Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Bu protokol, gelecek vaat eden parçaları ısı adayı olarak seçmek için ek bir araç olarak parçalanmış temel müşteri adayı bulma kampanyaları için yararlıdır. Parça taraması için Nano DSO sınırlı miktarda etiketsiz protein örneği kullanır ve hemen hemen tüm protein hedefleri için rutin olarak kullanılabilir. Bu yöntem ligands herhangi bir koleksiyonları taramak için kullanılabilir.

veya diğer yöntemlerden ısıları doğrulamak için. Eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecelik dondurucudan bir parça plaka alın ve bir tezgah üst çalkalayıcıda hafifçe sallanarak oda sıcaklığında çözülmesine izin verin. Kuyuların kenarına yapışan damlaları toplamak için plakayı 30 saniye boyunca 500 kez G'de santrifüjlayın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir alt kuyuya BIR MRC 2 kuyu kristalizasyon plakası ve pipet 15 mikrolitre protein stok çözeltisi alın. Sivrisinekteki parça ve protein plakası tanımlarını kontrol etmek için nano dağıtıcıyı kapatın ve hareketli bileşenlerin etrafında hiçbir engel olmadığından emin olun. Grafik kullanıcı arabirimini açın, Kurulum sekmesine tıklayın ve Güverte Yapılandırması altında bileşiklerin sağlandığını ve proteinin aktarıldığı plakanın türünün mevcut plakalar listesinde zaten bulunup bulunmadığını kontrol edin.

Değilse, Seçenekler'i ve ardından Plakalar'ı tıklatın ve özellik türü için doğru değerleri doldurarak yeni bir plaka tanımı oluşturun. Kurulum sekmesinin altında, Güverte yapılandırması altında plaka konumlarını belirtin. Açılır menüyü kullanarak, bir konumu için Grainier U alt plakasını ve ikinci konum için MRC 2 kuyu plakasını seçin ve protokolü kaydedin.

Parça plakasını bir konuma ve protein plakasını güvertenin ikinci konumuna yerleştirin. Protokol sekmesinde, Dosya'ya tıklayın ve parçaları dağıtmak için önceki adımda kaydedilen protokolü seçin. Dağıtılacak parçaların hacmini 0,3 mikrolitre olarak tanımlayın.

Sütun 1 ve 12 sütunlarının parça içermediği tipik bir plaka için, Başlangıç konumunu sütun ikiye ve Bitiş konumunu sütun 11'e tanımlayın. Bazı plakalarda, iki veya 11 sütun boşsa, başlangıç ve bitiş değerleri olarak üç ve 10 sütunlarını kullanın. Programı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın.

Yaklaşık iki dakika süren dağıtım tamamlandıktan sonra, proteini ve parça plakalarını robottan çıkarın ve yapışkan bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kuyulara yapışan herhangi bir damlayı toplamak için protein plakasını 30 saniye boyunca 500 kez G'de santrifüj edin. Parçaların eklenmesinden dolayı oluşmuş olabilecek yağış için protein plakasının kuyularını görsel olarak inceleyin.

Birçok kuyuda yağış görülürse, parçaların konsantrasyonlarını azaltın ve deneyi tekrarlayın. Prometheus enstrümanını aç. Dokunmatik ekranda, cihazın kılcal yükleme modülüne erişmek için Çekmeceyi Aç'a basın.

Manyetik şeridi yükleme modülünden çıkarın ve toz parçacıklarını gidermek için aynayı etanol ile temizleyin. Protein parçaları plakasından kılcal damarlara bir çözelti aktarmak için, kılcal damar yükleme modülüne kolay erişim için protein plakasını ve kılcal damarları cihazın yanına yerleştirin. Bir ucundan tutarak bir kılcal damar alın ve numuneyi aktarmak için kılcal damarın diğer ucuyla protein plakasındaki çözeltiye dokunun.

Eldivenlerden kaynaklanan safsızlıklar ölçümü etkileyeceğinden, her zaman eldiven giyin ve ortadaki kılcal damara dokunmamaya dikkat edin. Kılcal damarı tutucunun belirlenen konumuna getirin, düzgün hizalanmış ve ortalanmış olduğundan emin olun, yükleme modülündeki tüm pozisyonları doldurmak için bu adımları tekrarlayın. Sonunda, manyetik şeridi kılcal damarların üzerine yerleştirin ve Nano-DSF deneyini başlatmak için Çekmeceyi Kapat'a basın.

Prometheus uygulama PR'ını açın. ThermControl'ü tıklatın ve Yeni Oturum Başlat'ı tıklatarak yeni bir proje oluşturun. İlk olarak, örneklerin floresanını tespit etmek için bir keşif taraması yapın. Lazerin heyecan verici gücünü ayarlayarak örneklerin floresan sinyalini değiştirin.

Termal denatürasyon için, Erime Taraması sekmesine tıklayın, başlangıç sıcaklığını 20 santigrat dereceye, bitiş sıcaklığını 95 santigrat dereceye ve sıcaklık eğimini dakikada bir santigrat dereceye ayarlayın. Ardından Ölçümü Başlat'a tıklayın. Dış, kinetik veya kanserde yüksek oranda ifade edilen dış, kinetik veya kanserde yüksek oranda ifade edilen kayma ve erime sıcaklığının frekans dağılımı, monopolar mil kinaz 1'in düzenleyici tetratrikopeptid tekrar etki alanı ve SARS-CoV-2 3c benzeri proteaz burada gösterilmiştir.

Negatif değerler bir parçanın varlığında erime sıcaklığında bir azalmaya işaret ederken, pozitif bir değer erime sıcaklığında bir artış olduğunu gösterir. Nsp5 için, tüm parçalar dengeleyici bir etkiye sahipken, Hec1 ve Mps1 için hem stabilize edici hem de dengeleyici darbeler gözlenir. Bu, parça kitaplıklarını taramak için ucuz ve hızlı bir yöntemdir.

NMR veya X-ışını Kristalografisi gibi diğer yöntemler parçaların tam bağlanmasını gösterebilir ve inx keşfi ile de kullanılabilir. Koronavirüs proteaz sonuçları, COVID-19'a karşı ilaçlara dönüştürülebilecek yeni bileşiklerin önerilmesine yardımcı oldu.