Name: Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme Kullanılarak Bitkilerde H3K4me3 Modifikasyonunun Profillenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin, bitkilerde H3K4me3 modifikasyonunun CUT&Tag yöntemiyle epigenomik profillemesini. Pamuk yapraklarından izole edilen nükleuslar ve Tn5 transposaz kullanılarak kromatin durumu analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları, Hainan Yazhou Körfezi Tohum Laboratuvarı (JBGS, B21HJ0403), Çin Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı (320LH002) ve JCIC-MCP projesinden gelen hibelerle finansal olarak desteklenmiştir.

1. Transpozaz ve stok çözeltileri hazırlayın (1. Gün)
NOT: Bu bölümde, oligonükleotid adaptörleri aktif transpozaz yapmak için Tn5 transpozaz ile kompleksleştirilmiştir.
<ol><li>Astarları (astar A, astar B ve astar C) tavlama tamponunu (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak 100 μM konsantrasyona kadar seyreltin (astarların sıra bilgileri için Tablo 1'e ve çalışma çözeltileri için tarifler için Tablo 2'ye bakın). Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>PCR tüplerinde aşağıdaki iki reaksiyonu ayarlayın: Reaksiyon 1 (adaptör AB), 100 μM primer A'nın 10 μL'si, 100 μM primer B'nin 10 μL'si; Reaksiyon 2 (adaptör AC), 10 μL 100 μM astar A, 10 μL 100 μM primer C.</li>
	<li>PCR makinesindeki adaptörleri aşağıdaki programı kullanarak tavlayın: ısı kapağı (102 °C), 15 dakika için 75 °C, 10 dakika için 60 °C, 10 dakika için 50 °C, 10 dakika için 40 °C, 30 dakika için 25 °C. NOT: Adaptörler kısmen çift sarmallı DNA molekülleridir (konsantrasyon = 50 pmol / μL).</li>
	<li>1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL pA-Tn5 transpozaz (500 ng/μL veya 7,5 pmol/μL), 0,75 μL adaptör AB (50 pmol/μL), 0,75 μL adaptör AC (50 pmol/μL), 7 μL bağlantı tamponu. Pipetleri 20x hafifçe karıştırın ve 30 °C'de bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin. Transpozazın son konsantrasyonu = 4 pmol / μL. Kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın. NOT: AB: adaptör AC: transpozaz = 0.5:0.5:1 adaptörünün molar oranı.</li>
	<li>Stok çözeltilerini Tablo 2'de verilen tariflere göre hazırlayın ve sterilize etmek için stok çözeltilerini otoklav veya filtreleyin.</li>
	<li>Makas, filtre kağıdı, paslanmaz çelik elek, harç, havaneli vb. otoklav ve sterilize edin.</li>
</ol>2. Çekirdek izolasyonu (2. Gün)
<ol><li>Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun. Başlangıç malzemesinin her 1 gramı (pamuk yaprakları) için 25 mL nükleer izolasyon tamponu A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL nükleer izolasyon tamponu B (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL nükleer yıkama tamponu (10 mM Tris pH 8.0) hazırlayın, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1), 1 mL antikor tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1, %0.05 w / v digitonin). Tüpleri kullanana kadar buz üzerinde bekletin.</li>
	<li>Taze yaprakları (~1 g) sıvı azotta ince bir toza öğütün ve 25 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu A içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tampon çözeltisini nazikçe karıştırın ve malzemeyi eşit şekilde dağıtmak için tüpü 5 dakika boyunca hafifçe sallayarak buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Hücre peletini oluşturmak için 4 °C'de 500 rcf'de 5 dakika santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı boşaltın ve% 0.5 Triton X-100 ile desteklenmiş 20 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu B ile peleti yeniden askıya alın. Peletin tamamen askıya alınması için tüpü yavaşça ters çevirin. NOT: 20 mL nükleer izolasyon tamponu B, 1 g başlangıç malzemesi için geçerlidir ve bu hacim buna göre ölçeklendirilebilir.<ol>
<li>Triton X-100'ün seri konsantrasyonunun etkisini test etmek için bir pilot test yapın (örneğin, 100 mg öğütülmüş doku için her biri %0,1, %0,25, %0,5 ve %1 Triton X-100 içeren 2 mL nükleer izolasyon tamponu B). Uygun Triton X-100 konsantrasyonu, altta beyaz/gri çekirdeklerin birikmesi ve düşük hızda lizis ve santrifüjleme sonrası koyu yeşil bir süpernatant ile gösterilir (4 dakika boyunca 500 rcf <).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elde edilen hücre lizatını iki eleğin bir kombinasyonu ile filtreleyin: daha büyük doku kalıntılarını çıkarmak için üstte 500 ağlık bir elek ve çekirdekleri toplamak için altta 1000 mesh elek bulunur. NOT: Bitkilerin çekirdek boyutuna bağlı olarak elekler için uygun bir ağ boyutu seçin.</li>
	<li>Lisattaki küçük hücre kalıntılarını emmek için eleğin arka tarafında steril filtre kağıdı kullanın.</li>
	<li>1000 mesh eleğin üst tarafında lizat içeren kalan çekirdekleri dört taze 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Çekirdekleri toplamak için 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika santrifüj yapın.</li>
	<li>Bir pipet ucu kullanarak süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve peleti nükleer yıkama tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>800 μL nükleer yıkama tamponu ekleyin ve peleti yeniden askıya almak için tüpleri yavaşça ters çevirin. Tüpü 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca tekrar döndürün.</li>
	<li>Toplam 3 yıkama yapın.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) DAPI boyama için çekirdekleri mikroskop altında görüntüleyin.<ol>
<li>Adım 2.11'den itibaren nükleer yıkama tamponunda 100 μL çekirdek süspansiyonunu aktarın. yeni bir 1,5 mL tüpe dönüştürün. DAPI için 2 μg/mL'lik son çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 900 μL nükleer yıkama tamponu ve 2 μL DAPI stok çözeltisi (1 mg/mL) ekleyin. Tüpü karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Boyama işleminden sonra, çekirdekleri toplamak için 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
		<li>Pipet ucu kullanarak süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. 800 μL nükleer yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve çekirdekleri 100 μL nükleer yıkama tamponu ile yeniden askıya alın.</li>
		<li>DAPI kanalını kullanarak çekirdekleri floresan mikroskobu altında görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdekleri iki tüpten birleştirin (her 1,5 mL tüpte hacim olarak ~50 μL çekirdek). 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika santrifüj. Pipet ucu kullanarak kalan tamponun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.</li>
</ol>3. Antikor inkübasyonu
<ol><li>Her 50 μL çekirdeği, 1 mL antikor tamponu ile 1.5 mL'lik bir tüpte yeniden askıya alın.</li>
	<li>1.5 mL tüplerde aşağıdaki reaksiyonları ayarlayın: Her tüpte 150 μL çekirdek (~ 1 μg kromatin) ve 2 μL IgG (1 mg / mL) içeren IgG kontrol gruplarının iki biyolojik replikatı, her tüpte 150 μL çekirdek ve 2 μL anti-H3K4me3 antikoru (1 mg / mL) ile H3K4me3 tahlil gruplarının iki biyolojik replikatı.</li>
	<li>Çözeltiyi nazikçe karıştırın ve tüpleri 4 ° C ve 12 rpm'de gece boyunca hibridizasyon için yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın.</li>
	<li>Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde taze 50 mL immünopresipitasyon (IP) yıkama tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli% 0.1, ,% 0.05 w / v digitonin) hazırlayın. Tüpün buzun üzerine oturmasına izin verin.</li>
	<li>Tüpleri 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın. Antikor tamponunu her tüpten çıkarın.</li>
	<li>Her tüpe 800 μL IP yıkama tamponu ekleyin ve nazikçe karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında ve 12 rpm'de 5 dakika boyunca yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın.</li>
	<li>Yıkadıktan sonra, tüpleri 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj edin. Bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın. NOT: Çekirdek peletinin herhangi bir şekilde bozulmasını önlemek için, tamponun ~ 50-80 μL'sini çekirdeklerle birlikte bırakın.</li>
	<li>3.6.-3.7 arasındaki adımları yineleyin. iki kez daha.</li>
	<li>Üçüncü yıkamadan sonra, 4 ° C'de 300 rcf'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Kalan arabelleği mümkün olduğunca çıkarın.</li>
</ol>4. Transpozaz inkübasyonu
<ol><li>1 mL IP yıkama tamponunu 30 μL 5 M NaCl ile karıştırarak taze 1 mL transpozaz inkübasyon tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1, % 0.05 w / v diggitonin) yapın.</li>
	<li>Tn5 transpozaz karışımını inkübasyona hazırlamak için, transpozaz inkübasyon tamponunun her 150 μL'sine 1 μL transpozaz ekleyin. NOT: Transpozaz çözeltisi karışımını önce reaksiyon sayısına göre hazırlayın ve ardından her tüpe 150 μL'lik bir aliquot ekleyin.</li>
	<li>Çekirdekleri 150 μL transpozaz çözeltisi ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında 2-3 saat boyunca 12 rpm'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın ve her 10-15 dakikada bir karıştırın.</li>
	<li>Transpozaz inkübasyonundan sonra, tüpleri 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın. Her tüpteki transpozaz inkübasyon tamponunu çıkarın.</li>
	<li>Tüpleri IP yıkama tamponu ile yıkayın. Bunu yapmak için, her tüpe 800 μL IP yıkama tamponu ekleyin, yavaşça karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12 rpm'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın.</li>
	<li>4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika santrifüj. Bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>4.6.-4.7 arasındaki adımları yineleyin. iki kez daha.</li>
	<li>Üçüncü yıkamadan sonra, 4 ° C'de 300 rcf'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Kalan arabelleği mümkün olduğunca çıkarın.</li>
</ol>5. Etiketleme
<ol><li>2 mL IP yıkama tamponunu 60 μL 5 M NaCl ve 20 μL 1 M MgCl2 ile karıştırarak 2 mL etiketleme tamponunu (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1, 10 mM MgCl2, %0.05 w / v diggitonin) taze olarak yapın.</li>
	<li>Çekirdekleri 300 μL etiketleme tamponu ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Çözeltiyi karıştırın ve etiketleme için 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Etiketlemeyi 10 μL 0,5 M EDTA (nihai konsantrasyon ~15 mM) ve 30 μL %10 SDS (nihai konsantrasyon %1) ile durdurun.</li>
</ol>6. DNA ekstraksiyonu ve NGS kütüphanesi yapımı
<ol><li>Açıklandığı gibi 300 μL CTAB DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin7. Tüpleri 65 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Her ~ 10 dakikada bir karıştırmak için ters çevirin.</li>
	<li>Her tüpe 600 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. İyice karıştırın.</li>
	<li>Faz kilit jel borularını 4 °C'de 13.000 rcf'de 2 dakika boyunca önceden santrifüj edin. Yukarıdaki çözeltiyi faz kilit jel tüplerine aktarın.</li>
	<li>4 °C'de 13.000 rcf'de 10 dakika santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı (~ 600 μL) yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Her tüpe 600 μL kloroform ekleyin. İyice karıştırın.</li>
	<li>4 °C'de 13.000 rcf'de 10 dakika santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı (~ 600 μL) yeni bir 1.5 ml'lik tüpe aktarın.</li>
	<li>12 μL% 100 etanol ve 2 μL GlikoMavi Kopresipitant ekleyin. İyice karıştırın ve 1 saat boyunca -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>4 °C'de 13.000 rcf'de 10 dakika santrifüj.</li>
	<li>Süper natantı dekant. DNA peletini %75 (v/v) etanol ve santrifüj kullanarak 4 °C'de 13.000 rcf'de 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>Süper natantı dekant. DNA peletini hava ile kurutun ve DNA'yı 25 μL ddH2O içinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın. Toplam 50 μL reaksiyon için, 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE tamponu, 2 μL P5 primer (10 μM), 2 μL P7 primer (10 μM) ve 1 μL TruePrep Amplify Enzimi ekleyin. PCR programı: 3 dakika için 72 °C, 30 s için 98 °C; daha sonra 30 s için 98 ° C, 30 s için 60 ° C ve 30 s için 72 ° C'lik 14 döngü, ardından 5 dakika boyunca 72 ° C. NOT: Uzatma için 3 dakika boyunca ilk 72 °C atlanamaz . Kütüphanenin aşırı amplifikasyonu, NGS'de yüksek düzeyde PCR kopyalarına yol açacaktır. Her reaksiyonda ~1 μg kromatin kullanıldığında H3K4me3 için PCR reaksiyonunda 12-14 PCR döngüsünden başlayın.</li>
	<li>PCR ürünlerinin 2 μL'sini elektroforez için% 1.5 agaroz jeli üzerine yükleyin.</li>
	<li>PCR ürünlerini ticari DNA saflaştırma manyetik boncukları kullanarak saflaştırın.</li>
	<li>Kütüphaneyi bir florometre ve agaroz jel elektroforezi ile sayısallaştırın. NOT: Kütüphanenin etkin konsantrasyonu, iyi kalite sağlamak için qPCR ile >2 nM olmalıdır.</li>
	<li>Yeni nesil sıralama (NGS) ve veri analizi gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

Tüm yazarların, yukarıda belirtilen ürünlerden birini takas eden herhangi bir şirketle çıkar çatışması yoktur.

Burada, kromatin immünopresipitasyonuna (ChIP) kıyasla basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda DNA kütüphaneleri oluşturmak için bir teknoloji olan CUT & Tag'i tanımladık. Pamuk yapraklarında H3K4me3 profilleme ile elde ettiğimiz başarı, ilk olarak hayvan hücreleri için tasarlanan CUT&Tag'ın bitki hücreleri için de kullanılabileceğini göstermektedir. Hem ChIP testi8 için yaygın olarak kullanılan Tris tampon sistemi hem de hayva...

Transkripsiyon faktörü bağlayıcı DNA bölgeleri ve histon modifikasyon işaretleriyle ilişkili açık kromatin, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik fonksiyonel rollere hizmet eder ve epigenetik araştırmaların ana odak noktalarıdır1. Geleneksel olarak, kromatin immünopresipitasyon testi (ChIP), derin dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, spesifik kromatin histon modifikasyonunun veya spesifik proteinlerle DNA hedeflerinin genom çapında tanımlanması için kullanılmıştır ve epigenetik alanında yaygın olarak benimsenmiştir2. Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT&Tag) teknolojisi ilk olarak Henikoff Laboratuvarı tarafından genom boyunca proteine bağlı DNA fragmanlarını yakalamak için geliştirilmiştir5. ChIP ile karşılaştırıldığında, CUT&Tagcan basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda DNA kütüphaneleri oluşturur3. Bugüne kadar, hayvan hücrelerinde CUT&Tag kullanılarak spesifik histon modifikasyonları olan kromatin bölgelerinin analizi için yöntemler oluşturulmuştur4,5. Özellikle, tek hücreli CUT&Tag (scCUT&Tag) insan dokuları ve hücreleri için de başarıyla geliştirilmiştir6. Bununla birlikte, hücre duvarının ve ikincil metabolitlerin karmaşıklığı nedeniyle, CUT & Tag bitki dokuları için teknik olarak hala zordur.
Daha önce, allotetraploid pamuk yapraklarından izole edilmiş sağlam çekirdekler kullanan bir CUT&Tag protokolü bildirmiştik4. Çekirdek izolasyonunun ve bitki dokusunu kullanarak DNA yakalamanın etkinliğini göstermek için, profilleme prosedürü burada sunulmuştur. Başlıca adımlar arasında bozulmamış çekirdek izolasyonu, kromatin modifikasyonu için antikor ile in situ inkübasyon, transpozaz inkübasyonu, adaptör entegrasyonu ve DNA kütüphanesi hazırlığı bulunmaktadır. Sorun giderme, tesis çekirdeği izolasyonu ve kalite kontrolü için CUT&Tag kütüphanesinin hazırlanmasına odaklanır. 
Bu çalışmada, bitkiler için rafine bir CUT&Tag stratejisi sunuyoruz. Sadece pamuk yapraklarında H3K4me3 profillemesi için adım adım bir protokol sağlamakla kalmıyoruz, aynı zamanda uygun hücre lizisi için deterjan konsantrasyonunu seçme stratejisi ve çekirdekleri filtreleme stratejisi de dahil olmak üzere bitki çekirdeği izolasyonu için optimize edilmiş bir metodoloji sunuyoruz. Kritik yorumlar içeren ayrıntılı adımlar da bu güncellenmiş protokole dahil edilmiştir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikor< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Normal tavşan IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Kimyasallar < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td></td><td></td> <td>10 mg / ml BSA stok çözeltisi yapın. -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>digitonin (~% 50 (TLC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>% 5 digitonin stok çözeltisi yapın (200 mg digitonin [~% 50 saflık] ila 2 mL DMSO). Not: 0,22 mikronluk bir filtre kullanarak sterilize edin. -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td></td><td></td> <td>0.5 M EDTA (pH = 8.5) stok çözeltisi yapın. Not: 100 mL 0,5 M EDTA (pH = 8,5) yapmak, pH'ı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> ayarlamak için yaklaşık 2 g sodyum hidroksit (NaOH) peletleri gerektirir <tr><td>etanol GlycoBlue Koçökeltican (15 mg / mL)</td> <td>İnvitrojen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür (MgCl2)</td><td></td><td></td> <td>1 M MgCl yapın < alt >2 stok çözeltisi</td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür (KCl)</td><td></td><td></td> <td>1 M KCl stok çözeltisi yapın</td></tr><tr><td>fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1, v: v: v</td><td></td><td></td><td></td>)</tr> <tr><td>sodyum klorür (NaCl)</td><td></td><td></td> <td>5 M NaCl stok çözeltisi</td></tr><tr><td>yapın spermidin</td><td></td><td></td> 2 <td>M spermidin stok çözeltisi yapın, -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td></td><td></td><td>% 10 SDS stok çözeltisi yapın. Not: Otoklav yapmayın; 0,22 mikronluk bir filtre kullanarak sterilize edin</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td></td><td></td><td>1 M Tris (pH = 8.0) stok çözeltisi</td></tr><tr><td>yapın Triton X-100</td><td></td><td></td><td>%20 Triton X-100 stok çözeltisi yapın</td></tr> <tr><td><güçlü>Enzim< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CUT & için hiperaktif pG-Tn5 / pA-Tn5 transpozaz Etiket</td>: <td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>Tn5 ile kaynaşmış protein A veya protein G'nin antikor afinitesini kontrol edin. Genel olarak konuşursak, A ve G proteinleri geniş antikor afinitesine sahiptir. Bununla birlikte, protein A, tavşan antikorlarına nispeten daha yüksek bir afiniteye sahiptir ve protein G, fare antikorlarına nispeten daha yüksek bir afiniteye sahiptir. Antikorunuza uyan uygun transpozaz ürünlerini seçin.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>ABI9700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp; spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-BİR-W</td><td></td></tr></tbody></table>

hedefler altında bölünme ve etiketleme kullanılarak bitkilerde h3k4me3 modifikasyonunun profillenmesi

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

DNA ve histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörlerinin davranışları ve işe alınan proteinleriyle kodlamayan RNA'lar dahil olmak üzere kromatik düzeyde epigenomik düzenleme, gen ekspresyonunun zamansal ve mekansal kontrolüne yol açar. Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag), spesifik kromatin proteininin ilk önce spesifik antikoru tarafından tanındığı ve daha sonra antikorun, magnezyum iyonlarının aktivasyonu ile hedeflenen kromatini in situ olarak parçalayan bir protein A-transpozaz (pA-Tn5) füzyon proteinini bağladığı bir enzim-tethering yöntemidir. Burada, daha önce yayınlanmış CUT & Tag protokolümüzü, allortetraploid pamuk yapraklarından izole edilmiş bozulmamış çekirdekleri modifikasyonla kullanarak sunuyoruz. Bu adım adım protokol, bitkilerde epigenomik araştırmalar için kullanılabilir. Ek olarak, bitki çekirdeği izolasyonu için önemli değişiklikler kritik yorumlarla sağlanmaktadır.

Şekil 1'de CUT&amp;Tag iş akışı gösterilmektedir. Şekil 2 , bozulmamış çekirdeklerin DAPI boyamasını göstermektedir. "Çekirdek izolasyonu" adımının amacı, bozulmamış çekirdekleri sonraki CUT &amp; Tag reaksiyonu için yeterli miktarda elde etmekti. Şekil 3'te PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi görülmektedir. IgG negatif kontrolü, denemeyi kurarken paralel olarak gereklidir. IgG kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, H3K4me3 an...

Hedefler ve etiketleme altında bölünme (CUT&Tag) etkili bir kromatin epigenomik profilleme stratejisidir. Bu protokol, tesislerdeki histon modifikasyonlarının profillenmesi için rafine bir CUT&Tag stratejisi sunar.

Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme Kullanılarak Bitkilerde H3K4me3 Modifikasyonunun Profillenmesi

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Deneyin genel amacı, kromatinin durumunu yansıtan genom boyunca proteine bağlı DNA fragmanlarını tanımlamaktı. Bu amaca ulaşmak için üç özel operasyon gerçekleştirildi. Her şeyden önce, bitki hücrelerinden gelen bozulmamış çekirdekler izole edildi.İkincisi, kromatin modifikasyonları in situ spesifik bir antikor tarafından tanındı. Üçüncüsü, bir protein A-transpozaz füzyon proteini olan Tn5 transpozazı bağlayan antikor, magnezyum iyonlarının aktivasyonu altında kromatini in situ olarak parçalar. DNA fragmanları ve kromatin modifikasyonu bağlanma bölgeleri daha sonra adaptörlerle entegre edildi ve DNA hazırlığı için hazır hale getirildi.Polimeraz zincir reaksiyonu zenginleştirmesi, nesil dizilimini arttırdı. DNA ve histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörlerinin davranışları ve işe alınan proteinleriyle kodlamayan RNA'lar dahil olmak üzere kromatik düzeyde epigenomik düzenleme, gen ekspresyonunun zamansal ve mekansal kontrolüne yol açar. Henikoff Lab tarafından geliştirilen CUT&Tag teknolojisi, kromatin epigenomik profillemesi için yüksek verimlilikte bir enzim bağlama yöntemidir.Burada pamuk yapraklarını deney malzemeleri olarak kullanıyoruz ve örnek olarak Histone H3 Lysine-4 Trimethylation antikoru kullanarak kromatin profillemesini gerçekleştiriyoruz. Tesislerde CUT&Tag performansı için video içeren rafine bir protokol sunuyoruz. CUT&Tag kullanılarak yapılan her numune hazırlığı için gram pamuklu yaprak dokusu toplandı.Yaprak, sıvı azotlu ince bir toz haline getirildi ve 25 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu içeren 50 mL'lik bir şahin tüpüne aktarıldı A.Tampon çözeltisi yavaşça karıştırıldı ve tüp, malzemeyi eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sallanarak beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Daha sonra hücre peletini oluşturmak için beş dakika boyunca 500 göreceli merkezkaç kuvvetinde veya rcf'de, 4 santigrat derecede döndürüldü. Süpernatant boşaltıldı ve pelet 20 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu B ile% 0.5 Triton ile desteklenerek yeniden askıya alındı.Pelet tamamen askıya almak için tüp hafifçe ters çevrildi. Elde edilen hücre lizatı daha sonra iki elek kombinasyonu ile filtrelendi, daha büyük doku kalıntılarını çıkarmak için üstte 500 mesh elek kullanıldı. Çekirdekleri toplamak için altta 1000 mesh elek kullanıldı.Eleklerin uygun ağ boyutunun seçimi, bitkilerin çekirdeklerinin büyüklüğüne bağlıdır. Lizatın bir kısmını ve küçük hücre kalıntılarını emmek için eleğin arka tarafında steril filtre kağıdı kullanılmıştır. Çekirdekleri içeren lizat, taze bir 1.5 mililitre santrifüj tüpüne aktarıldı ve çekirdekleri toplamak için dört dakika boyunca 300 rcf'de, 4 santigrat derece santigrat derecede döndürüldü.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı. 800 mikrolitrelik bir miktar, bir nükleer yıkama tamponu eklendi. Ve tüp, çekirdekleri yeniden askıya almak için hafifçe ters çevrildi.Tüp tekrar 300 rcf'de, dört dakika boyunca 4 santigrat derecede döndürüldü. Toplam üç yıkamadan sonra, elde edilen çekirdekler taze bir 1.5 mililitre santrifüj tüpünde birleştirildi ve 4 santigrat derecede dört dakika boyunca 300 rcf'de döndürüldü. Kalan tamponu mümkün olduğunca çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı.Bir sonraki adım, antikorun inkübasyonuydu. 50 mikrolitre çekirdekten oluşan bir alikot, digitonin içinde EDTA, BSA, proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 1 mililitre antikor tamponunda yeniden askıya alındı. Bir reaksiyon için 150 mikrolitrelik çekirdek süspansiyonunun bir alikotu taze 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirildi, her tüpe iki mikrolitre antikor eklendi.Bu tahlilde, antikor eklendikten sonra anti-histon-H3-Lizin-4-Trimetilasyon antikoru ve immünoglobulin G negatif kontrol grupları için iki biyolojik replikasyon oluşturulmuştur. Çözelti nazikçe karıştırıldı ve tüpler 12 rpm'de dört santigrat derecede gece boyunca hibridizasyon için yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakıldı. Ertesi sabah, tüpler çıkarıldı ve çekirdekler 800 mikrolitre immünosu çökeltme yıkama tamponu kullanılarak yıkandı.Tüp karıştırmak için hafifçe ters çevrildi ve 12 rpm'de oda sıcaklığında beş dakika boyunca yatay çalkalayıcıda bırakıldı. Yıkandıktan sonra, tüp dört santigrat derecede dört dakika boyunca 300 rcf'de döndürüldü. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant bir pipet ucu kullanılarak çıkarıldı.Bu toplam üç yıkama için tekrarlandı. Üçüncü yıkamadan sonra, tüp dört santigrat derecede iki dakika boyunca 300 rcf döndürüldü ve kalan tamponu mümkün olduğunca çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı. Tn5 transpozaz karışımını inkübasyon için hazırlamak.Transpozaz inkübasyon tamponunun her 150 mikrolitresine bir mikrolitre transpozaz eklendi. Transpozaz çözeltisi karışımını önce reaksiyon sayısına göre hazırlamanızı öneririz. Ve sonra her tüpe 150 mikrolitrelik bir aliquot eklemek.Çözelti hafifçe karıştırıldı ve iki saat boyunca 12 rpm'de oda sıcaklığında yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakıldı. Tüpler her 10 ila 15 dakikada bir nazikçe karıştırıldı. Kuluçkadan sonra, çekirdekler, bağlanmamış Tn5 transpozazı çıkarmak için oda sıcaklığında 800 mikrolitre immüno-çökeltme yıkama tamponu kullanılarak üç kez yıkandı.Üçüncü yıkamadan sonra, tüp dört santigrat derecede iki dakika boyunca 300 rcf'de döndürüldü ve kalan tamponu çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı. Etiketleme adımı için, reaksiyon tüpüne 300 mikrolitre etiketleme tamponu eklendi. Çözelti iyice karıştırıldı ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edildi.Kuluçkadan sonra, reaksiyonu belirlemek için 30 mikrolitre% 10 SDS'de litre başına 10 mikrolitre 0.5 mol EDTA ilave edildi. Daha sonra 300 mikrolitre DNA ekstraksiyon tamponu eklendi. Düzensiz DNA ekstraksiyonu yapıldı.DNA parçaları 25 mikrolitre steril suda çözüldü. NGS kütüphane yapımında PCR amplifikasyonu için 24 mikrolitre kullanıldı. Bu şekil, görüntüde DAPI ile bozulmamış çekirdek boyasını göstermektedir, mikroskop altında yeterli miktarda bozulmamış ve nispeten temiz çekirdek elde etmek CUT & Tag için kritik adımdır.PCR'den sonra iki mikrolitre transfer edildi ve DNA'nın boyutu% 1.5 agaroz jeli üzerinde kontrol edildi. Bu şekil immünoglobulin geninin negatif kontrolü ile karşılaştırıldığını göstermektedir. Histon H3 Lizin 4 Trimetilasyon örneğinden DNA fragmanlarının büyük kısmı 280 ila 500 baz çifti arasında değişmelidir.DNA fragmanları saflaştırılabilir ve daha sonra yüksek verimli dizileme ile profillenebilir. Bu şekil, anti-histon H3 Lizin 4 Trimetilasyon antikoru için immünoglobulin G negatif kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında sonuç üretme dizilimini göstermektedir. Bu teknoloji, ChIP-seq ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak DNA kütüphanelerini yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda oluşturur.CUT&Tag yeni bir yöntemdir ve hala devam etmektedir.

profiling-h3k4me3-modification-plants-using-cleavage-under-targets

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Protokol, kuraklığa dayanıklı ürünlerin mühendisliğine yardımcı olmak için potansiyel epigenetik belirteçler olarak hizmet edebilecek histone post-translational modifikasyonların profillenebilmesi için sorgum yaprağı malzemelerinden bozulmamış histonları etkili bir şekilde çıkarmak için geliştirilmiştir.

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Epigenetik alanda yeni olan araştırmacılar, CUT &amp; Tag'i ChIP tahlillerine göre önemli ölçüde daha kolay bir alternatif bulacaklar. CUT &amp; Tag, nadir ve birincil hücre popülasyonları üzerindeki epigenetik çalışmalardan büyük ölçüde yararlandı ve çok az hücreden yüksek kaliteli veriler üretti. Bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT &amp; Tag testlerinin gerçekleştirilmesini açıklar.

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT &#38; Tag) Testinin Kullanılması

Bu protokol, çeşitli klinik örneklerden verimli histon çıkarımı ve ardından LC-MS/MS ile translasyonel sonrası modifikasyon analizini sağlar. Önemli histon modifikasyonlarının sağlam tespitini kolaylaştırarak, büyük klinik kohortlarda kapsamlı epigenetik profilleme için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Öğrenin, bitkilerde H3K4me3 modifikasyonunun CUT&Tag yöntemiyle epigenomik profillemesini. Pamuk yapraklarından izole edilen nükleuslar ve Tn5 transposaz kullanılarak kromatin durumu analiz edilir.

Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme Kullanılarak Bitkilerde H3K4me3 Modifikasyonunun Profillenmesi

Daha fazla video keşfet