Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Bu yöntem, farklı konformatörler veya varyantlar dahil olmak üzere birlikte var olan protein türlerinin ayrılmasını ve daha yüksek dereceli yapı farklılıklarının çevrimiçi karakterizasyonunun tek bir CEMS ölçümünde tamamlanmasını sağlar. HDX reaksiyonları için yaklaşık% 100 süreli bir ortam sağlamak için elektroforetik etkiyi ve yukarıdan aşağıya MS analizi için HDX sırasında birlikte var olan protein türlerinin ortogonal olarak ayrılmasını sağlar. Kılcal elektroforez, hidrojen döteryum değişimi veya CE HDX kurulumunun ön koşullandırılması ile başlayın.

% 50 metanol,% 49 su ve% 1 formik asit karışımında ultrasonikasyon kullanarak, oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca mikroftek CE-MS arayüzünden akışı temizleyin. HPC modifiye kılcal damarı kılcal elektroferez veya CE aleti üzerine monte edin. Otomatik numune alma cihazını kullanarak kılcal damarı arka plan elektrolit çözeltisi veya BGE ile 10 dakika durulayın ve BGE ile dolu bırakın.

Modifiye edici çözelti için infüzyon borusu olarak uygun uzunlukta değiştirilmemiş kaynaşmış silika kılcal boru kullanın. Modifiye edici boruyu künt bir sıcaklığa sahip gaz geçirmez bir cam şırıngaya bağlamak için bir birleştirici ve uygun manşon kullanın ve bir infüzyon pompası kullanarak tüpü değiştirici çözelti ile en az 10 dakika durulayın. İlgili çözeltilerle yüklenen HPC kodlu CE kılcal damar ve değiştirici borunun çıkışlarını temizlenmiş CE-MS arayüzüne yerleştirin.

Şırıngayı infüzyon pompalarıyla ilerletin, böylece değiştirici çözelti arayüzün ucuna ulaşır. Birleştirilmiş CE-MS arayüzünü, bir kütle spektrometresinin nano elektron sprey iyonizasyon kaynağı muhafazasına monte edin. CE-MS arayüzüne 3-5 kilovoltluk bir püskürtme voltajı uygulayın.

Değiştirici çözeltiyi demlik pompası ile dakikada 0,1-10 mikrolitre arasında değişen bir akış hızında demleyin ve CE-MS arayüzünün ucunda kararlı bir elektro sprey sağlayın. BGE ve otomatik numune alma işlemini içeren numune şişesini yerleştirin, bunlar daha sonra boş elektroferogramlar ve boş kütle spektrumları elde etmek için kullanılacaktır. Enjeksiyon hacmi ve enjeksiyon parametreleri arasındaki ilişkiyi kullanarak enjeksiyon hacmini tahmin edin.

Ve iki PSI’daki otomatik örnekleyiciyi kullanarak numune çözeltisini uygun bir süre boyunca enjekte edin. CE ayrımını, 0-2 PSI arasında değişen bir infüzyon basıncına 20 kilovoltluk bir elektroforetik voltaj uygulayarak başlatın ve elektroferogramı edinin. Bu arada, MS verilerini, iyon akım grafiğinin zamanın bir fonksiyonu olarak alındığı ve karşılık gelen MS taramalarının otomatik olarak tek bir spektrumda birleştirilmediği kromatografik modda elde edin.

Boş elektroferogramı ve kütle spektrumlarını referans olarak kaydedin. Protein numune çözeltilerinin istenen konsantrasyonlarını içeren numune şişelerini otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve elektroforetik olarak ayrılmış ve döteryum etiketli protein türlerinin elektroferogramlarını ve MS1 spektrumlarını elde edin. MS1 spektrumlarını aynı çalıştırmada edindikten sonra veya sonraki ayrı bir çalıştırmada ilgilenilen türler için tandem Ms.ölçümleri gerçekleştirin.

Her ölçümden sonra, kılcal damarı BGE ile en az 10 dakika boyunca 20 PSI basınçta yıkayın. Deneylerin tamamlanmasının ardından CEMS arayüzünü ve tüm boruları depolama için temizleyin. Doğrudan infüzyon modunda MS ile HDX uç nokta örneğinin bir veri kümesini edinin.

Düşük infüzyon basıncı, CE zirvelerinin daha iyi ayrılmasına neden oldu, ancak hem göç süresinde hem de deneyin süresinde bir artışa neden oldu. Daha uzun bir HDX reaksiyon süresi, protein analitlerinin daha yüksek düzeyde dedurmasına neden oldu. Beta immünoglobulin veya beta IG’nin A ve B varyansı, dizilimlerinde sadece iki amino asit kalıntısı ile farklılık gösterir, EIC türevi elektroferogramda yeterince ayrılmış iki pike yol açmıştır.

Diferansiyel döteryum etiketli varyans, iyonların farklı bir kütle dağılımı ile sonuçlandı. CS 82 ve CS 176 arasındaki parçalanma verimliliğini sınırlayan beta IG’nin doğrulanmasındaki benzersiz disofied bağlantı nedeniyle Z iyonlarının göreceli bolluğunda C iyonlarından daha düşük bir sayı gözlenmiştir. Beta IGA ve beta IGB’den üretilen fragman iyonlarının çoğu, benzer miktarda döteryum alımı sergiler.

Bununla birlikte, beta IGA’dan dizi varyasyon bölgelerini kapsayan daha büyük segmentler, beta IGB’den önemli ölçüde daha fazla çıkarılmıştır. BGE’nin pH’ı, protein birikimini önlemek ve kompleksi korurken ayırmayı kolaylaştırmak için numunenin izoelektrik noktasına göre ayarlanır.