR T hücresi genişlemesini, kaçakçılığını ve toksisitesini değerlendirmek ve teşhis etmek için hassas, verimli ve kullanışlı bir teknolojidir30. Bu protokol 1) yüksek etkinlikli çift transdüksiyon yoluyla NIS + CAR T hücrelerinin gelişimini ve 2) NIS + CAR T hücrelerini [18F] TFB-PET taraması ile görüntülemek için bir metodolojiyi açıklar. MM için BCMA-CAR T hücreleri, NIS'i CAR T hücresi görüntüleme için bir muhabir olarak tanımlamak için bir kavram kanıtı modeli olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu metodolojiler başka herhangi bir CAR T hücre tedavisine uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>22 gauge iğne</td><td>Covidien</td><td>8881250206</td><td></td></tr><tr><td>28 gauge insülin şırıngası</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan (ETNL) NIS</td><td>Imanis</td><td>REA009</td><td>ETNL antikoru, NIS'in sitozolik C-terminalini bağlar</td></tr><tr><td>Anti-insan BCMA, klon 19F2, PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>357507</td><td>Flow antikoru</td></tr><tr><td>Anti-insan CD45, klon HI30, BV421</td><td>BioLegend</td><td>304032</td><td>Akış antikoru</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45, klon 30-F11, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Akış antikoru</td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG R</td><td>& D</td><td>F0110</td><td>NIS boyama için ikincil antikor</td></tr><tr><td>BCMA-CAR yapısı, ikinci nesil</td><td>IDT, Coralville, IA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Cytofix/Cytoperm Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm Kiti</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Monoklonal Antikor (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Sistemi&nbsp; B5-R3-V5</td><td>Beckman Coulter</td><td>C04652</td><td>akış sitometresi</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Uçlu Tek Kullanımlık Şırıngalar</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potasyum Tuzu</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Manyetik Parçacık Konsantratörü)</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Mıknatıs</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan T Hücre İzolasyon Kiti</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>17951</td><td>negatif seçim manyetik boncuklar; 17951RF ipuçları içerir ve tampon</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>Inveon Çoklu Modalite PET/CT tarayıcı</td><td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td><td>10506989 VFT 000 03</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran sıvı</td><td>Piramal Yoğun Bakım</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina S5 Görüntüleme Sistemi</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; Spectrum In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>PerkinElmer</td><td>&nbsp; </td><td></td>124262</tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma için</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lenforep</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Hızlı Akış 500 mL Vakum Filtresi, 0.22 uM, steril</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Hızlı Akışlı 500 mL Vakum Filtresi, 0,45 uM, steril</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid&nbsp; Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson laboratuvarı</td><td>05557</td><td></td></tr><tr><td>OPM-2</td><td>DSMZ</td><td>CRL-3273</td><td>multipl miyelom hücre hattı</td></tr><tr><td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td><td>Addgene</td><td>80389</td><td>lentiviral vektör kodlama lusiferaz-GFP</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100x), Sıvı</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PMOD yazılımı</td><td>PMOD</td><td>PBAS ve P3D</td><td></td></tr><tr><td>Havuzlanmış İnsan AB Serum Plazmasından Türetilmiş Yenilikçi</td><td>Araştırma</td><td>IPLA-SERAB-H-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin Dihidroklorür</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Tam Otomatik Hücre Ayırıcı</td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>yoğunluk gradyan ayırma tüpleri</td></tr><tr><td>Sodyum Azide,% 5 (a / h)</td> <td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>T175 şişesi</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Terrell (izofluran, USP)</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-019-10</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alkol Hazırlama</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

kimerik antijen reseptör t hücrelerinin [18f]tetrafloroborat pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi ile dinamik görüntülenmesi

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR) eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücreleri, B hücreli maligniteleri veya multipl miyelom (MM) olan hastalar için önemli klinik çalışmalarda benzeri görülmemiş sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, çok sayıda engel etkinliği sınırlamakta ve CAR T hücre tedavilerinin yaygın kullanımını, tümör bölgelerine kötü kaçakçılık ve infiltrasyonun yanı sıra in vivo kalıcılık eksikliği nedeniyle yasaklamaktadır. Ayrıca, sitokin salınım sendromu veya nörotoksisite gibi hayatı tehdit eden toksisiteler önemli endişelerdir. CAR T hücrelerinin verimli ve hassas görüntülenmesi ve izlenmesi, T hücresi kaçakçılığının, genişlemesinin ve in vivo karakterizasyonunun değerlendirilmesini sağlar ve CAR T hücre tedavisinin mevcut sınırlamalarının üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu yazıda sodyum iyodür sempatizanının (NIS) CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve preklinik modellerde [18F]tetrafloroborat-pozitron emisyon tomografisi ([18F]TFB-PET) kullanılarak CAR T hücre görüntülemesi için metodoloji anlatılmaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bu çalışmada kullanılanlara ek olarak diğer CAR yapılarına ve hedef genlere uygulanabilir.

Şekil 1 , NIS + BCMA - CAR T hücreleri oluşturma adımlarını göstermektedir. 0. günde, PBMC'leri izole edin ve ardından negatif seleksiyonla T hücrelerini izole edin. Daha sonra, T hücrelerini anti-CD3 / CD28 boncuklarla uyarın. 1. günde, T hücrelerini hem NIS hem de BCMA-CAR lentivirüsleri ile dönüştürün. 3, 4 ve 5. günlerde, T hücrelerini sayın ve konsantrasyonu 1.0 × 106 / mL olarak ayarlamak için medya ile besleyin. NIS ile dönüştürülmüş T hücreleri için, NIS +<...

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Bugüne kadar klinik olarak doğrulanmış kimerik antijen reseptörü T-hücresi görüntüleme platformu bulunmamaktadır. Sodyum-iyodür simportörü, PET taraması ile Car T-hücrelerini görüntülemek için hassas ve klinik olarak ilgili bir muhabiri temsil eder. NIS CAR T-hücresinin TLP PET görüntülemesi, araştırmacıların infüze edilmiş hücreleri in vivo olarak invaziv olmayan bir şekilde izlemelerini sağlar ve CAR T-hücresi tedavisinin etkinliğini ve toksisitesini tahmin etme potansiyeline sahiptir.CAR T hücrelerinin verimli görüntülenmesi, T hücresi kaçakçılığının ve genişlemesinin değerlendirilmesini sağlar ve sınırlamaların üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu protokolde açıklanan yöntem basittir ve bu çalışmada gösterilenlerin ötesinde diğer CAR yapılarına uygulanabilir. Standart yoğunluk gradyan tekniğini kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerinin veya PBMC'lerin kan örneğinden izole edilmesiyle başlayın.Bunu yapmak için, kabarcık oluşumunu önleyen 50 mililitrelik yoğunluk gradyanı ayırma tüpüne nazikçe 15 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin. Hücre sıkışmasını önlemek için, kan örneğini bire bir hacim oranında% 2FBS içeren PBS ile seyreltin ve seyreltilmiş kanı ikisi arasındaki arayüzü kırmadan yoğunluk gradyanı ortamının üzerine yavaşça aktarın. Daha sonra ayırma tüpünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.200 kez G'de santrifüj yapın.Süpernatantı taze bir 50 mililitrelik konik tüpe toplayın, tüpü 50 mililitreye kadar doldurarak hücreleri% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın ve tüpü oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Pelet hücrelerini% 2 FBS içeren 50 mililitre PBS'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin. % 2 FBS içeren PBS'deki peletlenmiş PBMC'leri, mililitre başına 50 kat 10 ila altıncı hücre konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın.Yıkamayı taze 50 mililitrelik bir tüpte tekrarlayın. Hücre sayısını sayın ve ardından hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. T-hücresi izolasyonu için, izole PBMC'leri 14 mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın.Ardından, PBMC'leri tam otomatik bir hücre ayırıcıda negatif seleksiyon antikor kokteyline yerleştirerek T hücresi izolasyonunu gerçekleştirmek için negatif seleksiyonlu manyetik boncuk kiti kullanın. T-hücresi izolasyonundan sonra, hücreleri sayın ve T hücresi genişleme ortamındaki hücreleri veya TCM'deki hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere iki kez 10 ila iki kat konsantrasyonda kültürleyin. Daha sonra, anti-CD3 / CD28 boncuklarını içeren şişeyi, gerekli boncuk hacmini döndürerek ve pipetleyerek steril bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne karıştırın.Yıkama için, tüpü bir dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirmeden önce boncukları bir mililitre TCM'de askıya alın ve süpernatanı aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkardıktan sonra, yıkanmış boncukları bir mililitre TCM içinde tekrar edin ve yıkamayı iki kez tekrarlayın. Yıkanmış boncukları T hücreleri kültürüne aktarmak için bir mililitre TCM'de yeniden askıya alın, daha sonra T hücresi boncuk süspansiyonunu TCM ile mililitre başına altıncı hücrelere 1.0 kat 10 ila 10 konsantrasyonda seyreltin ve altı kuyucuklu bir plakaya geçirilmiş bir doku kültürüne aktarın.Kuyu plakasını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Lentivirüslerin transdüksiyonu ile ilerlemek için, donmuş lentivirüsleri kimerik antijen reseptörlerini veya sodyum-iyodür simporterini dört santigrat derecede kaplamada çözün. 24 ila 48 saatlik T hücresi stimülasyonundan sonra, kümeleri parçalamak için T hücrelerini karıştırın ve taze çözülmüş lentivirüsü hücrelere beş enfeksiyon çokluğunda ekleyin.Dönüştürülmüş T hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkanın üç, dört ve beşinci günlerinde, dönüştürülmüş T hücrelerini sayın ve taze önceden ısıtılmış TCM ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitre başına 10 kat 10 ila altıncı hücrelere ayarlayın. Püromisin direnç genini taşıyan NIS dönüştürülmüş T hücreleri için, hücrelere üç, dört ve beşinci günlerde mililitre puromisin dihidroklorür başına bir mikrogram ile muamele edin.Altıncı günde, T hücresi kümelerini parçalayın ve plakayı bir dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirerek dönüştürülmüş T hücrelerinden anti-CD3 / CD28 boncuklarını çıkarın. Daha sonra toplanan hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere 1.0 çarpı 10 ila 10 konsantrasyonda kültüre geri yerleştirin. 50.000 hücre içeren T-hücre kültürünün bir aliquotunu akış tamponu ile yıkayın ve hücreleri 50 mikrolitre akış tamponu ile yeniden askıya alın.CAR ekspresyonunu tespit etmek için, T hücrelerini bir mikrolitre keçi anti-fare antikoru ile boyayın. Ölü hücreleri dışlamak için, 0.3 mikrolitre LIVE / DEAD Aqua ekleyin. Lekeli hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.15 dakika sonra, hücreleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca 650 kez G'de 150 mikrolitre akış tamponu ile yıkayın. Lekeli hücreleri sabitlemek ve geçirgenleştirmek için, hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 100 mikrolitre fiksasyon ortamı ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri, saponin ve santrifüj gibi hücre geçirgenleştirici bir ajan içeren 100 mikrolitre tamponla iki kez yıkayın.Yıkadıktan sonra, geçirgenleştirilmiş hücreleri geçirgenleştirici bir tamponun 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Daha sonra 0.3 nanogram anti-insan ETNL NIS antikoru ekleyin ve dört santigrat derecede inkübe edin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, gösterildiği gibi 150 mikrolitre akış tamponu ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.Daha sonra hücreleri, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.5 mikrolitre anti-tavşan sekonder antikoru içeren 50 mikrolitre akış tamponu ile inkübe edin. T hücrelerini gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, akış sitometrisi yapmak için hücreleri 200 mikrolitre akış tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra hücrelerin transdüksiyon verimliliğini belirleyin.Sekizinci günde, T hücrelerini dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 300 kez G'de sayın ve döndürün, ardından hücre peletini mililitre başına altıncı hücrelere 10 kez 10 konsantrasyonda bir dondurucu ortamla yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun bir mililitresini, eksi 80 santigrat derece dondurucuda 48 saat boyunca saklamak için etiketli her kriyo şişesine aktarın. 48 saat sonra, T hücrelerini sıvı azota aktarın.NIS pozitif BCMA CAR T hücreleri enjekte edilen fareleri, fareleri tartarak ve metal kulak etiketlerini çıkararak PET/BT görüntüleme için hazırlayın. Daha sonra taze hazırlanmış F18 tetrafloroboratın 9.25 megabecquerel'ini kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla fareye intravenöz olarak enjekte edin. 45 dakikalık alım süresinden sonra, 15 dakika boyunca anestezi uygulanan bir farenin statik PET görüntülerini elde etmeye devam edin, ardından 360 derece dönüş ve 180 projeksiyon ile beş dakika boyunca BT görüntü alımı izleyin.Bu temsili analizde, iki virüsün T hücrelerine birlikte transdüksiyonu, hücrelerin% 90'ından fazlasının NIS pozitif olduğu NIS pozitif BCMA CAR T hücreleri üretti. T hücresi büyüme kinetiğinin sıfırdan sekiz güne kadar analizi, BCMA CAR ve NIS'in dahil edilmesinin, dönüştürülmemiş hücrelere kıyasla T hücresi genişlemesini önemli ölçüde etkilemediğini ortaya koymuştur. OPM-2'nin akış sitometrik analizinde, lentivirüs ile transdüklenen hücreler, puromisin ile tedavi üzerine GFP ekspresyonunu temsil etti.BCMA pozitif lusiferaz pozitif OPM-2 hücreleri alan fareler, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını doğrulamak için biyolüminesans görüntülemeye tabi tutuldu. F18 tetrafloroborat uygulanan farenin PET görüntülemesinde çeşitli organlarda ve kemik iliğinde NIS pozitif BCMA CAR T-hücre dağılımı saptandı. Ek olarak, fareden toplanan kemik iliği hücreleri, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını ve NIS pozitif BCMA CAR T hücrelerinin kemik iliğine verilmesini gösterdi.İnfüze edilmiş CAR T hücrelerinin yüksek kaliteli görüntülenmesi için, NIS CAR T hücresi üretim protokolünün adımlarını takip etmek ve çift NIS ve CAR pozitif fraksiyonlarının varlığını doğrulamak önemlidir.

dynamic-imaging-chimeric-antigen-receptor-t-cells-with

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Diffüz floresans tomografi preklinik için yüksek boyunca nispeten düşük maliyetli ve potansiyel bir yaklaşım...

Kanser BİYOMARKÖRLERİN Yerelleştirme Küçük Hayvanlarda Bilgisayarlı Tomografi eşliğinde Zaman alanı Diffüz Floresans Tomografi

Biyoortogonal ters elektron talebi Diels-Alder sikloilavesi, kanser için etkili ve modüler önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi oluşturmak için kullanılmıştır. Bu protokolde, bu metodolojinin adımları, kolorektal kanser hedefli antikor huA33 ve 64Cu etiketli bir radyoligand kullanan bir model sistem bağlamında açıklanmaktadır.

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Floresan aracılı tomografi (FMT) ile mikro bilgisayarlı tomografiyi (μBT) birleştiren hibrit görüntüleme için bir protokol tarif ediyoruz. Füzyon ve rekonstrüksiyondan sonra, floresan dağılımının kantitatif ölçümlerini çıkarmak için etkileşimli organ segmentasyonu gerçekleştiriyoruz.

Hibrid uCT-FMT görüntüleme ve görüntü analizi

[18F] 3F4AP'in yarı otomatikleştirilmiş radyokimyasal sentezini ve kalite kontrol prosedürlerini gösteririz.

Otomatik Radyokimyasal Sentez [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Demyelinizan Hastalıkların Görüntülenmesine Yönelik Yeni Bir PET İzleyici

Pozitron emisyon tomografi (PET) görüntüleme siteleri birden çok erken araştırma klinik deneylere katılan sağlam ve çok yönlü radiotracer üretim yeteneklerini gerekir. Radiotracer [18F] kullanarak Clofarabine örnek olarak, esnek, kaset tabanlı radiosynthesizer kullanarak bir radiotracer sentezi otomatikleştirmek ve klinik kullanım için sentez doğrulamak nasıl göstermek.

Klinik üretim için bir pozitron emisyon tomografi (PET) Radiotracer sentez protokolü'nün Otomasyon

Pozitron emisyon tomografisi için flor-18(18F) etiketli radyofarmasötiklerin sentezi genellikle aylar süren bir deneyim gerektirir. Bir radyotracer içine dahil edildiğinde, silikon-florür alıcı (SiFA) motifi, pahalı ekipman ve hazırlık eğitimi bağımsız basit bir 18F-labeling protokolü sağlar, gerekli öncül miktarını azaltırken ve hafif reaksiyon koşulları kullanırken.

18.000 Pozitron Emisyon Tomografisi Için Silikon Florür Alıcı (SiFA) ile İşlevselleştirilmiş Radyotracerlerin F-Etiketlemesi

Bu makale, insana özgü bir anti-CD19 monoklonal antikorun radyo-etiketlenmesi için metodolojiyi ve bunun in vivo PET görüntüleme, ex vivo gama sayımı ve otoradyografi yaklaşımlarını kullanarak bir fare multipl skleroz modelinin periferik dokularındaki B hücrelerini ölçmek için nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır.

Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19+ B Hücrelerinin Görüntülenmesi

Bu makale, yeni bir radyoaktif işaretli probun (yani, 68Ga etiketli nanobody NM-02) radyosentezini, formülasyonunu, kalite kontrolünü ve bir ksenogreft modelinde küçük hayvan PET/BT görüntülemesi için kullanımını açıklamaktadır.

68Ga Etiketli Nano Molekülün Radyosentezi, Kalite Kontrolü ve Küçük Hayvan Pozitron Emisyon Tomografisi Görüntülemesi

Bu araştırma, fibroblast aktivasyon proteininin PET görüntülemesi için GAIA V2 sentezleyici ile [68Ga] Ga-3BP-3940 üretimi için otomatik süreci açıklamaktadır. Üç test partisi üzerinde gerçekleştirilen kalite kontrol testlerinin sonuçları da sunulmaktadır.

Tümör Mikroçevresinin PET Görüntülemesi için Bir Sentez Modülünde [68Ga] Ga-3BP-3940'ın Otomatik Hazırlanması

Öğrenin, NIS ekspresyonlu kimerik antijen reseptör T hücrelerinin [18F]tetrafloroborat PET/CT ile dinamik görüntülenmesini. Bu yöntem, immünoterapi araştırmalarında hücre dağılımını invaziv olmayan şekilde izler.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin 18F Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [^18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet