D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

İzolevuglandinler çeşitli hastalıklarda, özellikle kardiyovasküler hastalıklarda rol oynamıştır. Bu protokol, D11 alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan içeren dokulardaki izolevuglandinleri tespit etmek için geliştirilmiştir. Mevcut tespit yöntemleri pahalıdır veya bir E-etiket için ikincil bir antikor gerektirir.

Güvenilir bir sekonder antikor bulmak zordur, ancak bu protokol ikincil antikor basamağını ortadan kaldırır. Dokuları ayırmak için fare ve insan parafine gömülü dokuların slaytlarını beş dakika boyunca üç kez ksilene batırın. Dokuyu yeniden sulandırmak için, dokuları iki kez% 95 etanol ile yıkayın, ardından% 70 etanol ile iki kez ve daha sonra suda hazırlanan% 50 etanol ile iki kez yıkayın.

Slayt tutucuyu TBST ile doldurarak slaytları tris tamponlu salin içinde% 0.1 Tween 20 ile üç kez yıkayın. Ardından TBST'yi atın. Slaytları önceden ısıtılmış sodyum sitrat tamponuna yerleştirin ve toplam 20 dakikalık bir antijen geri alma süresi için yüksek basınçta dört dakikaya ayarlanmış bir düdüklü tencerede inkübe edin.

Kuluçkanın sonunda, slaytları düdüklü tencereden çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika soğumaya bırakın. Gösterildiği gibi TBST ile slaytlara üç hızlı yıkama yapın. TBST'de çözünmüş %2 BSA ekleyerek slaytları engelleyin.

Slaytları parafin bantla örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bloke edici tamponu atın. TBST'de hazırlanan 200 mikrolitre D11 alkalen fosfatazı slaytlara ekleyin ve slaytları parafin bantla örtün.

Slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe ettikten sonra, slaytları TBST ile üç kez yıkayın. İmmünohistokimya için kalorimetrik alkalen fosfataz geliştiricisi veya immünofloresan için floresan alkalen fosfataz geliştiricisi ile slaytları geliştirin. Fazla geliştiriciyi gidermek ve daha fazla renk gelişimini önlemek için slaytları TBST ile bir kez yıkayın.

Slaytları, immünofloresan için PBS'de hazırlanan mililitre HEX nükleer boyası başına bir mikrogram ile karşı boyayın. Ardından, fazla karşı lekeyi çıkarmak için slaytları TBST ile bir kez yıkayın. Kapak kaymasını geliştirilen kızaklara yerleştirmek için montaj ortamını kullanın.

İmmünohistokimya için ters ışık mikroskobu veya immünofloresan için konfokal floresan mikroskop altında slaytları gözlemleyin. İzolevuglandin için D11 AP boyamasının özgüllüğünü doğrulamak için dört negatif kontrol deneyi yapılabilir. İlk negatif kontrol deneyinde, dokuları TBST'de seyreltilmiş D11 AP veya tek başına TBST ile inkübe edin.

Daha sonra dokuları seyreltilmiş D11 AP ve D11 AP bağlayıcı olmadan TBST'de seyreltilmiş bakteriyel pariplazmik ekstrakt ile inkübe edin. Rekabetçi tahlil için, fare serum albüminine eklenmiş izoLG ve izoLG'yi sekiz ila bir molar oranda hazırlayın. TBST'de D11 AP'yi bir ila 10 arasında seyreltin.

Daha sonra seyreltilmiş D11 AP'yi mililitre izolevuglandin katkılı MSA başına 50 mikrogram veya katkısız MSA ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Boyama için dokulara izolevuglandin MSA ile D11 AP veya addukte edilmemiş MSA ile D11 AP ekleyin. Son negatif kontrol seti için dokuları boyamak için ilgili tek zincirli fragman değişken antikor D20 kullanın.

Hipertansif ve normotansif farelerde aortun immünofloresansı bu protokol kullanılarak incelendi. D11 AP ile boyama, anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyonu olan farelerin aortunda kontrol farelerine kıyasla izoLG konsantrasyonunun arttığını gösterdi. D11 AP, hipertansiyonu ve normotansif insanları olan insan hastalarının bağırsak dokularında bulunan izolevuglandinleri tespit etmek için kullanıldı.

Hipertansiyonu olan hastaların dokularında yüksek izolevuglandin konsantrasyonları vardı. Dokular pariplazmik ekstrakt ile ve D11 AP olmadan boyandı. D11 AP ile boyanmış dokuda, pariplazmik ekstrakt boyalı dokuya kıyasla daha parlak boyama gözlendi ve boyamanın pariplazmik ekstraktta bulunan konjuge olmayan bakteriyel alkalen fosfatazdan kaynaklanmadığını doğruladı. Rekabetçi tahlilde, izoLG rakibi ile önceden inkübe edilmiş D11 AP ile boyanmış doku, D11 AP'li dokularda gözlenen boyamaya benzer şekilde, D11 AP'ye izolevuglandinlere özgüllük gösteren azalmış lekelenme göstermiştir.

Negatif kontrolde, fare aortunun D11 AP ile boyanması, D20'ye kıyasla güçlü boyanma ile sonuçlandı, bu da D11 AP'nin hipertansif aorttaki izolevuglandinlere özgüllüğünü gösterdi. Arka plan lekelenmesini sınırlamak için dokuda bulunan herhangi bir endojen alkalen fosfatazı inaktive etmek önemlidir.