Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Bu protokol, dokuların veya hücre popülasyonlarının daha hedefli bir karakterizasyonuna izin veren mekansal omik teknolojiler için ilgi alanlarının seçimine rehberlik etmeye yardımcı olur. Proteomik tahlillerde ROI seçimi için otomatik bir protokol, manuel protokollerden daha sağlam ve tekrarlanabilirdir ve transkriptomik tahliller için 50 mikrometre ROI'lerin kullanılması, spesifik hücre popülasyonlarının profillenmesine izin verir. Floresan görselleştirme antikorlarını uygulamak için otomatik boyayıcıyı programlayarak başlayın.

Otomatik boyama yazılımında, ana sayfa düğmesine tıklayın ve Protokoller'i seçin. Ardından Protokoller Oluştur / Düzenle'ye tıklayın ve prosedür olarak RUO Discovery Universal'ı seçin. İlk Sıra'ya tıklayın, ardından Deparafinazasyon'u ve ardından Depar v2'yi seçin.

Orta Sıcaklık için 72 santigrat dereceyi seçin, ardından Ön İşlem'e tıklayın ve Hücre Koşullandırma ve CC1 Rezervuarı'nı seçin. Çok Yüksek Sıcaklık için 100 santigrat dereceyi seçin, ardından CC1'e sekiz dakika tıklayın ve CC1 64 dakika seçilene kadar tıklamaya devam edin. İnhibitör'e tıklayın, ardından DISCOVERY İnhibitörü'nü seçin ve Kuluçka Süresi için sekiz dakika seçin.

Ardından Antikor'a ve ardından Yüksek Sıcaklık Antikor İnkübasyonu'na tıklayın. Düşük Sıcaklık için 37 santigrat dereceyi seçin. Antikor için, dağıtıcı etiketinden ANTIKOR 6'yı seçin.

Artı Kuluçka Süresi için 32 dakika'yı seçin. Çarpan HRP'ye tıklayın ve ardından Çarpan HRP Engelleyicisi'ni seçin. Ardından Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin.

Ve Kuluçka Süresi için dört dakika seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap Anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 dakika'yı seçin. Ardından Cy5'e tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için sıfır saat, sekiz dakika seçin.

Çift Dizili'ye tıklayın ve Antikor Denatürasyonu'nu seçin. Ardından Antikor Denatüre CC2-1'i seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 santigrat dereceyi seçin. Kuluçka süresinin sekiz dakika olduğundan emin olun.

Ardından, DS İnhibitörü'ne tıklayın ve Nötralize Et'i seçin. DS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 santigrat dereceyi seçin. Ardından Antikor'da, dağıtıcı etiketinden ANTİKOR 3'ü seçin.

Artı Kuluçka Süresi için 32 dakikayı seçin. DS Multimer HRP'ye tıklayın ve DS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için dört dakika seçin.

Ardından, Multimer HRP Reaktifinde OMap anti-Ms HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 dakika'yı seçin. Ardından DS Rhodamine 6G'ye tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için sıfır saat, sekiz dakika seçin. Üçlü Leke'ye tıklayın ve TS Antikor Denatürasyonu'nu seçin, ardından Antikor Denatürasyonu CC2-2'yi seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 santigrat derece'yi seçin.

Kuluçka süresinin sekiz dakika olduğundan emin olun. Ardından, TS İnhibitörü'ne tıklayın ve TS Nötralize Et'i seçin. TS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 santigrat dereceyi seçin.

Ardından Antikor'da, dağıtıcı etiketinden ANTIKOR 7'yi seçin ve Artı İnkübasyon Süresi için 32 dakika'yı seçin. TS Multimer HRP'ye tıklayın ve TS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için dört dakika seçin.

Multimer HRP Reaktifi'nde OMap Anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 dakika'yı seçin. Ardından TS FAM'a tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için sıfır saat, sekiz dakika seçin. Kaydet'e tıklayın ve protokole bir başlık ekleyin.

Bir protokol numarası seçin, bir yorum ekleyin ve Etkin'e ve ardından Kaydet'e tıklayın. Satıcı tarafından tedarik edilen formalin sabit parafin gömülü insan dokusu kesitlerini, 20 ila 60 dakika boyunca 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırında pişirin. Slaytlar pişirilirken, otomatik boyama yazılımında Etiket Oluştur'u tıklatarak etiketleri yazdırın.

Ardından, Protokoller'e tıklayın, protokol numarasını seçin ve Kapat / Yazdır'a tıklayın. Slayt etiketine ilgili bilgileri ekleyin ve Yazdır'a tıklayın. Kızakları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

Önceden yazdırılmış protokol etiketlerini ilgili slaytlara uygulayın. Yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarına antikor etiket numaralarına göre antikorlar yükleyin. Her bir antikoru belirtilen seyrelticide seyreltin ve yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarını astarlayın.

Blokaj, algılama ve amplifikasyon önceden doldurulmuş reaktif dağıtıcılarını toplayın ve bunları cihaz reaktif tepsisine yerleştirin. Slayt çekmecelerine slaytları yükleyin ve Çalışıyor'a ve ardından Evet'e tıklayın. Otomatik boyama yazılımındaki çalışma süresini kontrol ederek çalıştırmanın başlangıcını onaylayın.

Ertesi gün, slayt çekmecesi yuvalarındaki yeşil yanıp sönen ışıkları gözlemleyerek çalıştırmanın tamamlanmasını sağlayın. Daha sonra kızakları cihazdan çıkarın ve sıvı kapak kayma çözeltisi tamamen çıkarılana kadar slaytları 1x reaksiyon tamponunda kuvvetlice durulayın. Florofor entegrasyonunu sağlamak için SYTO 13'ü 5.000 nanomolar'da SYTO 64 ile değiştirin.

SYTO 64'ü 1x TBS'de seyreltin ve 15 dakika boyunca bir nem odasında inkübe edin. DISCOVERY Fam için FITC'yi kullanın ve pozlamayı 200 milisaniyeye ayarlayın. DISCOVERY Rhodamine 6G için Cy3'ü kullanın ve pozlamayı 200 milisaniyeye ayarlayın.

SYTO 64 için Texas Red kullanın ve pozlamayı 50 milisaniyeye ayarlayın. Odak kanalı olarak SYTO 64'ü belirtin ve son olarak DISCOVERY Cy5 için Cy5'i kullanın. Pozlamayı 200 milisaniyeye ayarlayın ve değişiklikleri kaydedin.

Formalin sabit parafin gömülü hücre pelet bölümlerini 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırında 20 ila 60 dakika pişirin. Uzamsal profil oluşturma platformundaki slaytları tarayın ve 50 mikrometre ve 300 mikrometre boyutlarını seçin. Otomatik görselleştirme protokolü, komşu kanallardan kanama olmadığını doğrulamak için birini dışarıda bırakma kontrolleri dahil edilerek geliştirilmiştir.

Uzamsal proteomik tahlilde yer alan tüm belirteçlerin log 2 ısı haritası, siyah renkli manuel pan-sitokeratin CD 45 protokolünü gri renkteki otomatik 3-plex protokolü ile karşılaştırarak 0.88'lik bir Spearman R değeri göstermektedir. Tahlillerde kullanılan 31 antikordan 23 antikorun Spearman R değeri 0.5'ten yüksek veya ona eşitti. Uzamsal transkriptomik tahlilde yer alan seçilmiş hedeflerin log 2 ısı haritası, siyah renkte manuel pan-sitokeratin CD 45 protokolünü gri renkte 3-plex otomatik protokolle karşılaştırarak bu değerlerde farklılıklar göstermiştir.

3-plex otomatik görselleştirme protokolü için sıralama verileri, pan-sitokeratin CD 45 manuel görselleştirme protokolüne kıyasla daha düşük değerler sundu ve bu da 0.15'lik düşük Spearman R değerleri tarafından da yansıtıldı. Ayrıca, 3-plex görselleştirme otomatik protokolü kullanılırken dinamik aralık kaybı gözlendi. Mekansal transkriptomik protokolünde küçük ROI'lerin tespiti, 50 mikrometrede dairesel ilgi bölgelerinin seçilmesiyle gerçekleştirildi ve farklı hücre hatlarında seçilen hedefler için 300 mikrometre çapında RNA sayımları, normalleştirmeden sonra ilgi büyüklüklerinin iki bölgesi arasında karşılaştırılabilirdi.

Otomatik görselleştirme panelleri için bu protokol, mekansal proteomik sorularını cevaplamak için yatırım getirilerini tam olarak tanımlayan paneller geliştirmek için belirteçleri değiştirerek araştırmacılar tarafından uyarlanabilir.