Name: Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Keşfedin, uzamsal omik teknolojilerinde ilgi bölgelerinin otomatik seçimiyle doku ve hücre popülasyonlarının hedeflenmiş karakterizasyonunu. Bu yöntem, proteomik ve transkriptomik analizlerde sağlamlığı ve tekrarlanabilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Thomas Wu'yu NGS dosyalarını işlediği için kabul ediyor. Sonuç tartışmaları ve makale incelemesi için James Ziai'ye ve iç makale revizyonu için Meredith Triplet ve Rachel Taylor'a teşekkür ederiz.

Tüm insan dokuları, ticari biyobankalardan veya akredite doku bankalarından, uygun Kurumsal İnceleme Kurulu onayı ve bilgilendirilmiş onam alındığı garantisi altında edinilmiştir.
NOT: Protokol, Discovery Ultra ve GeoMx Dijital Uzamsal Profil Oluşturucu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokolde kullanılan reaktifler, ekipman ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Uzamsal proteomik testler için otomatik görselleştirme protokolü
<ol><li>Floresan görselleştirme antikorlarını uygulamak için otomatik boyayı programlayın<ol><li>Otomatik boyama yazılımında, ana sayfa düğmesine tıklayın ve Protokoller'i seçin. Ardından, Protokoller Oluştur/Düzenle'ye tıklayın ve prosedür olarak RUO DISCOVERY Universal'ı seçin.</li>
		<li>Depar v2'> Birinci Sıra > Deparafinizasyon'a tıklayın. Orta Sıcaklık için 72 ° C'yi seçin, ardından Ön İşlem'e tıklayın ve Hücre Koşullandırma ve CC1 Rezervuarı'nı seçin. Çok Yüksek Sıcaklık için 100 ° C'yi seçin, ardından CC1 8 Dk'ya tıklayın ve CC1 64 Min seçilene kadar tıklamaya devam edin.</li>
		<li>İnhibitör > DISCOVERY İnhibitörü'ne tıklayın ve Kuluçka süresi için 8 Dakika'yı seçin. Ardından, Yüksek Sıcaklık Ab İnkübasyonu > Antikor'a tıklayın; Düşük Sıcaklık için 37 ° C'yi seçin; Antikor için, dağıtıcı etiketinden antikor numarasını seçin (bu örnekte Antikor 6); Artı Kuluçka Süresi için 32 Dakika'yı seçin. NOT: Bu protokolün üç farklı antikor numarası vardır. İlk antikor FAP, ikincisi Pan-Sitokeratin ve üçüncüsü Antikor X'tir.</li>
		<li>Multimer HRP > Multimer HRP Bloker'a tıklayın, ardından Antikor Blokajı için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için 4 Dakika'yı seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 Dakika'yı seçin. Ardından, Cy5'e tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için 0 Saat 8 Dakika'yı seçin.</li>
		<li>Çift Sıralı'ya tıklayın ve Antikor Denatürasyonu'nu seçin, ardından Antikor Denatürasyonu CC2-1'i seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 ° C'yi seçin. Kuluçka süresinin 8 dakika olduğundan emin olun. Ardından, DS İnhibitörü'ne tıklayın ve Nötralize Et'i seçin.</li>
		<li>DS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 ° C'yi seçin. Ardından, Antikor'da, dağıtıcı etiketinden (bu örnekte Antikor 3) antikor numarasını seçin ve Artı Kuluçka Süresi için 32 Dakika'yı seçin.</li>
		<li>DS Multimer HRP'ye tıklayın ve DS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından, Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için 4 Dakika'yı seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap anti-Ms HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 Dakika'yı seçin. Ardından, DS Rhodamine 6G'ye tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için 0 Saat 8 Dakika'yı seçin.</li>
		<li>Üçlü Leke'ye tıklayın ve TS Antikor Denatürasyonu'nu seçin, ardından Antikor Denatürasyonu CC2-2'yi seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 ° C'yi seçin. Kuluçka süresinin 8 dakika olduğundan emin olun. Ardından, TS İnhibitörü'ne tıklayın ve TS Nötralize Et'i seçin.</li>
		<li>TS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 ° C'yi seçin. Ardından, Antikor'da, dağıtıcı etiketinden (bu örnekte Antikor 7) antikor numarasını seçin ve Artı Kuluçka Süresi için 32 Dakika'yı seçin.</li>
		<li>TS Multimer HRP'ye tıklayın ve TS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından, Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için 4 Dakika'yı seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 Dakika'yı seçin. Ardından, TS FAM'a tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için 0 Saat 8 Dakika'yı seçin.</li>
		<li>Protokole bir başlık ekleyin. Bir protokol numarası seçin, bir yorum ekleyin ve Etkin'e ve ardından Kaydet'e tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytları hazırlama, etiketleri yazdırma ve otomatik boyama çalıştırmayı başlatma<ol><li>Fırın satıcısı, FFPE (Formalin sabit, parafin gömülü) insan dokusu kesitlerini 20-60 dakika boyunca 70 ° C'ye ayarlanmış bir fırında tedarik etti. Slaytlar pişirilirken, otomatik boyama yazılımında Etiket Oluştur'u tıklatarak etiketleri yazdırın. Ardından, Protokoller'e tıklayın, protokol numarasını seçin ve Kapat / Yazdır'a tıklayın. Slayt etiketine ilgili bilgileri ekleyin ve Yazdır'a tıklayın.</li>
		<li>Kızakları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) soğumaya bırakın. Önceden yazdırılmış protokol etiketlerini ilgili slaytlara uygulayın.</li>
		<li>Yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarını, adım 1.1'de atanan antikor etiket numarasına göre antikorlarla yükleyin. Bu protokolde, 1 μg / mL'de FAP için Antikor 6, 0.1 μg / mL'de Pan-Sitokeratin için Antikor 3 kullanın ve 2.5 μg / mL'de Antikor X için Antikor 7 kullanın. Her bir antikoru belirtilen seyrelticide seyreltin ve yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarını astarlayın.</li>
		<li>Yukarıda belirtilen blokaj, algılama ve amplifikasyon önceden doldurulmuş reaktif dağıtıcılarını toplayın ve bunları bir reaktif tepsisine yerleştirin. Slayt tepsilerine slaytları yükleyin (çalıştırma başına en fazla 30 slayt) ve Çalışıyor'a ve ardından Evet'e tıklayın. DAPI'nin nükleer karşı boyama için kullanılmadığını unutmayın.</li>
		<li>Otomatik boyama yazılımındaki çalışma süresini kontrol ederek çalıştırmanın başlangıcını onaylayın. Protokolün tamamlanması ~ 11 saat sürer ve gece boyunca çalışabilir.</li>
		<li>Ertesi gün, slayt tepsisi yuvalarındaki yeşil yanıp sönen ışıkları gözlemleyerek çalıştırmanın tamamlanmasını sağlayın. Ardından, kızakları cihazdan çıkarın ve sıvı kapak kayma çözeltisi tamamen çıkarılana kadar slaytları 1x Reaksiyon Tamponunda kuvvetlice durulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteomik tahlil için mekansal profilleme platformu protokolü<ol><li>Aşağıdaki notta belirtilen uzamsal proteomik protokolü takip edin. 3-plex otomatik etiketleme prosedürünü etkinleştirmek için protokolde aşağıdaki değişiklikleri ekleyin.</li>
		<li>Uzamsal proteomik protokolüne başlamadan bir gün önce 1.2.1-1.2.6 adımlarını uygulayın ve adım 1.2.6'yı uyguladıktan sonra doğrudan uzamsal proteomik protokolün antijen alma adımına geçin. Uzamsal profil oluşturma proteomik protokolünde özetlenen görselleştirme prosedürünü atlayın.</li>
		<li>Florofor entegrasyonunu sağlamak için SYTO 13'ü 5000 nM'de SYTO 64 ile değiştirin. SYTO 64'ü 1x TBS'de seyreltin ve 15 dakika boyunca bir nem odasında inkübe edin.</li>
		<li>Uzamsal profil oluşturma platformunda tarama parametrelerini ayarlarken, 3 katlı entegrasyona izin vermek için görselleştirme panelinde kullanılan floroforlara göre filtreleri ve odaklama kanallarını seçin. DISCOVERY FAM için FITC kullanın ve pozlamayı 200 ms'ye ayarlayın, DISCOVERY Rhodamine 6G için Cy3 kullanın ve pozlamayı 200 ms'ye ayarlayın, SYTO 64 için Texas Red kullanın ve pozlamayı 50 ms'ye ayarlayın (bunu odak kanalı olarak belirtin) ve son olarak, DISCOVERY Cy5 için Cy5'i kullanın, pozlamayı 200 ms'ye ayarlayın, tıklayın ve değişiklikleri kaydedin. NOT: Uzamsal profil oluşturma proteomik protokolünün ayrıntılı talimatları, resmi web sitesi Destek sekmesinde Dokümantasyon > Kullanım Kılavuzları seçilerek bulunabilir. Burada, Bond RX kullanarak nCounter için protein protokolünü arayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Uzamsal transkriptomik tahliller için ROI seçimi
<ol><li>FFPE hücreli pelet kesitlerini 70 °C'ye ayarlanmış bir fırında 20-60 dakika pişirin. Aşağıdaki notta belirtilen uzamsal profil oluşturma platformu NGS protokolünü izleyin ve 50 μm ve 300 μm boyutlarını seçerek uzamsal profil oluşturma platformundaki slaytları tarayın. Uzamsal transkriptomik testi için aşağıdaki öneri vurgulanmıştır:<ol><li>Kitaplığı hazırlarken, çeşitli YG boyutları seçilmişse, boyut başına bir kitaplık oluşturmak için benzer boyutlardaki YG'leri bir araya getirin. Bu, boyuttan sapma olmadan tüm yatırım getirileri için yeterli sıralama derinliklerinin elde edilmesini sağlamak içindir. NOT: Uzamsal profil oluşturma platformunun ayrıntılı talimatları, resmi web sitesi Destek sekmesinde Dokümantasyon > Kullanım Kılavuzları seçilerek bulunabilir. Burada, Bond RX kullanan NGS uygulamaları için RNA protokolünü arayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
<li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
<li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li>
<li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+pathologists%3A+Protocols%2C+pitfalls%2C+and+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Muñoz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783(2020).</li>
<li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li>
<li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li>
<li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+spatially+defined+immune+%28micro%29landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li>
<li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448(2020).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li>
<li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bulk%2C+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li>
</ol>

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrus ve Sandra Rost, Roche Grubu'nun bir üyesi olan Genentech'in çalışanları ve hissedarlarıdır. Roche'un bir parçası olan diğer şirketler, bu makalede kullanılan reaktifler ve aletler üretmektedir. Ciara Martin, bu makalede kullanılan reaktifleri ve aletleri üreten NanoString Technologies Inc.'in tam zamanlı bir çalışanıdır.

Bugüne kadar, manuel bir protokolde doğrudan konjuge floresan antikorlar en yaygın olarak uzamsal proteomik veya uzamsal transkriptomik tahlilleri için görselleştirme panelleri olarak kullanılmaktadır 9,10. Bununla birlikte, doğrudan konjuge floresan antikorların kullanımı, daha az miktarda belirteçler için zorlayıcı olabilir ve uygun antikorların seçimini sınırlayabilir. Bu protokol, görselleştirme belirteçlerinin etiketlenmesinin, mekansal proteomik tahlilleri ...

Çoklama tekniklerindeki ilerlemeler, tümörlerde mevcut hedefler için daha iyi karakterizasyon araçları sağlamaya devam etmektedir. Tümör mikroçevresi (TME), immün hücrelere sızan tümör hücreleri ve stromadan oluşan karmaşık bir sistemdir ve mekansal bilginin, ilgilenilen biyobelirteçler arasındaki etkileşim mekanizmalarını daha iyi anlamak ve yorumlamak için kritik öneme sahip olduğu1. GeoMx Dijital Uzamsal Profil Oluşturucu (DSP) ve 10x Visium gibi gelişmekte olan tekniklerle, birden fazla hedef uzamsal bağlamlarında aynı anda tespit edilebilir ve ölçülebilir. Doku görselleştirmeyi kolaylaştıran immünofloresan protokollerinin kullanılması, bu teknolojilerin mekansal profilleme yeteneklerini daha da geliştirebilir.
Bu yöntem geliştirme için odaklandığımız Uzamsal Omik teknolojisi, oligonükleotidlerin UV'ye duyarlı bir fotobölünebilir bağlayıcı aracılığıyla antikorlara veya RNA problarına bağlandığı mekansal proteomik ve transkriptomik tahlillerden oluşur. Histolojik slaytlar bu oligo konjuge antikorlar veya problarla etiketlenir ve daha sonra uzamsal profil oluşturma platformunda görüntülenir. Daha sonra, aydınlatma için farklı boyut ve şekillerde ROI'ler seçilir ve fotokparçalanmış oligonükleotidler aspire edilir ve 96 delikli bir plakada toplanır. Fotoyarıklanmış oligonükleotidler, Nanostring nCounter sistemi veya Yeni Nesil Dizileme (NGS)2,3 (Şekil 1)4,5 ile ölçülmek üzere hazırlanmıştır.
Hücre dağılımları dokular içinde değişir ve seçilen belirteçleri ve farklı ROI boyutlarını kullanarak hücrelerin belirli yerlerini karakterize etme yeteneği, doku ortamını tam olarak anlamak ve belirli özellikleri tanımlamak için büyük önem taşır. Burada bahsedilen Uzamsal Omik teknolojisinde, standart görselleştirme protokolü doğrudan konjuge antikorlar kullanır ve manuel bir protokoldür. Tümör ve stroma arasında ayrım yapmak için standart belirteçler panSitokeratin (panCK) ve CD45 6,7'dir, ancak ilgilenilen spesifik hücre popülasyonlarını hedeflemek için ek belirteçler gereklidir. Ayrıca, doğrudan konjuge floresan antikorların kullanımı, antikor seçimini bol miktarda belirteçle sınırlayan amplifikasyondan yoksundur. Ek olarak, manuel analizler otomatik iş akışlarından daha fazla değişkenliğe tabidir8. Bu nedenle, yatırım getirisi seçimi için özelleştirilebilir, otomatikleştirilmiş ve güçlendirilmiş bir görselleştirme protokolüne sahip olmak istenir.
Burada, çalışma, mekansal proteomik tahliller için, TSA teknolojisinin otomatik bir platformda görselleştirme protokolleri için kullanılabileceğini ve bunun sonucunda daha hedefli ve standartlaştırılmış bir tahlil ile sonuçlanabileceğini göstermektedir. Ek olarak, TSA tabanlı analizler, görselleştirme için seçilebilecek hedef aralığını artırarak düşük ifade eden belirteçlerin kullanılmasını sağlar. PanCK, FAP ve Antikor X için 3 pleks testi, sırasıyla tümör ve stroma arasında ayrım yapmak için panCK ve FAP'ın kullanıldığı otomatik bir platform kullanılarak geliştirilmiştir. Antikor X, tümörlerde sıklıkla karşılaşılan stromal bir proteindir, ancak biyolojisi ve anti-tümör bağışıklığı üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Antikor X bakımından zengin alanlarda immün bağlamın karakterize edilmesi, anti-tümör bağışıklığı ve terapötik yanıttaki rolünü ve ayrıca bir ilaç hedefi olarak potansiyelini açıklığa kavuşturabilir.
Özelleştirilmiş otomatik TSA görselleştirme panellerinin mekansal proteomik tahliller için başarılı olduğu kanıtlanırken, bu testlerin mekansal transkriptomik tahliller için uygulanması doğrulanamamıştır. Bu büyük olasılıkla, RNA bütünlüğünü tehlikeye atıyor gibi görünen reaktifler ve otomatik görselleştirme protokolleri için kullanılan protokolden kaynaklanmaktadır. Görselleştirme belirteçleri için otomatik bir etiketleme protokolünün uzamsal proteomik tahliller için kullanılabileceğini, ancak mekansal transkriptomik tahlilleri için kullanılamayacağını kabul etmek, Uzamsal Omik teknolojisi tahlil tasarımları hakkında önemli bir rehberlik sağlar.
Ek olarak, çalışma, uzamsal transkriptomik testinin, çapı 50 μm kadar küçük olan bölgelerdeki veya yaklaşık 15 hücredeki hedeflerin profilini çıkarmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Tahlilin küçük yatırım getirilerindeki transkriptleri de tespit etme yeteneğini test etmek için iki farklı boyutlu yatırım getirisi seçildi. İlgilenilen her bölge için, 1.800 mRNA hedefine karşılık gelen oligolar toplandı ve mekansal profilleme platformu protokolüne göre kütüphaneler haline getirildi. Kütüphaneler ayrı ayrı dizine eklendi, daha sonra havuza alındı ve sıralandı. Bu, hem havuzlama verimliliğinin hem de küçük ROI'lerde spesifik hücre popülasyonlarını tanımlama yeteneğinin değerlendirilmesine izin verdi.
Bu makale, uzamsal proteomik tahliller için, ilgili doku alanlarının sorgulanmasını seçici olarak hedeflemek ve dokunun mekansal ortamını karakterize etmek için belirli belirteçler üzerinde ROI seçimine rehberlik etmek için otomatik bir protokolün kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, spesifik hücre popülasyonlarını tespit etmek ve karakterize etmek için mekansal transkriptomik testler için daha küçük ROI'lerin kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>10x Tris tamponlu salin (TBS)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojileri</td><td>12498S</td><td>DEPC ile arıtılmış suda 1 x TBS'ye seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Antikor X (açıklanmadı)</td><td></td><td></td> <td>antikor gizlilik nedeniyle kör edildi</td></tr><tr><td>DEPC ile muamele edilmiş su</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Başka bir kullanılabilir</td></tr><tr><td>KEŞİF Hücre Koşullandırma (CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>KEŞİF Cy5 Kiti</td><td>Ventana</td><td>760-238</td><td>Cy5</td></tr><tr><td>KEŞİF FAM Kiti</td><td>Ventana</td><td>760-243</td><td>FAM</td></tr><tr><td>KEŞİF Olarak Anılmaz Keçi Ig Bloğu</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>Gt Ig Bloğu Olarak Anılan</td></tr><tr><td>KEŞİF OmniMap Anti-Ms HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>OMap Anti-Ms HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap Anti-Rb</td><td>HRP Ventana</td><td>760-4311</td> <td>olarak anılırOMap anti-Rb HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY Rhodamine 6G Kiti</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>olarak anılır Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Otomatik Slayt Hazırlama Sistemi</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>El yazması FAP</td></tr><tr><td>[EPR20021] Antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab207178</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Dijital Uzamsal Profil Oluşturucu</td><td>NanoString</td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>El yazması üzerinde mekansal profil oluşturma platformu olarak anılır</td></tr><tr><td>Nem odası</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Bir diğeri kullanılabilir</td></tr><tr><td>Pan-Sitokeratin [AE1/AE3] Antikor</td><td>Abcam</td><td>Ab27988</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td>Python İstatistiksel analiz</td></tr><tr><td>Reaksiyon Tamponu (10x)</td><td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>İstatistiksel analiz yazılımı</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>İstatistiksel analiz</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Kazeinli Ventana Antikor Seyreltici</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>El yazması</td></tr> <tr><td>üzerinde belirtilen seyreltici olarak atıfta bulunulmuşturVentana Primer antikor dispenseri</td><td>Ventana</td><td></td><td>Katalog numarası, dispenser numarasına bağlıdır</td></tr></tbody></table>

dokuda protein ve rna ekspresyonunun uzamsal profillemesi: sanal mikrodiseksiyona İnce ayar yapmaya bir yaklaşım

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Çoklama, uzamsal bağlam sağlarken aynı doku üzerindeki birkaç belirtecin değerlendirilmesini sağlar. Uzamsal Omik teknolojileri, sırasıyla foto-bölünebilir oligo etiketli antikorlardan ve problardan yararlanarak hem protein hem de RNA çoklamasına izin verir. Oligolar, altta yatan biyolojiyi aydınlatmak için doku boyunca belirli bölgelerden ayrılır ve nicelleştirilir. Burada, çalışma, mekansal proteomik tahlillerle birlikte ROI seçimini yönlendirmek için otomatik özel antikor görselleştirme protokollerinin kullanılabileceğini göstermektedir. Bu spesifik yöntem, uzamsal transkriptomik tahlillerle kabul edilebilir bir performans göstermedi. Protokol, belirli bir protein hedefinden floresan sinyalini yükseltmek ve aralarından seçim yapabileceğiniz antikor havuzunu artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) kullanarak, otomatik bir platformda belirteç görselleştirmesi için 3 pleks immünofloresan (IF) testinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Görselleştirme protokolü, kalite ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tamamen doğrulanmış bir 3-plex testi kullanılarak otomatikleştirildi. Ek olarak, DAPI'nin SYTO boyaları ile değişimi, mekansal profilleme platformunda TSA tabanlı IF tahlillerinin görüntülenmesine izin vermek için değerlendirilmiştir. Ek olarak, son derece spesifik ilgi alanlarının (örneğin, belirli bir hücre tipi için zenginleştirilmiş alanlar) araştırılmasına izin vermek için mekansal transkriptomik tahlilini kullanarak küçük ROI'leri seçme yeteneğini test ettik. Sırasıyla yaklaşık 15 hücre ve 100 hücreye karşılık gelen 50 μm ve 300 μm çapındaki ROI'ler toplandı. Örnekler kütüphaneler halinde yapıldı ve küçük ROI'lerden ve dokunun profile özgü bölgelerinden gelen sinyalleri tespit etme yeteneğini araştırmak için sıralandı. Uzamsal proteomik teknolojilerinin, yatırım getirisi seçimine rehberlik etmek için otomatik, standartlaştırılmış protokollerden yüksek oranda yararlandığını belirledik. Bu otomatik görselleştirme protokolü uzamsal transkriptomik tahlillerle uyumlu olmasa da, standart manuel görselleştirme protokolü ile belirli hücre popülasyonlarının küçük ROI'lerde bile başarıyla tespit edilebileceğini test edebildik ve doğrulayabildik.

Yatırım getirisi seçimini yönlendirmek için otomatik görselleştirme protokolü Bu yazıda, dokuyu görselleştirmek ve belirli ROI'ları seçmek için otomatik, özel TSA tabanlı bir IF protokolünün kullanımını sunuyoruz. Kontrol dokuları olarak melanom ve insan normal derisini kullanarak görselleştirme paneli gelişimi, epitop stabilite testi, belirteç yoğunluklarının ince ayarlanması ve bir tanesini dışarıda bırakarak kanama değerlendirmesinden oluşuyordu. Antikorların epitop stabilitesinin tekrarlayan elüsy...

Burada, tümör mikro ortamını daha iyi karakterize etmek ve spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamak için Spatial Omics teknolojileri için ilgi çekici bölgelere (ROI'ler) ince ayar yapmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteomik testler için, otomatik özelleştirilmiş protokoller ROI seçimine rehberlik edebilirken, transkriptomik tahliller 50 μm kadar küçük ROI'ler kullanılarak ince ayarlanabilir.

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Bu protokol, dokuların veya hücre popülasyonlarının daha hedefli bir karakterizasyonuna izin veren mekansal omik teknolojiler için ilgi alanlarının seçimine rehberlik etmeye yardımcı olur. Proteomik tahlillerde ROI seçimi için otomatik bir protokol, manuel protokollerden daha sağlam ve tekrarlanabilirdir ve transkriptomik tahliller için 50 mikrometre ROI'lerin kullanılması, spesifik hücre popülasyonlarının profillenmesine izin verir. Floresan görselleştirme antikorlarını uygulamak için otomatik boyayıcıyı programlayarak başlayın.Otomatik boyama yazılımında, ana sayfa düğmesine tıklayın ve Protokoller'i seçin. Ardından Protokoller Oluştur / Düzenle'ye tıklayın ve prosedür olarak RUO Discovery Universal'ı seçin. İlk Sıra'ya tıklayın, ardından Deparafinazasyon'u ve ardından Depar v2'yi seçin.Orta Sıcaklık için 72 santigrat dereceyi seçin, ardından Ön İşlem'e tıklayın ve Hücre Koşullandırma ve CC1 Rezervuarı'nı seçin. Çok Yüksek Sıcaklık için 100 santigrat dereceyi seçin, ardından CC1'e sekiz dakika tıklayın ve CC1 64 dakika seçilene kadar tıklamaya devam edin. İnhibitör'e tıklayın, ardından DISCOVERY İnhibitörü'nü seçin ve Kuluçka Süresi için sekiz dakika seçin.Ardından Antikor'a ve ardından Yüksek Sıcaklık Antikor İnkübasyonu'na tıklayın. Düşük Sıcaklık için 37 santigrat dereceyi seçin. Antikor için, dağıtıcı etiketinden ANTIKOR 6'yı seçin.Artı Kuluçka Süresi için 32 dakika'yı seçin. Çarpan HRP'ye tıklayın ve ardından Çarpan HRP Engelleyicisi'ni seçin. Ardından Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin.Ve Kuluçka Süresi için dört dakika seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap Anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 dakika'yı seçin. Ardından Cy5'e tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için sıfır saat, sekiz dakika seçin.Çift Dizili'ye tıklayın ve Antikor Denatürasyonu'nu seçin. Ardından Antikor Denatüre CC2-1'i seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 santigrat dereceyi seçin. Kuluçka süresinin sekiz dakika olduğundan emin olun.Ardından, DS İnhibitörü'ne tıklayın ve Nötralize Et'i seçin. DS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 santigrat dereceyi seçin. Ardından Antikor'da, dağıtıcı etiketinden ANTİKOR 3'ü seçin.Artı Kuluçka Süresi için 32 dakikayı seçin. DS Multimer HRP'ye tıklayın ve DS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için dört dakika seçin.Ardından, Multimer HRP Reaktifinde OMap anti-Ms HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 dakika'yı seçin. Ardından DS Rhodamine 6G'ye tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için sıfır saat, sekiz dakika seçin. Üçlü Leke'ye tıklayın ve TS Antikor Denatürasyonu'nu seçin, ardından Antikor Denatürasyonu CC2-2'yi seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 santigrat derece'yi seçin.Kuluçka süresinin sekiz dakika olduğundan emin olun. Ardından, TS İnhibitörü'ne tıklayın ve TS Nötralize Et'i seçin. TS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 santigrat dereceyi seçin.Ardından Antikor'da, dağıtıcı etiketinden ANTIKOR 7'yi seçin ve Artı İnkübasyon Süresi için 32 dakika'yı seçin. TS Multimer HRP'ye tıklayın ve TS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için dört dakika seçin.Multimer HRP Reaktifi'nde OMap Anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 dakika'yı seçin. Ardından TS FAM'a tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için sıfır saat, sekiz dakika seçin. Kaydet'e tıklayın ve protokole bir başlık ekleyin.Bir protokol numarası seçin, bir yorum ekleyin ve Etkin'e ve ardından Kaydet'e tıklayın. Satıcı tarafından tedarik edilen formalin sabit parafin gömülü insan dokusu kesitlerini, 20 ila 60 dakika boyunca 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırında pişirin. Slaytlar pişirilirken, otomatik boyama yazılımında Etiket Oluştur'u tıklatarak etiketleri yazdırın.Ardından, Protokoller'e tıklayın, protokol numarasını seçin ve Kapat / Yazdır'a tıklayın. Slayt etiketine ilgili bilgileri ekleyin ve Yazdır'a tıklayın. Kızakları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.Önceden yazdırılmış protokol etiketlerini ilgili slaytlara uygulayın. Yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarına antikor etiket numaralarına göre antikorlar yükleyin. Her bir antikoru belirtilen seyrelticide seyreltin ve yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarını astarlayın.Blokaj, algılama ve amplifikasyon önceden doldurulmuş reaktif dağıtıcılarını toplayın ve bunları cihaz reaktif tepsisine yerleştirin. Slayt çekmecelerine slaytları yükleyin ve Çalışıyor'a ve ardından Evet'e tıklayın. Otomatik boyama yazılımındaki çalışma süresini kontrol ederek çalıştırmanın başlangıcını onaylayın.Ertesi gün, slayt çekmecesi yuvalarındaki yeşil yanıp sönen ışıkları gözlemleyerek çalıştırmanın tamamlanmasını sağlayın. Daha sonra kızakları cihazdan çıkarın ve sıvı kapak kayma çözeltisi tamamen çıkarılana kadar slaytları 1x reaksiyon tamponunda kuvvetlice durulayın. Florofor entegrasyonunu sağlamak için SYTO 13'ü 5.000 nanomolar'da SYTO 64 ile değiştirin.SYTO 64'ü 1x TBS'de seyreltin ve 15 dakika boyunca bir nem odasında inkübe edin. DISCOVERY Fam için FITC'yi kullanın ve pozlamayı 200 milisaniyeye ayarlayın. DISCOVERY Rhodamine 6G için Cy3'ü kullanın ve pozlamayı 200 milisaniyeye ayarlayın.SYTO 64 için Texas Red kullanın ve pozlamayı 50 milisaniyeye ayarlayın. Odak kanalı olarak SYTO 64'ü belirtin ve son olarak DISCOVERY Cy5 için Cy5'i kullanın. Pozlamayı 200 milisaniyeye ayarlayın ve değişiklikleri kaydedin.Formalin sabit parafin gömülü hücre pelet bölümlerini 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırında 20 ila 60 dakika pişirin. Uzamsal profil oluşturma platformundaki slaytları tarayın ve 50 mikrometre ve 300 mikrometre boyutlarını seçin. Otomatik görselleştirme protokolü, komşu kanallardan kanama olmadığını doğrulamak için birini dışarıda bırakma kontrolleri dahil edilerek geliştirilmiştir.Uzamsal proteomik tahlilde yer alan tüm belirteçlerin log 2 ısı haritası, siyah renkli manuel pan-sitokeratin CD 45 protokolünü gri renkteki otomatik 3-plex protokolü ile karşılaştırarak 0.88'lik bir Spearman R değeri göstermektedir. Tahlillerde kullanılan 31 antikordan 23 antikorun Spearman R değeri 0.5'ten yüksek veya ona eşitti. Uzamsal transkriptomik tahlilde yer alan seçilmiş hedeflerin log 2 ısı haritası, siyah renkte manuel pan-sitokeratin CD 45 protokolünü gri renkte 3-plex otomatik protokolle karşılaştırarak bu değerlerde farklılıklar göstermiştir.3-plex otomatik görselleştirme protokolü için sıralama verileri, pan-sitokeratin CD 45 manuel görselleştirme protokolüne kıyasla daha düşük değerler sundu ve bu da 0.15'lik düşük Spearman R değerleri tarafından da yansıtıldı. Ayrıca, 3-plex görselleştirme otomatik protokolü kullanılırken dinamik aralık kaybı gözlendi. Mekansal transkriptomik protokolünde küçük ROI'lerin tespiti, 50 mikrometrede dairesel ilgi bölgelerinin seçilmesiyle gerçekleştirildi ve farklı hücre hatlarında seçilen hedefler için 300 mikrometre çapında RNA sayımları, normalleştirmeden sonra ilgi büyüklüklerinin iki bölgesi arasında karşılaştırılabilirdi.Otomatik görselleştirme panelleri için bu protokol, mekansal proteomik sorularını cevaplamak için yatırım getirilerini tam olarak tanımlayan paneller geliştirmek için belirteçleri değiştirerek araştırmacılar tarafından uyarlanabilir.

spatial-profiling-protein-rna-expression-tissue-an-approach-to-fine

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Lazer mikrodiseksiyon Drosophila kanat diskin belirli bölümlerinde lokalize RNAi tabi gen ekspresyonu analiz etmek için...

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Bu makale, doku mimarisini korurken çeşitli transkriptomların yüksek çözünürlüklü haritalanmasını sağlayan Stereo-seq kullanarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümlerinden konakçı, viral, fungal ve mikrobiyom RNA'sının kapsamlı uzamsal transkriptomik profilini çıkarmak için bir protokol sunmaktadır.

Stereo-seq ile Türden Bağımsız Transkriptomların Kapsamlı Uzamsal Profili

Bu protokol, kalsifikasyon olmuş damar örnekleri için adım adım bir iş akışı içerir: doku işleme, kalsifikasyon giderilmesi, RNA doğrulama, kalsifikasyon seviyesi tespiti ve Nanostring GeoMx Dijital Mekansal Profiler (DSP) üzerinde ilgi alanı seçim stratejileri. Amaç, güvenilir mekansal transkriptomik analiz için damar dokusu morfolojisi ve RNA'nın korunmasına yönelik kapsamlı bir yöntem sunmaktır.

Dijital Mekansal Profilleme için Korunmuş Morfoloji ve RNA ile Kalsifikasyon Arter Hazırlanması ve İşleme

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Morfolojik bilgi aynı zamanda gerekli olduğunda şu anda, immünfloresan sabit hücreleri üzerinde boyama seçim protein ifade düzeyleri tespiti için yöntemidir. Burada sunulan bu protokolü parafin gömülü hücre bloklar immunocytochemistry alternatif bir yöntem sağlar.

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Aşağıdaki prosedür, genetik olarak tasarlanan bir fare modelini kullanarak, murine dorsal deride melansitik tümör başlamasını uzamsal ve temporal kontrol etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol makroskopik ve mikroskopik kutanöz Melanom inisiyasyonu açıklanmaktadır.

Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

Keşfedin, uzamsal omik teknolojilerinde ilgi bölgelerinin otomatik seçimiyle doku ve hücre popülasyonlarının hedeflenmiş karakterizasyonunu. Bu yöntem, proteomik ve transkriptomik analizlerde sağlamlığı ve tekrarlanabilirliği artırır.

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Daha fazla video keşfet